DNA限制性内切酶消化

第三类限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。这对于克隆基因或克隆DNA片段没有多大用处。
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垂直虚线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。实线剪头表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，可通过形成氢键而“粘合”。另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如HaeⅢ的识别位置是：
[操作]
l．样品DNA的限制性内切酶消化
（1）取2μg样品DNA溶液加入0.5ml的Eppendorf管中，加2μl 10×限制性内切酶缓冲液，6～10个U的相应限制性内切酶，加消毒双蒸水至总体积20μl，于37℃保温酶解2小时，按上述条件用适当的几种不同的内切酶进行单酶或双酶解。
（2）在65℃加热5分钟或用适量的0.5 mol／L EDTANa2终止反应。
4．当样品在37℃与65℃保温时，要注意：
（l）防止因盖子未盖严密使水汽进入管内，使反应溶液体积大量增加，造成实验失败。
（2）防止由于标签脱落，分不清Байду номын сангаас品类型。
5．由于温差原因，往往在盖上有水汽，因此样品酶切完毕或中间取样电泳要离心2秒钟，以集中体积内溶液，否则会发现酶切后体积少了。
[试剂和器材]
1．试剂
（5）6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；40％蔗糖；用消毒双蒸水配制，贮存于4℃。
（6）溴化乙锭溶液：称取溴化乙锭5mg溶解于lml消毒双蒸水中，4℃避光保存。
（7）消毒双蒸水。
2.器材
恒温水温箱；电泳仪；水平电泳糟；50μl可调移液器；紫外灯（上海康华生化仪器制造厂）。
限制性内切酶分类
限制性内切酶主要分成三大类。第一类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中没有多大用处，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。
一定的DNA分子的核苷酸顺序是一定的，某种限制性内切酶作用于该DNA的切点数一定，故所得的DNA片段数和片段的大小也一定，通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酸胺凝胶电泳分离，以标准DNA（λDNA／HindⅢ或λDNA／EcoRI）作对照，溴化乙锭染色后，测出各DNA片段移动的位置和距离。以各标准DNA片段的分子量对数为纵坐标，各标准DNA片段的移动距离为横坐标，求出各样品DNA片段的分子大小。
↓
5’……GG↓CC……3’
3’……CC↓GG……’
↑
在箭头所指处切割，产生的两个DNA片段是：
5’……GG CC……3’
和
3’……CC GG……5’
有时候两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……GCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。这些有相同切点的酶称为同切酶或异源同工酶（isoschizomer）。
（1）限制性内切酶：如EcoRI、HindⅢ、PstⅡ、BamH1等，-20℃贮存。
（2）样品DNA：如λDNA、pBR322等，-20℃贮存。
（3）限制性内切酶缓冲浪配制，见下表（用消毒双蒸水配制，贮存于-20。C）；
表 不同限制性内切酶缓冲液配制表
缓冲液 NaCl TrisHCl(pH7.5) MgCl2DTT
2．要注意酶切时加样的次序，一般次序为水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶液。取液时，Tip头要从溶液表面吸取，以防止Tip头沾去过多的液体与酶，待用的内切酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱，防止限制性内切酶的失活。
3．凡用在酶切反应中的一切塑料器皿（Eppendorf管，Tip头等），都要新的，最后用重蒸水清洗，湿热灭菌，置50℃温箱中烘干，使用前打开包装，用镊子夹取，不直接用手去拿，严防手上杂酶污染。
DNA限制性内切酶消化
[原理]
DNA限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤。内切酶是最关键的工具酶。限制性内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶。
酶单位规定为：在最适反应条件下1小时完全消化lμg λDNA的酶量为1个单位。需注意酶单位数是以切割线性DNA为标准定出的。消化其它种DNA则应根据DNA分子大小、形状适当增加或减少所需的酶量，影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。DNA甲基化，附有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V／V）会抑制内切酶活性，因此在20μl反应体系中，甘油浓度应少于lμl。用2种酶消化DNA时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。
低离子强度 0～10 mmol／L 10 mmol／L 10 mmol／L 1 mmol／L
中离子强度 50 mmol／L 10 mmol／L 10 mmol／L 1 mmol／L
高离子强度 100 mmol／L 50 mmol／L 10 mmol／L 1 mmol／L
（4）10×TBE电泳缓冲液:0.89 mol／L Tris；0.89 mol／L硼酸；0.02 mol／L EDTA Na2pH8.0，高温灭菌，贮存于4℃。
第二类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。如果识别位置在DNA分子中分布是随机的，则识别4个核苷酸的限制性内切酶每隔46（4096）个核苷酸就有一个切点。人的单倍体基因组据估计为3×199核苷酸，识别4个核苷酸的限制性内切酶的切点将有（3×109/2.5×102）约107个切点，也就是可被这种酶切成107片段，识别6个核苷酸的限制性内切酶也将有（3×109/4×103）约106个切点。
第二类限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。如EcoRI的识别顺序为：
↓ |
5’……GAA | TTC……3’
3’……CTT | AAG……5’
2．DNA酶解片段的电泳分离
取DNA酶解作品2μl加上样缓冲液10μl（含溴酚蓝指示剂和甘油），在0.8％琼脂糖（含0.5μg／ml溴化乙锭）凝胶进行水平电泳，电压＜5V／cm，时间2小时左右，用紫外灯观察分析。
［注定事项］
1．分子克隆是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。