单个核细胞分离
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
单个核细胞的分离
单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
外周血单个核细胞分离实验报告
外周血单个核细胞分离实验报告引言外周血单个核细胞是指在外周血中富含的一类细胞，其细胞核不与胞质分离，与常见的多核细胞不同。
研究外周血单个核细胞的分离方法对于深入了解这一类特殊细胞的结构和功能具有重要意义。
本实验旨在探究一种高效、可靠的外周血单个核细胞分离方法。
材料与方法实验材料•鲜活外周血样本•离心管•PBS缓冲液•Ficoll介质实验步骤1.将外周血样本收集于离心管中。
2.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，使样本与缓冲液的比例为1:1。
3.用低速离心的方法，离心管在1000g条件下离心10分钟，以分离外周血细胞。
4.将上清液转移至新的离心管中，避免携带红细胞。
5.加入相应体积的PBS缓冲液至离心管中，重新悬浮外周血细胞。
6.向离心管中加入Ficoll介质，使样本与介质的比例为1:2。
7.用高速离心的方法，离心管在2500g条件下离心15分钟，以分离外周血单个核细胞。
8.转移到新的离心管中，获取纯化的外周血单个核细胞。
结果与讨论实验结果通过以上实验步骤，我们成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
经过染色处理后，我们观察到这些细胞的细胞核形态正常，大小均一，未出现明显的核碎片。
这表明我们采用的分离方法在维持细胞完整性的同时有效地分离了外周血单个核细胞。
结果分析外周血单个核细胞的分离方法是一个关键的环节，本实验中采用的离心和Ficoll介质的组合分离方法是一种经典的操作流程。
离心的低速步骤旨在分离外周血中的核细胞和血小板，而高速离心则能够有效分离核细胞和红细胞等细胞成分。
Ficoll 介质则起到了调节比重、减缓细胞沉降速度的作用，从而实现了外周血单个核细胞的高效分离。
通过优化分离方法，我们能够获得更纯的外周血单个核细胞样本，为后续的实验研究提供可靠的基础。
同时，我们也可以通过进一步的实验，探究这些细胞的特性和功能，为相关疾病的研究提供重要的支持。
结论本实验采用离心和Ficoll介质的组合分离方法，成功地分离出了纯化的外周血单个核细胞。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核的分离和纯化方法包括以下步骤：
1. 酶解：使用胶原酶和胰蛋白酶等酶将组织样本消化，将细胞间的连接分解，使细胞分散成单个细胞。
2. 离心：通过离心将单个细胞收集到管底部，形成细胞沉淀。
3. 洗涤：去除细胞沉淀中的组织残留物和杂质。
4. 重悬浮：将单个细胞重新悬浮在适量的缓冲液中，以便后续处理。
5. 过滤：通过过滤膜或滤器将细胞核与其他细胞成分分离，收集细胞核。
6. 纯化：利用不同细胞核的特征差异，使用离心、磁珠、荧光染色等方法将细胞核进行分离和纯化。
7. 计数：对纯化后的细胞核进行计数，确保数量足够进行后续的单细胞测序。
需要注意的是，具体的分离和纯化方法会根据不同的组织和细胞类型而有所差异，可以查阅相关的实验指南或与专业的实验室研究人员咨询了解更多详细的信息。
单个核细胞分离试验
1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。
（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。
（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。
离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。
（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。
再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。
4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。
之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。
单个核细胞分离
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Ficoll密度梯度离心法
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴 细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液
比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
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离心前示意图
稀释的抗凝血 Ficoll分离液
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离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
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E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细 胞。
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（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
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（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法1. 引言大家好，今天咱们聊聊一个有点“高大上”的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
别担心，听起来复杂，但其实就像是把水果分开一样，方法有点多，但都不是很难。
首先，单个核细胞是什么呢？简单来说，它们是血液里的小战士，负责咱们身体的免疫系统工作。
而把这些小战士从血液中分离出来，是为了让我们能更好地研究它们，或者用于治疗各种病症。
现在，让我们一起来看看，这个过程到底怎么做吧！2. 准备工作2.1 收集血液样本首先，得从患者或志愿者那里收集血液。
想象一下，这就像是收集原材料一样。
我们一般用专门的血液收集管，这些管子里有点抗凝剂，防止血液在管子里凝固。
这个步骤就像是给血液穿上“防寒衣”，确保它们不会在实验室里冻住。
血液收集后，我们需要立即将其送到实验室，因为血液可不像冰淇淋那样能在冰箱里存放很久。
2.2 准备离心机接下来，我们用离心机来分离这些细胞。
离心机是一种可以快速旋转的机器，通过离心力把血液中的不同成分分开。
这个过程就像是在一个大旋转舞台上，血液里的各种“演员”根据他们的“舞姿”被分到不同的区域。
大家可以把离心机想象成一个超级有力的“旋转木马”，它能把血液中的细胞按类型分类开来。
3. 分离过程3.1 使用密度梯度离心法密度梯度离心法是我们分离单个核细胞的绝招之一。
我们在试管里加入一个特殊的液体，这个液体的密度不同层次逐渐增加，形成一个梯度。
然后把血液样本倒进去，接着用离心机旋转。
这就像是给试管里制造了一条“滑梯”，细胞们就沿着这个“滑梯”滑到它们各自的位置。
单个核细胞会在某一层次上停下来，其他细胞则会分布在不同的层次上。
3.2 清洗与收集当我们分离好细胞后，下一步就是清洗和收集。
用生理盐水或者其他洗涤液把细胞洗干净，去掉多余的杂质。
这个过程就像是给细胞洗个澡，确保它们干干净净，然后我们把这些清洗好的细胞取出来。
然后就可以把这些细胞用于各种研究或治疗了。
4. 结束语好了，今天的分享就到这里。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法哎呀，朋友们，今天咱们聊聊一个特别有意思的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
你可能会问，啥玩意儿？简单来说，就是从咱们的血液里找出一种特别的细胞。
想象一下，这就像在一个巨大的水果市场里，找出你最爱的苹果那样。
1. 什么是外周血单个核细胞？1.1 首先，得跟你解释一下这东西。
外周血单个核细胞，顾名思义，就是咱们血液里的一种细胞，单核的，也就是没有太多复杂的结构。
这些细胞可是咱们身体的宝贝儿，它们能做很多重要的工作，比如免疫应答啊、修复组织啊，所以咱们得小心翼翼地对待它们。
1.2 好了，听上去有点复杂，其实操作起来也没那么难。
咱们只需要用一些科学的工具和方法，就能把这些细胞从血液里分离出来。
这个过程不仅能帮助研究人员更好地了解身体的各种反应，还能在医学上发挥大作用呢。
2. 如何进行分离？2.1 让咱们来聊聊具体的操作步骤吧。
首先，得抽取血液。
哎，这步最让人感到心慌，想象一下那根针头，还是尽量别多想了。
不过别担心，这步过了之后，就进入了最有趣的环节——分离。
血液被抽出来之后，就像把你最喜欢的食材从锅里捞出来一样，要把那些外周血单个核细胞找出来。
2.2 这个过程主要用到的工具叫做离心机。
离心机就像一个超级旋转的机器，把血液转得飞快。
在这高速旋转的过程中，血液里的各种成分会被分离开来，就像咱们在清理菜市场时，把苹果和香蕉分开一样。
离心之后，血液中的细胞就会被分成几层，最上面一层就是咱们的目标——外周血单个核细胞。
2.3 之后，拿到这些细胞，就得用到一些特殊的试剂进行进一步处理。
想象一下，你拿到了一大袋苹果，接下来要把它们洗净、切片，这样才行。
细胞也是一样，需要经过处理和清洗，才能保证它们的纯净和活力。
3. 实际应用3.1 分离出来的外周血单个核细胞可是用途广泛。
比如说，它们在医学研究中，能帮助科学家们了解各种疾病的成因，还能用来开发新的治疗方法。
就像你买了一台新玩具，得先拆开看看里面的零件一样，这些细胞就是研究中的“零件”，帮助咱们了解身体的奥秘。
分离外周血单个核细胞的方法
分离外周血单个核细胞的方法分离外周血单个核细胞的方法其实没那么复杂，咱们来聊聊这个话题，保证让你轻松get！首先啊，单个核细胞就是我们血液中那些小家伙，像是白血球、淋巴细胞等等，它们可不是闲人，背后有不少大事儿等着它们去办。
分离这些细胞的目的是为了研究、治疗，或者是干脆为了好玩儿。
就像咱们在厨房里分离蛋清和蛋黄，听起来简单，但得有点儿讲究。
准备工作就要做好。
得有新鲜的外周血，这个非常重要哦，越新鲜效果越好。
你想啊，谁会想要那种放了几天的血液呢，肯定不行。
然后，你还得准备一些试剂，比如说淋巴细胞分离液，这个东西就像是我们的“神奇魔法水”，能帮助我们把想要的细胞和其他的杂质分开来。
想象一下，咱们就像是在捞金子，得把泥土和杂物先清理掉，才能找到闪闪发光的金子。
把外周血放进一个离心管里，像是在给它穿衣服。
这个时候，把管子放进离心机里，按下启动键，等待那些细胞的“表演”。
离心机开始转动，哇，像是舞台上的旋转木马，细胞们在里面“翩翩起舞”。
不同的细胞会根据自己的“重量”被分层，沉到底部的那些就是我们想要的单个核细胞。
别急，这个过程可得耐心等，通常要个十几分钟，时间不算长，但你得盯着，不然它们可就“出轨”了。
一旦时间到了，咱们小心翼翼地把管子拿出来，看到底部沉淀下来的细胞，心里那个激动啊，就像中奖一样！用移液管把上面的液体小心吸走，留下底下那一层细胞。
这个时候要稳，千万别让细胞跟着液体一起跑了，那就尴尬了。
吸完后，再加点洗涤液，把这些细胞洗一洗，赶走那些不速之客。
洗完之后，咱们要再次离心，重复这个过程。
就像是做面包，要不断地揉捏，让面团变得光滑。
经过几轮“洗礼”，最终剩下的就是我们的小明星了，单个核细胞。
你想啊，它们可都是为了健康、免疫力打拼的小战士，怎么能不让人心疼呢！把这些细胞进行计数和保存，当然也可以做进一步的实验。
实验结束后，记得给这些小家伙们找个好去处，不能随便丢掉，它们可是“亲密战友”呢！研究的时候，可以深入探讨它们的功能、特点，甚至在医学上用得上，帮助到更多人。
单核细胞的提取方法
单核细胞是从血液中分离出来的，具体步骤如下：
1.采集5-7ml抗凝全血，注入无菌试管。
轻轻混匀后，以3000r/min离心
10分钟。
2.吸取约1.5ml红细胞层至另一无菌试管（避免含有血小板）。
3.将上一步所得的混合物再次以3000r/min离心10分钟。
4.弃去上清液，留下白色沉淀。
其中包含有白细胞、单核细胞和未成熟的多能干
细胞。
5.用无菌吸管或注射器将白色沉淀中的细胞分离出来。
6.将获得的单个核细胞计数并计算出每个样本中的细胞数量。
需要注意的是，单核细胞的提取需要严格遵守无菌操作规程，确保所有步骤都是在无菌环境下进行。
此外，由于单核细胞在体内的含量相对较少，因此需要使用高纯度的方法来获得足够数量的细胞用于实验和分析。
sepmate法分离pbmc
一、什么是sepmate法分离PBMC？sepmate法（全称Seperation Mate法）是一种用于分离周围血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，简称PBMC）的技术。
PBMC是一种在免疫学和临床研究中广泛应用的重要细胞类型，它们可以提供关于免疫系统功能和疾病发病机制的重要信息。
sepmate法可以快速、高效地从血液样本中分离出PBMC，为细胞学研究提供了方便和可靠的实验手段。
二、sepmate法分离PBMC的原理是什么？sepmate法的分离原理基于PBMC在密度梯度离心过程中与其他血液组分分离的特性。
密度梯度离心是利用不同密度的介质将细胞分离的一种常用技术。
在sepmate法中，将血液样本加入到密度梯度离心介质中后，通过离心分离出一层PBMC，从而实现了对PBMC的分离。
三、sepmate法分离PBMC的步骤是怎样的？1. 准备血液样本：首先需要从受试者采集血液样本，一般采用静脉血采集方式。
2. 密度梯度离心：将采集到的血液样本加入到密度梯度离心介质中，然后进行离心分离。
在离心过程中，PBMC会分布在介质中的特定位置形成一层。
3. 收集PBMC层：离心结束后，用移液器从介质上层收集PBMC，然后进行相关的实验操作和存储。
四、sepmate法分离PBMC的优势有哪些？1. 高效性：sepmate法分离PBMC的效率高，可以在短时间内从大量的血液样本中分离出足够数量的PBMC。
2. 纯度高：通过sepmate法分离的PBMC通常具有较高的纯度和活力，适用于多种细胞学实验。
3. 操作简便：sepmate法操作简单，无需复杂的设备和特殊的操作技能，适合于实验室中的常规操作。
4. 可重复性好：经过标准化的操作流程，sepmate法分离PBMC的结果具有较好的可重复性，有利于实验结果的准确性和可靠性。
五、sepmate法分离PBMC的应用领域有哪些？sepmate法分离PBMC广泛应用于免疫学、癌症研究、感染性疾病研究、器官移植免疫监测等领域。
最新 单个核细胞的分离
【步骤】
1.取外周静脉血2ml，注入预先加有肝素的离心管中， 混匀，再加入等量生理盐水，混匀。 2.另取一支离心管，加入2ml淋巴细胞分离液，并倾 斜45°角，用毛细吸管将已稀释的血液（约4 ml） 在距分离液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分离液 上面，二者之间有一明显界面。 3.2000r/min离心20min。离心后，管内可分为以下四 层：上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板； 下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分离液；分离 液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞 层。（见下图）
【结果判断】
活细胞不着色，折光强。而染料可渗入死亡细胞 将其染成蓝色，体积略膨大。正常情况下，活细胞数 应在95%以上。
单个核细胞的分离
【原理】
人外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细 胞，本次实验采用密度梯度离心法分离人外周血 单个核细胞。 红细胞和多形核细胞比重较大，约为1.092， 血小板约为1.032，单个核细胞比重约为1.075。 因此，本实验利用一种比重为1.077等渗的聚蔗 糖-泛影葡胺分离液作密度梯度离心，离心后不 同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。将单个 核细胞层取出，经洗涤后即可用于细胞免疫的某 些试验。
【步骤】
【步骤】
4.用毛细吸管轻轻插到灰白色层，沿试管壁周缘吸取该层 单个核细胞，移入另一试管。 5.加5倍以上体积生理盐水，混匀，1500r/min离心10min， 弃上清。以1ml生理盐水将细胞重悬。 6.细胞计数：（本步骤为选做） 取1滴细胞悬液置血细胞计数板内计数，一般健康成人 血每ml可分离出1×106～2×106个单个核细胞。 7.细胞活力检测： 取1-2滴细胞悬液加1滴台盼蓝染液混匀，加盖玻片， 5min后，显微镜高倍镜下观察。
单个核细胞分离
其实，世上最温暖的语言，“ 不是我爱你，而是在一起。” 所以懂得才是最美的相遇！只有彼此以诚相待，彼此尊 重，相互包容，相互懂得，才能走的更远。 相遇是缘，相守是爱。缘是多么的妙不可言，而懂得又是多么的难能可贵。否则就会错过一时，错过一世！ 择一人深爱，陪一人到老。一路相扶相持，一路心手相牵，一路笑对风雨。在平凡的世界，不求爱的轰轰烈烈；不求誓 言多么美丽；唯愿简单的相处，真心地付出，平淡地相守，才不负最美的人生；不负善良的自己。 人海茫茫，不求人人都能刻骨铭心，但求对人对己问心无愧，无怨无悔足矣。大千世界，与万千人中遇见，只是相识的 开始，只有彼此真心付出，以心交心，以情换情，相知相惜，才能相伴美好的一生，一路同行。 然而，生活不仅是诗和远方，更要面对现实。如果曾经的拥有，不能天长地久，那么就要学会华丽地转身，学会忘记。 忘记该忘记的人，忘记该忘记的事儿，忘记苦乐年华的悲喜交集。 人有悲欢离合，月有阴晴圆缺。对于离开的人，不必折磨自己脆弱的生命，虚度了美好的朝夕；不必让心灵痛苦不堪， 弄丢了快乐的自己。擦汗眼泪，告诉自己，日子还得继续，谁都不是谁的唯一，相信最美的风景一直在路上。 人生，就是一场修行。你路过我，我忘记你；你有情，他无意。谁都希望在正确的时间遇见对的人，然而事与愿违时， 你越渴望的东西，也许越是无情无义地弃你而去。所以美好的愿望，就会像肥皂泡一样破灭，只能在错误的时间遇到错的人。 岁月匆匆像一阵风，有多少故事留下感动。愿曾经的相遇，无论是锦上添花，还是追悔莫及；无论是青涩年华的懵懂赏 识，还是成长岁月无法躲避的经历……愿曾经的过往，依然如花芬芳四溢，永远无悔岁月赐予的美好相遇。 其实，人生之路的每一段相遇，都是一笔财富，尤其亲情、友情和爱情。在漫长的旅途上，他们都会丰富你的生命，使 你的生命更充实，更真实；丰盈你的内心，使你的内心更慈悲，更善良。所以生活的美好，缘于一颗善良的心，愿我们都能 善待自己和他人。 一路走来，愿相亲相爱的人，相濡以沫，同甘共苦，百年好合。愿有情有意的人，不离不弃，相惜相守，共度人生的每 一个朝夕……直到老得哪也去不了，依然是彼此手心里的宝，感恩一路有你！
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞是一种常用的实验技术，它可以用于细胞学研究、基因编辑等领域。
以下是一种简单的分离单个核细胞的方法：
1. 将含有细胞的培养皿用生理盐水洗涤一遍，去除培养液和杂质。
2. 用无菌吸管吸取一定数量的细胞悬液，将其移至离心管中。
3. 进行离心，速度一般为1000rpm，离心时间约5分钟。
4. 取出上清液，留下细胞沉淀。
5. 加入适量的胰酶，将细胞沉淀消化，使细胞单元分离开来。
6. 加入适量的培养基，用移液器分别将细胞单元吸取，将其分
别移至含有培养基的微型离心管中。
7. 进行离心，速度为1000rpm，离心时间约5分钟。
8. 取出上清液，留下单个核细胞沉淀。
以上就是一种简单的分离单个核细胞的方法，需要注意的是，实验过程中需要保持操作环境无菌，确保实验结果的准确性和可靠性。
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（三）小鼠腹腔巨噬细胞的分离
原理及方法：利用巨噬细胞可黏附在玻璃或 塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液体，离心洗 涤，用培养液悬浮，冲洗三次，去除非黏附 细胞，用橡皮棒轻轻刮取、解离贴壁细胞， 即为巨噬细胞。
免疫细胞的功能检测
——功能检测的原理及方法
免疫细胞功能检测的意义
免疫系统或其他系统的疾病，免疫接 种，某些临床措施或外界环境的影响，均 可使免疫细胞的数量和功能发生变化。 因此，免疫细胞数量，功能检测，对 于疾病的诊断、发病机制研究、免疫治疗、 预防接种的效果评估及环境因素对机体免 疫功能影响的判定，都具有重要意义。
根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考
虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；
Ficoll密度梯度离心法
常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077左右的 聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分 层液。
红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴
2007级五年制本科生
免疫学实验课
杨 巍
第四次实验课
人外周血单个核细胞分离
实验内容
人外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离与检测技术（讲解）
实验目的
掌握单个核细胞分离及淋转的原理及方法
熟悉淋巴细胞的检测技术
细胞分离纯化的目的
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或
组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。
1ml刻度吸管 1支/4人 加样器(tip) 1把/4人 显微镜 1台/2人
实验步骤
1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部(距1cm处)
NOTE：不要打破血液与分层液的界面；
2. 分离：2,000r/min离心17min，离心后管内液体可分为四层; 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个核细胞， 放入EP管中(NOTE：尽量少吸分层液);加入PBS至1ml，洗涤1次， 4,000rpm/min，离心5分钟，弃上清； 4. 计数：用500ul PBS重悬细胞，取10ul加到计数板内，计数。
淋巴细胞分离及检测技术
巨噬细胞
淋巴细胞
DC细胞
免疫细胞的分离
——免疫细胞的分离原理及方法
免疫细胞：直接参与免疫应答及与免疫应答相关 的所有细胞的总称。
— Mononuclear phagocyte system
Monocyte Macrophage Dendritic Cells
—
Granulocytes
原理:绵羊红细胞→T细胞→形如花环，比重变大，离心 沉淀
B细胞膜免疫球蛋白检测
原理：荧光素→抗Ig特异性抗体→B细胞表面膜 免疫球蛋白(mIg)
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二. 免疫细胞的功能检测
淋巴细胞转化实验是淋巴细胞功能检测最基本方法。
非特异性:有丝分裂原 PHA、ConA…
微生物及其代谢产物
刺激物 蛋白物质 抗体 淋巴因子 特异性：特异性抗原物质
葡萄球菌…
胃蛋白酶… 抗CD3、CD4抗体…
淋巴细胞转化试验的检测方法
(一)形态学方法
淋巴细胞→淋巴母细胞→染色镜检
(二) 3H﹣TdR掺入法
有丝裂原或抗原→淋巴细胞→染色体复制 →3H﹣TdR掺入 →淋巴细胞摄取→测定放射量
(三) MTT比色法
返回
淋巴细胞亚群检测的方法
（T细胞和B细胞检测方法相同,现以T细胞为例进行讲解.）
Neutrophils Basophils Eosinophils T lymphocyte B lymphocyte NK (Natural killer cells)
—
Lymphocytes
直接参与免疫应答的细胞主要为：T细胞、B细胞、巨噬细胞
免疫细胞的分离
一. 外周血单个核细胞（PMBC）分离
细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。
Ficoll密度梯度离心法
比重：1.070
比重：1.077
Ficoll
比重：1.092
实验材料
分组：两人一组 器材 滴管 EP管 计数板 数量 2支/2人 1个/2人 1块/2人 试剂 分层液 血液 PBS 计数液 数量 0.5ml /2人 1ml /2人 1瓶/4人 1管/4人
（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离
• 单个核 —— PBMC 血中的细胞
• 无核 —— 红细胞 • 多核 —— 多核白细胞来自密度梯度离心法分离原理
PBMC的比重——1.075
Ficoll淋巴细胞分层液 比重——1.077
红细胞 多核白细胞
平均比重——1.092
离心前示意图
稀释的抗凝血
Ficoll分离液
APAAP法: APAAP复合物
兔抗鼠IgG
T细胞 McAb
(三)荧光激活细胞分类仪(FACS)检测T细 胞亚群
FACS是应用流式细胞技术的先进的自动分析仪器,其操作程 序在无菌条件下进行,不影响细胞活性,所以分离、收集的细胞可 继续其他细胞功能的研究。
离心后示意图
血浆
PBMC（白膜状）1.075 Ficoll分离液 1.077 红细胞、多核白细胞 1.092
（二）T、B 淋巴细胞的分离
1、单核细胞的去除：
（1）黏附去除法 * 原理：单核细胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴细胞不能。 （2）L—亮氨酸甲酯去除法 （3）羰基铁吞噬离心法
2、T、B淋巴细胞的分离纯化
免疫细胞检测的分类
一、免疫细胞的数量检测
二、免疫细胞的功能检测
免疫细胞自发增殖活性测定
免疫细胞增殖检测
淋巴细胞增殖检测
一. 免疫细胞的数量检测
检查的项目有：血中T细胞与B细胞的分类计数
血液白细胞的计数 血液中白细胞的分类计数
实验方法
｛
E玫瑰花环实验(检测T细胞)
B细胞膜免疫球蛋白检测
E玫瑰花环实验
二. 淋巴细胞亚群的分离及鉴定（表面标志选择性 纯化淋巴细胞亚群）
E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术(flow cytometry, FCM) 磁珠分离术
免疫细胞分离的依据
1. 2. 3. 4. 细胞膜脆性：低渗液分离 细胞密度：密度梯度离心法 细胞表面标志：流式细胞术，磁珠分离术 细胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龙毛
（NOTE：如细胞数较多，用白细胞计数液做适当稀释，再计数）
5. 调细胞浓度：细胞终浓度为：1×106/ml 。
（NOTE：一般每ml健康成人血可分离1~2×106个单个核细胞，其中90%以 上为淋巴细胞，部分是单核细胞）
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
（1）尼龙毛柱法 ** 原理：B细胞易黏附在尼龙纤维上，洗脱的为非黏 附性的T细胞。 （2）E花环分离法 * 原理：人成熟T细胞表面的CD2分子为绵羊红细胞受 体（E受体），可结合绵羊红细胞形成E花环，比重 增大，沉于管底。 （3）其它：免疫荧光法、流式细胞术、磁珠分离法
E花环分离法
人成熟T细胞表面的CD2分子是绵羊红细胞受体（E受 体），能结合绵羊红细胞形成E花环，经淋巴细胞分离液 分离后，因E花环形成细胞比重大而沉降于管底，再以低 渗法裂解T细胞周围的绵羊红细胞，即获得了纯化的T细胞。
(一)免疫荧光法
(二)免疫酶标法
(三)荧光激活细胞分类仪检测T细胞亚群
(一)免疫荧光法
直接法:荧光素→单克窿抗体→淋巴细胞
间接法:荧光素→第二抗体(羊或兔的抗鼠IgG) →McAb介导→淋巴细胞
(二)免疫酶标法
ABC法:亲和素＋酶标生物素→复合物→生物素化的二抗→McAb介 导和酶催化底物作用→T细胞着色