血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定崔福爱

※ 饱和(NH4)2SO4溶液边加边摇(逐滴加入！),使用小试管。
• 盐析的原理：蛋白质溶液中，加入高浓 度中性盐，破坏蛋白质溶解的2大因素（ 电荷，水化膜），使其沉淀析出。 • 中性盐：硫酸铵，硫酸钠等 • 蛋白质复溶：加入低盐浓度缓冲液 • 控制盐溶液的浓度可以沉淀出不同的蛋 白
• 影响因素：
• 洗脱液：溶解待分离物质，不变性 • 加样量：1%～5% • 凝胶的再生
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μ m) G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 40～120 50～150 50～150 40～120 40～120 40～120 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr） 2～3 2.5～3.5 4～6 9～11 12～15 15～20 ＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103 1.5×103 ～ 3×104 3×103 ～ 8×104 4×103 ～ 1×105
脂糖-葡聚糖复合凝胶。
流动相：洗脱液
交联葡聚糖凝胶
多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构 球状颗粒，商品名为Sephadex G系列 G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的 规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义 为吸水量（g）/10g干胶 交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔 径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大 ，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程 度，膨胀程度及分离范围。
③原理：吸附、分配、凝胶、离子交换
、亲和、金属螯合、疏水、反相
5．凝胶层析
(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、
分子排阻层析) ①定义：指混合物随流动相流经固定
相的层析柱时，混合物中各组分按其
分子大小不同而被分离的技术。
②基本原理：
固定相：凝胶，惰性三维空间多孔
网状结构，故称分子筛，包括琼脂
糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼
凝胶层析的基本原理
样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直 向下运动和不定向扩散运动→小分子可进入凝胶空内部，流程长， 速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程 短，先流出→大小分子彼此分开
③影响因素 • 层析柱的选择及装填：
柱大小—分离样品量 凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布 有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离 范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种 全排阻分子/完全渗透分子。
电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电 性相反的电极移动的现象。 电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分
析的技术。
电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场
电泳用于分离物质的原理：
COO╱ + H+ Pr ←————→ ╲ + OHNH2 PH>PI COOCOOH ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ╲ + OH╲ NH3+ NH3+ PH<PI
温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可 ,少数温度敏感型蛋白质需4℃操作，而血红 蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25℃比0℃时溶 解度低，更易盐析。 pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。 pH=pI效果更好。 蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血 清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在 2.5-3.0%。
用色彩（chroma）和 图谱（graphs）组成 色谱一词 （Chromatography)
2. 依据：利用混合物中各组分的理化
性质差异（吸附力、分子形状、大小、
酸碱性或分子极性、分子亲和力以及分
配系数等），而最终达到对物质进行分
离纯化和分析鉴定的目的。
3．基本原理：固定相和流动相
固定相—固定不动 流动相—对固定相作单向相对运动，推动样ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
品中各组分通过固定相向前移动。各组分理 化性质不同，对流动相和固定相具有不同的 作用力，因此在流动相推动样品通过固定相 的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、 解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中 的迁移距离不等，达到分离。
4．分类：
①流动相的物理状态：气相和液相
→ 气液/固，液固/液
②方式：纸、薄层、柱
羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸
酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具
均一的泡沫状结构，有强渗透性。 电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液
血清蛋白质参考值
等电点 清蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 4.64 5.06 5.06 5.12 6.85～7.3 分子量 69 000 200 000 300 000 90 000～150 000 156 000～950 000 占总蛋白的百分数(%) 57～72 2～5 4～9 6.5～12 12～20
清蛋白 1
2


清蛋白
1
2

加样线

对照
样品


纯化蛋白 加样线
【操作步骤】 1．点样：取经巴比妥缓冲液浸透的2×8cm薄膜，滤纸 吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一 加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在 加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳 槽支架的盐桥上，静臵5～10分钟平衡。点样端臵阴极， 盖上盖子。 2．通电：接通电源，调节电压为8～15V/cm，通电约 1h，关闭电源，停止电泳。 3．染色：薄膜浸入氨基黑B染色液2～5分钟。 4．漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗4～5次，至无蛋白 区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。
预试结果
注意事项： 1．使用小试管，便于离心。 2. 硫酸铵的滴加，边摇边逐滴加入 3．上样：转圈滴加，起跑线一致 4．防止柱上液层干涸（二人配合） 5．洗脱液收集无需分步，用载玻片检测蛋白， 约每5滴（约1ml)检测一次，无纳氏试剂 6．G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高约 0.5ml，离心后，管内凝胶倒入烧杯回收 7. 柱子使用完毕后用洗脱液流洗3～4个柱长， 保持上层有2cm以上的液体，关闭下方控制夹。
*有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀
个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状
不同
实验思路
盐析去除杂蛋白
先 粗 后 细
凝胶层析脱盐
交联葡聚糖吸水浓缩
醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
上 午 完 成 下午 完成
实验流程及操作注意事项
1. 初步纯化：盐析


取血清1.0ml于小试管中，加入洗脱液 1.0mL摇匀 ，再逐滴加入1.0mL pH7.2饱和(NH4)2SO4溶液边加 边摇。静臵5min后，3000rpm/min 离心10min。倾去 上清液。 将沉淀用1.0mL 洗脱液搅拌溶解，再逐滴加入 0.5mL饱和(NH4)2SO4溶液， 混匀，于室温放臵5min 。 3000rpm/min 离心10min 。 倾去上清液。沉淀 用0.3mL洗脱液溶解，即为初步纯化的γ-球蛋白溶 液。
2.凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最 好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱， 用时较短。 固定相：sephadex G-25
流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液
原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。
3.浓缩：sephadex G-25吸水，利 用高分子性质。
4.鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳
PH=PI
蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大
于其等电点的溶液中带负电，在电场中向正极
移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同
，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向 正极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后 可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组 迁移率相近似的蛋白质。
醋酸纤维素薄膜电泳 介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的
实验二 血清γ球蛋白的分 离纯化与鉴定
崔 福 爱 生化与分子生物学研究所
层析技术
实验原理
实验思路 实验流程及操作注意事项
层 析 技 术
1．层析法：
层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、 分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发 现并命名的。将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的 柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动 后形成不同的色带而被分开。
实验原理
透析及超滤法 盐析、有机溶剂/免疫沉淀 电泳 凝胶层析 离子交换层析
超离心
分离依据：蛋白质理化性质的共性和个性
共性：
*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电 荷→盐析/有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；
反之带正电→电泳、离子交换层析