单个核细胞分离
单个细胞分离技术PBMC
活细胞数(N)
细胞存活率 =
×100%
活细胞数+死细胞数
200
例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。
T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。 E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%80% 由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显 结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周 围，形 成花瓣 样排列 称为E花 环实验。
▲ 血细胞计数池的构造
1. 大方格 9个
2. 中方格分2种
3. WBC计数区分 16个
பைடு நூலகம்4. RBC计数区分 25个
5. 3.小方格1种，
6. 是指RBC计数 区
7. 的1个中方格又 分
8. 16个小方格， 即：
9. 计数池内有：1
血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积）
计数池区域 边长（mm） 面积（mm2） 池深（mm） 体积（mm3 ul）
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
外周血单个核细胞
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：
血细胞寿命
1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再
释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。白细胞的平均寿命很短，约7-14天。粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。单核细胞放入血液，在血中停留3－6天，即进入组织演变为巨噬细胞寿命可达2－3个月。
ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理
ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理
一、前言
外周血单个核细胞是指没有细胞核的血细胞，如红细胞、血小板等。
分离外周血单个核细胞是许多实验室和临床诊断中常用的一项操作。
而ficoll分离液则是分离外周血单个核细胞时常用的一种试剂。
本文将详细介绍ficoll分离液的原理及其在分离外周血单个核细胞中的应用。
二、ficoll分离液
1. 概述
ficoll分离液是由Ficoll（Ficoll-400）和盐水（PBS或Hanks平衡盐溶液）组成的一种密度梯度试剂。它主要用于体外培养、淋巴细胞和
其他白细胞的分离。
2. 原理
ficoll分离液利用了不同密度的细胞在密度梯度中沉降速度不同的原理。
在密度梯度中，密度大的物质沉降速度快，而密度小的物质沉降速度慢。
当样品加入到ficoll分离液中时，样品中含有不同密度的各种成分，如红细胞、白细胞、淋巴细胞等。这些成分会在密度梯度中沉降，最终形成一个由不同密度的层次组成的梯度。在ficoll分离液中，Ficoll-400的密度大于外周血单个核细胞，但小于红细胞和粒细胞。
当样品经过离心后，外周血单个核细胞会沉降到ficoll分离液中的某一层次中，并被分离出来。而其他成分则会沉降到不同的层次中。
3. 优点
ficoll分离液具有以下优点：
（1）样品处理方便：只需要将样品加入到ficoll分离液中进行离心即可。
（2）操作简单：只需要进行一次离心即可将外周血单个核细胞从其他成分中分离出来。
（3）高效：能够快速、高效地将外周血单个核细胞分离出来。
三、操作原理
1. 实验材料
单个核细胞分离-冻存及复苏
1、外周血单个核细胞Ficoll分离：
向Ficoll分层液离心管中加入稀释的血液样本，1500rpm，5min离心机离心；
i
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中，将所得的单个核细胞悬液用5倍体积的Hanks 液或RPMI-1640洗涤2次，1500rpm，5min；
用细胞计数仪或血球计数板计数细胞，调整细胞至所需浓度；
淋巴细胞浓度浓度（细胞数/mL）=四个大方格内细胞数/4×104
2、细胞冻存：
（1）配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
（2）取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；
（3）离心1000rpm，5min；
（4）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
（5）将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
（6）在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-80℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
3、细胞复苏：
（1）从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
（2）从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
全文共四篇示例，供读者参考
第一篇示例：
人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集
1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离
1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存
1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法主要包括以下步骤：
1. 酶解：使用胶原酶和胰蛋白酶等酶将组织样本消化，将细胞间的连接分解，使细胞分散成单个细胞。
2. 离心：通过离心将单个细胞收集到管底部，形成细胞沉淀。
3. 洗涤：去除细胞沉淀中的组织残留物和杂质。
4. 重悬浮：将单个细胞重新悬浮在适量的缓冲液中，以便后续处理。
5. 过滤：通过过滤膜或滤器将细胞核与其他细胞成分分离，收集细胞核。
需要注意的是，上述步骤仅为一种参考方法，实际操作可能因实验条件、样本类型等因素而有所不同。因此，在进行单细胞测序实验前，请详细阅读相关文献，了解并优化适合自己实验的细胞核分离和纯化方法。同时，务必遵循实验室安全规范，确保实验过程的安全性。
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。
方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。
3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。
4.以 400g 的速度离心 40 分钟。在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。
5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。
6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。
磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。
3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。
4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。
5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。
密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。
密度梯度离心法分离血液单个核细胞
密度梯度离心法分离血液单个核细胞
14级拔尖赵子杰 141270054
一．实验目的
1.掌握密度梯度离心法。
2.进一步熟练显微镜的细胞观察方法。
二．实验原理
1.血液单个核细胞分离原理
外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
图1：血细胞分类
当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
图2：分离液分离原理
2.显微镜操作技巧
（1）旋转物镜转换器到10×物镜，先将粗调焦螺旋外旋，使标本升至最高点。（2）一边用眼睛通过目镜观测标本，一边逐渐向内旋转粗调焦螺旋，直至视
野中出现晃动的液体，观测细胞即在其中。（3）如视野中细胞太小，转换物镜至40×高倍镜，一般稍微向外旋转微调焦螺旋即可看到清晰的物像。
三．实验器材
1.肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
单细胞测序的细胞核分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核分离和纯化方法
单细胞测序是一种研究细胞生物学的重要技术，它能够揭示单个细胞在基因表达和功能方面的异质性。在进行单细胞测序之前，对细胞核进行有效的分离和纯化是至关重要的。本文将详细介绍单细胞测序中细胞核的分离和纯化方法。
一、细胞核分离方法
1.酶解法：酶解法是利用特定的酶分解细胞膜和细胞器，从而释放细胞核。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶和分散酶等。这种方法适用于原代细胞和传代细胞的核分离。
2.离心法：离心法是通过高速离心将细胞核与其他细胞组分分离。根据离心力的不同，可以将细胞核与其他细胞组分分开。此方法操作简便，适用于各种类型的细胞。
3.过滤法：过滤法是将细胞悬液通过特定孔径的滤器，使细胞核被截留在滤器上，而其他细胞组分通过滤器。这种方法适用于较大细胞的核分离。
二、细胞核纯化方法
1.核酸染料染色法：利用核酸染料（如碘化丙啶）对细胞核进行染色，使细胞核显色，从而与其他细胞组分区分。此方法操作简单，但纯度较低。
2.免疫磁珠法：利用特异性抗体与细胞核表面抗原结合，然后通过磁珠分离技术将细胞核与其他细胞组分分离。此方法纯度较高，但操作复杂。
3.柱层析法：柱层析法是将细胞悬液通过特定柱子，利用柱子上吸附的分子与细胞核结合，从而将细胞核与其他细胞组分分离。此方法纯度较高，操作相对简单。
综上所述，单细胞测序中的细胞核分离和纯化方法有多种，不同的方法适用于不同类型的细胞。在实际应用中，需要根据实验目的和细胞特性选择合适的分离和纯化方法。同时，为了获得高质量的单细胞测序结果，还需注意实验操作的严谨性和数据分析的准确性。
实验三外周血单个核细胞分离
实验目的
掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作 掌握外周血单个核细胞的概念
实验原理
人外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴细胞 和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周 血其他细胞不同。因此利用一种介于 1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺 （ficoll-hypaque）分离液作密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中呈梯度分布,从而分离出PBMC。
实验三实验三外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离实验目的实验目的??掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作掌握外周血单个核细胞的概念??掌握外周血单个核细胞的概念实验原理实验原理人外周血单个核细胞人外周血单个核细胞peripheralperipheralbloodmononuclearmononuclearcellpbmcpbmc包括淋巴细胞包括淋巴细胞pbmcpbmc包括淋巴细胞包括淋巴细胞和单核细胞和单核细胞
人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
实验步骤
1.用抗凝管抽取外周血2ml； 2.wk.baidu.com装有2ml分离液的试管微微倾斜，用吸管
标准操作规程(SOP)——外周血单个核细胞分离
一、目的
外周血单个核细胞主要由单核细胞和淋巴细胞组成，是机体重要的免疫细胞，外周血单个核细胞的分离是免疫学研究的最基础实验方法之一。
二、范围
适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行外周血单个核细胞的分离操作。
三、定义
指从全血中分离外周血单个核细胞（PBMC, Peripheral Blood Monouclear Cells ）相关实验技术的操作。
四、程序
（一）生物安全要求
疑似人禽流感病例、急性期人禽流感病例在BSL-3实验室进行。 普通流感病例在BSL-2实验室进行。
正常健康对照血样可在BSL-2实验室进行。
（二）材料
1．R0：无菌RPMI 1640培养液：
500mL RPMI 1640
5mL 青链霉素（10000U/mL ）
2．R2：含2％胎牛血清无菌RPMI 1640培养液：
500mL RPMI 1640
5mL 青链霉素（10000U/mL ）
10mL 胎牛血清
3．R10：含10％胎牛血清无菌RPMI 1640培养液：
标准操作规程（SOP ）——
细胞分离
500mL RPMI 1640
5mL 青链霉素（10000U/mL）
50mL 胎牛血清
4．R20：含20％胎牛血清无菌RPMI 1640培养液：
500mL RPMI 1640
5mL L-谷氨酰氨
5mL 青链霉素（10000U/mL）
100mL 胎牛血清
5．PBS（pH7.4）
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.15g
KH2PO4 0.2g
dH2O 定容至1000mL
6．50mL或15mL无菌离心管，加入无菌淋巴细胞分离液后作为分血管。（根据采血量，10mL血以下可用15mL离心管）
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离
(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)
免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】
血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】
1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】
1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。
实验六_外周血单个核细胞的分离
1.外周血单个核细胞的分离 2.E－花环形成实验 3.淋巴细胞转化实验
实验原理：
1.密度梯度离心法
外周血
淋巴细胞分离液
血浆层 淋巴细胞 单核细胞 1.070g/l
离心
分离液 (1.077±0.002g/l) 粒细胞和红细胞 (1.092g/l)
2.淋巴细胞分离液：聚蔗糖-泛影葡胺
弃上清，加入2ml Hank’s液
细胞计数
百度文库
血加入到分离液的上层
离心后的单个核细胞层
注意
• 无菌操作. • 注意血制品污染. • 控制操作时间，保持细胞存活.
• 应用水平离心机.
E-花环形成实验
SRBC
CD2
T
B
• 利用红细胞的吸附作用，以红细胞为指示细胞， 检测外周血中T细胞的数量以及所占比例的一种免 疫吸附实验。
实验方法： 抽取1.5ml静脉血至肝素抗凝管，加入1.5ml Hank’s液
混匀
取3ml稀释血，yiye沿试管壁缓慢加入到 2ml分离液中
2000rpm，离心20min 小心吸取淋巴细胞层，加入2ml Hank’s液 2000rpm，离心10min
弃上清，加入2ml Hank’s液
2000rpm，离心10min
结果
E-花环形成率
形成花环的淋巴细胞数
=
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。它
们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。因此，从外周
血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。本文将介绍几种常用
的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心
梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细
胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。以下是具体步骤：
1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤
细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心
另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。以下是具体步骤：
1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗
单个核细胞分离.
Separation of Mononuclear Cells from
Whole Peripheral Blood
外周血单个核细胞分离
Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation
聚蔗糖—泛影葡胺分层液密度梯度离心法【Materials】
(1)Lymphocyte Separation Medium:
specific gravity 1.077±0.001g/L
淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.001g/L）
(2) 2％trypan blue solution
2％台盼蓝染液
(3) Hank’s balanced salt solution (HBSS) or RPMI-1640 medium
Hank’s液或者RPMI-1640培养基
【Methods】
(1) Drawing 2ml blood from main vein and mixing with 0.1 ml
Heparin solution in a tube.
采集静脉血2ml注入盛有0.1ml肝素的试管中，混匀。
(2) Dilute the whole blood with an equal volume of Hank’s
balanced salt solution (HBSS)
加入等体积HBSS或PBS等倍稀释血液。
(3) Pipette 2ml lymphocyte separation medium into a centrifuge
tube. Then, add the diluted blood sample carefully by flowing along the side of the tube on the LSM. The interface must be clear.
外周血单个核细胞的分离注意事项
外周血单个核细胞的分离注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是常见的实验材料，在许多免疫学、细胞生物学等实验中扮演着重要的角色。然而，PBMCs分离过程中存在许多注意事项。本文将从实验前准备、样本处理及分离步骤中列举几点需要注意的事项。
1. 实验前准备
安全标准
PBMCs的分离涉及血液样本采集和处理，需要保证操作人员的安全，防止血液污染。为此，实验前需要使用防护手套、口罩、护目镜等器材，并制定相关血液样本处理的实验室安全操作规范。
试剂采购
PBMCs分离需要许多慢速离心管、离心机、PBS等试剂，需要提前预置备足够的试剂和设备。
2. 样本处理
血液处理
PBMCs分离需要血液样本。在血样提取过程中需要注意消毒操作，以
及遵循血样相关的法律法规，根据实验需要动物实验和人类样本需要进行严格的伦理、道德审查手续。
推迟凝固
血液采样后需要将血液样本尽快抽入慢速离心管中，加入分离液等样品处理操作。尽可能的避免血液凝固、变质，以保证分离的单核细胞数量和质量。
3. 分离步骤
慢速离心
PBMCs分离需要慢速离心。慢速离心的转速和时间是影响分离效果的重要因素。理论上，慢速离心时间越长，分离效果越好，但是过长的离心时间会影响细胞的活性。合适的离心强度和离心时间是需要事先确定的。
分离液制备
PBMCs分离的关键是分离液制备。分离液的配方、pH值、浓度等是影响单核细胞分离效果的关键因素。不同样本需要不同的分离液组合。为了保证分离效果，同时避免细胞受损，可以在实验前进行样品处理的优化。
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淋巴细胞分离及检测技术
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
免疫细胞的分离
——免疫细胞的分离原理及方法
免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关 的所有细胞的总称。
— Mononuclear phagocyte system
Monocyte Macrophage Dendritic Cells
—
Granulocytes
细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
Ficoll密度梯度离心法
比重：1.070
比重：1.077
Ficoll
比重：1.092
实验材料
分组：两人一组 器材 滴管 EP管 计数板 数量 2支/2人 1个/2人 1块/2人 试剂 分层液 血液 PBS 计数液 数量 0.5ml /2人 1ml /2人 1瓶/4人 1管/4人
（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
免疫细胞的功能检测
——功能检测的原理及方法
免疫细胞功能检测的意义
免疫系统或其他系统的疾病，免疫接 种，某些临床措施或外界环境的影响，均 可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对 于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、 预防接种的效果评估及环境因素对机体免 疫功能影响的判定，都具有重要意义。
APAAP法: APAAP复合物
兔抗鼠IgG
T细胞 McAb
(三)荧光激活细胞分类仪(FACS)检测T细 胞亚群
FACS是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器,其操作程 序在无菌条件下进行,不影响细胞活性,所以分离、收集的细胞可 继续其他细胞功能的研究。
2007级五年制本科生
免疫学实验课
杨 巍
第四次实验课
人外周血单个核细胞分离
实验内容
人外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离与检测技术（讲解）
实验目的
掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或
组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
葡萄球菌…
胃蛋白酶… 抗CD3、CD4抗体…
淋巴细胞转化试验的检测方法
(一)形态学方法
淋巴细胞→淋巴母细胞→染色镜检
(二) 3H﹣TdR掺入法
有丝裂原或抗原→淋巴细胞→染色体复制 →3H﹣TdR掺入 →淋巴细胞摄取→测定放射量
(三) MTT比色法
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淋巴细胞亚群检测的方法
（T细胞和B细胞检测方法相同,现以T细胞为例进行讲解.）
（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 单个核 —— PBMC 血中的细胞
• 无核 —— 红细胞 • 多核 —— 多核白细胞
密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液 比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
离心前示意图
稀释的抗凝血
Ficoll分离液
（1）尼龙毛柱法 ** 原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏 附性的T细胞。 （2）E花环分离法 * 原理：人成熟T细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受 体（E受体），可结合绵羊红细胞形成E花环，比重 增大，沉于管底。 （3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法
E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细胞。
(一)免疫荧光法
(二)免疫酶标法
(三)荧光激活细胞分类仪检测T细胞亚群
(一)免疫荧光法
直接法:荧光素→单克窿抗体→淋巴细胞
间接法:荧光素→第二抗体(羊或兔的抗鼠IgG) →McAb介导→淋巴细胞
(二)免疫酶标法
ABC法:亲和素＋酶标生物素→复合物→生物素化的二抗→McAb介 导和酶催化底物作用→T细胞着色
原理:绵羊红细胞→T细胞→形如花环，比重变大，离心 沉淀
B细胞膜免疫球蛋白检测
原理：荧光素→抗Ig特异性抗体→B细胞表面膜 免疫球蛋白(mIg)
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二. 免疫细胞的功能检测
淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。
非特异性:有丝分裂原 PHA、ConA…
微生物及其代谢产物
刺激物 蛋白物质 抗体 淋巴因子 特异性：特异性抗原物质
免疫细胞检测的分类
一、免疫细胞的数量检测
二、免疫细胞的功能检测
免疫细胞自发增殖活性测定
免疫细胞增殖检测
淋巴细胞增殖检测
一. 免疫细胞的数量检测
检查的项目有：血中T细胞与B细胞的分类计数
血液白细胞的计数 血液中白细胞的分类计数
实验方法
｛
E玫瑰花环实验(检测T细胞)
B细胞膜免疫球蛋白检测
E玫瑰花环实验
离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
2、T、B淋巴细胞的分离纯化
（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）
5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。
（NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以 上为淋巴细胞，部分是单核细胞）
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
Neutrophils Basophils Eosinophils T lymphocyte B lymphocyte NK (Natural killer cells)
—
Lymphocytes
直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞
免疫细胞的分离
一. 外周血单个核细胞（PMBC）分离
1ml刻度吸管 1支/4人 加样器(tip) 1把/4人 显微镜 1台/2人
实验步骤
1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)
NOTE：不要打破血液与分层液的界面；
2. 分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层; 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞， 放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次， 4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清； 4. 计数：用500ul PBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。
根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考
虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。
Fra Baidu bibliotek红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴
二. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯化淋巴细胞亚群）
E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术
免疫细胞分离的依据
1. 2. 3. 4. 细胞膜脆性：低渗液分离 细胞密度：密度梯度离心法 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛