一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法

合集下载

ipsc分化为rpe的方法

ipsc分化为rpe的方法IPSC分化为RPE的方法简介在干细胞研究领域，将人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，简称iPSC）分化为视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，简称RPE）细胞是一个具有重要意义的研究方向。

RPE细胞在视网膜功能维持中起着重要的作用。

本文将介绍一些常用的方法，用于IPSC分化为RPE细胞。

方法一：原代细胞培养在过去的研究中，研究人员采用了原代细胞培养的方法来分化IPSC为RPE细胞。

这种方法的优点在于可以直接从组织中获得RPE细胞，并且维持了RPE细胞的天然特性。

但是，原代细胞培养方法存在许多挑战，如细胞来源有限、细胞增殖缓慢等。

方法二：向下分化法向下分化法是一种常用的方法，可将IPSC分化为RPE细胞。

该方法利用特定的培养条件和信号通路调控，将IPSC逐步分化为RPE细胞。

这种方法的优点在于可以控制分化过程中的细胞品质和数量，但是也需要精确调控培养条件和信号通路。

单因子向下分化法单因子向下分化法是指通过添加特定的因子或生长因子，来促进IPSC向RPE细胞的分化。

常用的因子包括视黄醇、肝细胞生长因子等。

这些因子的选择和时间控制对分化的效果有重要影响。

多因子向下分化法多因子向下分化法是通过联合使用多个因子，来实现更精确的IPSC向RPE细胞的分化。

这种方法的优点在于可以模拟胚胎发育过程，提高分化效率和细胞品质。

方法三：遗传改造法遗传改造法是通过基因编辑技术，对IPSC进行遗传改造，使其能够直接分化为RPE细胞。

常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9、ZFN、TALEN等。

这种方法的优点在于可以直接转录特定的RPE细胞转录因子，从而实现高效的分化。

方法四：重编程法重编程法是将IPSC重新编程为RPE细胞的一种方法。

通过转录因子的表达，在IPSC中激活RPE细胞特定基因的表达，从而实现分化。

该方法的优点在于不需要添加外源性因子，但是需要精确控制转录因子的表达时间和水平。

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫

原代细胞培养之--培养技术原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。

原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。

原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。

如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。

1、组织块培养法组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。

其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。

其培养方法如下：(1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。

(2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。

(3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。

开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。

鼻黏膜上皮细胞培养路线

鼻黏膜上皮细胞培养路线方法一：分离细胞培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织进行冲洗，将菲薄的黏膜层从黏膜下组织小心地翻揭分离下来（略呈黄色的一面是上皮层）→黏膜剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育30min）→消化后在上述有黏膜块的酶溶液内直接加入等量的0.25%胰蛋白酶，轻轻吹打5min →移除黏膜块，细胞悬液进行离心（黏膜块可用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基冲洗后再予去除，冲洗液也同样进行离心）→沉淀中加入适量含血清培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。

方法二：组织块培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶消化（37℃孵育过夜）→离心（1000r/min，4℃5min）→弃去上清，沉淀中加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打均匀后接种于细胞培养瓶。

方法三：ABC培养法：用含双抗（100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素）4℃无菌的PBS溶液对组织块进行冲洗、浸泡、并剪碎（1mm×1mm大小）→黏膜块剪碎后加入0.1%Ⅰ型胶原酶(酶量为组织块体积的5倍)消化（37℃孵育过夜）→第2天取出，轻轻吹打，将细胞悬液移走，组织块留在培养瓶内，加入适量含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中。

采用ABC贴壁法行原代培养。

即取A、B、C3个培养瓶。

将细胞悬液先种于A瓶，在CO2培养箱中孵育10min，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中到瓶角后慢慢吸出全部培养液，接种到B瓶，CO2培养箱中孵育10min，同法将细胞悬液转入C瓶中。

控制培养液液面高度在2-5mm，以去除鼻黏膜上皮细胞中的成纤维细胞和红细胞。

再置37℃饱和湿度CO2细胞培养箱中孵育24h，培养液更换为含生长因子培养液，隔日换液1次。

细胞培养步骤

一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后，经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群，使之在体外模拟人体生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，生存、生长和繁殖。

原代培养细胞常有不同的细胞成分，生长缓慢，但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征。

利用原代细胞培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。

其操作步骤如下。

1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织。

再次清洗后，用手术刀将组织切成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。

静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数。

用培养液将细胞数调整为（2～5）×105 cells／ml，或实验所需密度，分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。

置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。

一般3～5d，原代培养细胞可以黏附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3d后换液，一般7～14d可以长满瓶壁，进行传代。

4. 注意事项（1）无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般很难消除。

（2）培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。

由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

（3）小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。

可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。

原代细胞培养方法

原代细胞培养方法原代细胞培养方法一、介绍原代细胞培养的概念和重要性：原代细胞是从人或动物体内初次分离出的细胞，具有体内组织原始性和遗传特性的稳定性。

原代细胞培养是一种重要的实验手段，广泛应用于生物学、医学和药物研发等领域。

通过原代细胞培养，可以研究细胞的生长、分化、凋亡以及与疾病相关的分子机制等。

二、准备原代细胞培养的基本设备和试剂：1. 培养箱和细胞培养用的培养皿：培养箱提供恒温和湿度控制，保持培养环境的稳定；培养皿用于细胞的贴壁培养和传代。

2. 细胞培养无菌耗材：如细胞培养板、培养瓶、离心管等。

3. 细胞培养液：如DMEM、RPMI 1640等。

需根据实验需求选择适当的培养液，并添加适当浓度的血清、生长因子等。

4. 酶消化液：如胰蛋白酶、胶原酶等，用于细胞的分离和传代。

5. 生物安全柜和消毒液：用于操作细胞时的无菌保护和实验室的消毒。

三、原代细胞培养的步骤：1. 组织样本的收集：选择合适的组织样本，如肺、肝脏、肾脏等，进行无菌采集。

2. 组织的消化：将组织样本切成小块，加入适量的酶消化液，在恒温摇床上消化一段时间，使细胞分散。

3. 细胞的离心和洗涤：将消化后的细胞离心，去除酶消化液，并用适量的培养液洗涤细胞，去除残留的异物和垃圾。

4. 细胞的贴壁培养：将洗涤好的细胞转移到培养皿中，加入适量的培养液，将培养皿放入培养箱中，培养维持适当的温度和湿度。

5. 细胞的传代：当细胞达到一定密度时，用酶消化液进行细胞的分离和传代，将细胞转移到新的培养皿中，以保证细胞的生长和扩增。

四、原代细胞培养的注意事项：1. 保持无菌操作：在生物安全柜中进行细胞培养，并使用无菌试剂和耗材，避免细菌和真菌的污染。

2. 控制培养条件：根据不同细胞类型的要求，调整培养液中的成分和浓度，以及培养箱中的温度和湿度。

3. 注意细胞的健康状态：细胞的形态、增殖情况和凋亡等指标应定期观察和记录，及时发现和解决细胞培养中的问题。

4. 合理的细胞传代次数：每个细胞类型的传代次数有一定限制，过多的传代会导致细胞功能和稳定性的下降。

2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准

2024采用常用试剂构建胃肠道上皮和肿瘤类器官的参照标准胃肠道恶性肿瘤是威胁我国人民生命健康的公共卫生问题之一。

良好的实验模型是解析肿瘤发病机制和研发临床治疗新方法的有力工具。

高质量的生物医药研究需要实验模型尽可能再现来源组织的生理、病理状态。

类器官（Organoid）便是新近发展起来的一种新型实验模型。

类器官是指将部分活组织在体外3D培养基中扩增、传代形成的小器官样细胞团。

类器官在组织细胞构成、生物学功能及基因组变异谱上均与其来源组织有极高的相似性。

类器官具有制备周期短、可以长期低温保藏和可重复使用等诸多优势。

近年来，国内外较多机构开展该领域的工作并积累了一定的经验。

为了使胃肠道肿瘤研究中类器官相关技术得到有效利用和健康发展，作者以采用常用实验耗材与试剂为例，就类器官构建中组织样本前处理、类器官构建、类器官冻存与复苏、类器官生长状态评估以及类器官质量控制等关键技术提出可参照标准。

类器官构建的总原则此标准是基于酶消化法将人胃肠道正常黏膜上皮和胃肠道腺癌组织制备成单个细胞悬液,再将细胞与3D培养支架（此处指基质胶）混合形成3D胶滴,再加入市售的胃肠道上皮专用完全培养基进行培养（类器官专用特定培养基是指含有所培养组织细胞需要的生长因子、细胞因子以及小分子化合物）。

其目的是模拟胃黏膜上皮的生长微环境，促使胃肠道干细胞分化成为各种类型的胃肠道黏膜上皮细胞，同时还可维持胃肠道干细胞或多能干细胞的干性，实现体外长期培养、传代目的，便可培养出与胃肠道黏膜组织结构功能类似的活组织类器官。

类器官培养中涉及到的供体生物样本来源均以自愿同意参与科学研究为原则，并以签署知情同意书QnfOrmedConSent)为具体体现。

主要试验耗材与试剂主要耗材包括24孑麻、1.5mLEP管、15mL离心管、培养皿、50mL离心管、移液管、无菌吸头、冻存管、巴氏吸管、移液器、无菌棉球、银子、组织剪、70~100μm细胞过滤器(Coming)、细胞程序性冻存盒等。

原代细胞培养概念原理方法举例

3.过滤与洗涤：将消化的组织块吹打均匀，用80到200目不锈钢筛网过滤，离心洗涤过滤的细胞与细胞团
4,根据细胞计数用培养基制备适当浓度（一般为0.5到2 乘以10的6次方每毫升） 5.分装培养瓶，37 度或者加5%二氧化碳，进行培养。
6.长成单层后可换乘维持液应用，或者最好进行传代后再应用
基本的程序：
织洗涤，剪碎成12mm大小的组织碎片
以鸡成纤维细胞培养为实验目的例，初步了解原代细胞培养的操作程序和要点。
9-11日龄鸡胚1只，营养实验材料液，Hank液，碘酒，酒精，蛋架，手术器械，平皿，吸管，培养瓶等
5.用吸管将小组织快吸
入装有10ml的1.125%胰
酶消化液体的三角瓶中， 4.无菌小剪刀将鸡胚剪 2.用消毒弯剪刀剪去气成1-2mm的小块，用 Hanks液体洗涤2-3次，充分洗去红血球，吸弃扎进瓶口，置于37度水浴静止消化10到15 分钟，期间可摇动1-2次，观察消织快周边出现微绒毛状，此时稍加摇动即有大量细胞游离，液体变混，取出三角瓶，用吸管吹打数次，以助细胞分散。悬液经四层纱布过滤后，滤液用 500到1000转每分钟离心5分钟，吸去上清，加营养液吹打，分散细胞，制成均匀悬液。
原代细胞的培养
原代细胞的培养：供体获取组织后进行的首次培养。
最大的优点:细胞刚离开机体，生物学性状与原体内细胞比较接近，适用于做药物检测等实验，同时初代细胞培养也是建立各种细胞株（系）必须经过的阶段，因此它是组织培养工作者应该熟知和掌握的技术。
2.用分散剂消化分 1.处理组织，将组散组织块，如加入组织量大30到50倍的胰酶消化液，消化30到60分钟（冷消化过夜）
7.取细胞悬液计数后，

一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710212294.8(22)申请日 2017.04.01(71)申请人兰州大学地址 730000 甘肃省兰州市城关区天水南路222号(72)发明人韩俭　王礼　彭琦　孙旭冬　任弟娟　张富花　徐媛媛　(74)专利代理机构北京中恒高博知识产权代理有限公司 11249代理人姜司晨(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)C12N 1/20(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法(57)摘要本发明公开了一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，包括以下步骤：1）配制幽门螺杆菌培养基；2）将培养基加入无菌细胞培养瓶制成斜面；3）将胃黏膜上皮细胞在已形成斜面的培养瓶中培养贴壁；4）取幽门螺杆菌48h菌液离心后用细胞培养液重悬；5）将重悬菌液加入至已有贴壁细胞和斜面培养基的培养瓶中培养，每天计数活菌量并观察细胞形态学变化。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种全新幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养方法。

在新体系中，幽门螺杆菌正常生长，持续刺激贴壁细胞产生病变，起到很好模拟感染人胃黏膜时的状况。

解决了传统法中直接加入幽门螺杆菌，因培养液不适宜于其生长而造成衰退或死亡，难以有效刺激细胞的问题。

权利要求书1页说明书4页附图2页CN 106947732 A 2017.07.14C N 106947732A1.一种幽门螺杆菌和胃黏膜上皮细胞共培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）配制用于培养幽门螺杆菌的哥伦比亚琼脂固体培养基并以高温高压湿热灭菌，待固体培养基冷却至50℃-60℃时，加入葡萄糖溶液和新生小牛血清，充分混匀，得到幽门螺杆菌培养基；2）取步骤1）得到的幽门螺杆菌培养基10ml，加入到50ml无菌细胞培养瓶中，并使细胞培养瓶的下底面与水平面成30度角，待培养基冷却凝固在瓶底形成斜面后，水平或竖直放置培养瓶备用；3）取含胃黏膜上皮细胞5×104个/ml的细胞悬液3ml加入至步骤2）得到的细胞培养瓶，将细胞培养瓶水平放置入细胞培养箱中，10%CO 2、37℃培养24h，使胃黏膜上皮细胞贴壁；4）取已经培养了48h处于稳定期的幽门螺杆菌菌液1ml进行离心，离心转速为800rpm，离心时间为5min，弃去上清后加入细胞培养液1ml重悬，得到重悬菌液；5）将步骤4）得到的1ml重悬菌液加入至步骤3）得到的胃黏膜上皮细胞已经贴壁的细胞培养瓶中，再将细胞培养瓶放入专门用于幽门螺杆菌培养的培养箱中继续培养，培养条件：37℃、湿度90%、微需氧气体环境，即气体环境含按照体积百分比计的5%O 2、10%CO 2和85%N 2，之后每天计数培养瓶液体中幽门螺杆菌的活菌量并观察细胞的形态学变化，收集作用后的细胞和细菌。

细胞实验原代培养

细胞生物学实验原代培养一、实验目的1.理解细胞原代培养原理2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作5.熟悉无菌操作技术二、实验原理细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。

由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。

同时也为以后传代培养创造条件。

原代培养:组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。

原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。

三、实验步骤鸡胚成纤维细胞的原代培养（1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。

要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。

（2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。

打开照明灯。

（3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。

（4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。

（5）按照1%的比例向含10%FCS的DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为80ml，故加入800μl的双抗）（6）取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，用镊子在鸡蛋气室位置（大头处）敲一个小口，然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。

（7）换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks液冲洗鸡胚，重复三次。

（8）用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏，用D-hanks液充分洗涤躯干部分三次。

（9）将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎，剪碎速度要快。

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法

一种原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离
培养方法
嘿，咱今儿就来讲讲这原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法。

这可不是个简单事儿啊，就好像要从一堆宝藏里精准地找出最闪亮的那颗宝石一样！
先说说取材吧。

咱得从那活蹦乱跳的大鼠或小鼠身上下手。

这可得小心点，别把它们弄疼了，还得快准狠地把胃给取出来。

这就像是在跟时间赛跑，稍微慢点，那细胞可就不乐意了。

取出来胃之后，就得清洗啦。

就跟咱洗衣服似的，得把那些脏东西都洗掉，给细胞一个干干净净的“家”。

然后就是关键的一步，把胃粘膜上皮细胞给分离出来。

这可不容易啊，得有耐心，就跟绣花似的，得一点一点来。

接下来就是培养啦。

这就好比给细胞准备了一个舒适的小窝，温度啊、湿度啊都得恰到好处。

给它们提供足够的营养，让它们能茁壮成长。

你说这细胞多娇气啊，稍微有点不合适就不乐意长了。

但咱不能怕麻烦呀，谁让它们这么重要呢！想想看，要是能把这些细胞培养好，那能为科学研究做出多大的贡献啊！
有时候我就想，这细胞就像一个个小生命，咱得好好照顾它们。

看着它们一点点长大，心里那叫一个高兴。

培养的过程中可得时刻留意着，别让它们出啥岔子。

这就跟照顾小孩子一样，得时刻操心着。

要是有个什么问题，得赶紧想办法解决。

哎呀，说起来容易做起来难啊！但咱不能放弃，得坚持下去。

说不定哪天就有重大发现了呢！总之，这原代大鼠或小鼠胃粘膜上皮细胞的分离培养方法可真是个技术活，需要我们细心、耐心、用心地去对待。

只有这样，才能让这些小小的细胞发挥出大大的作用！。

人原代支气管上皮细胞的简易分离和培养

人原代支气管上皮细胞的简易分离和培养谢冬;翟成凯;刘影影;赵乐;张彬彬;吴卫东【摘要】目的建立一种实验环境更贴合人体、方便快捷、细胞活性和纯度较高的支气管上皮细胞原代培养方法.方法通过纤维支气管镜刷检获取新乡市第一人民医院收治的63例患者正常的支气管上皮细胞,采用无血清的支气管上皮细胞培养基(BEGM)进行纯化、分离,行原代培养并传代,锥虫蓝染色,光学显微镜下观察细胞存活状态并测定细胞存活率,通过倒置生物式显微镜和免疫组织化学染色观察鉴定细胞.结果人支气管上皮细胞的平均存活率为(96.8±0.5)％,细胞免疫荧光角蛋白染色阳性,兔抗人细胞角蛋白8单克隆抗体免疫组织化学染色显示细胞质着色为绿色,细胞核复染为蓝色,鉴定为人原代支气管上皮细胞.结论经纤维支气管镜刷检获取并采用无血清BEGM培养人原代支气管上皮细胞操作简便、快捷有效,细胞存活率较高,能够提高上皮细胞纯度,可以为研究呼吸系统疾病提供良好的模型.【期刊名称】《新乡医学院学报》【年(卷),期】2018(035)010【总页数】5页(P854-857,864)【关键词】人支气管上皮细胞;原代培养;鉴定【作者】谢冬;翟成凯;刘影影;赵乐;张彬彬;吴卫东【作者单位】新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003;新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院附属新乡市第一人民医院呼吸科,河南新乡453000;新乡医学院公共卫生学院,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】Q813.1支气管上皮细胞是呼吸道黏膜的第1道屏障，在抵御病原体、异物入侵和机械损伤的过程中发挥重要的免疫调控作用[1]。

支气管上皮细胞与呼吸系统疾病关系密切，通过损伤后的异常修复，分泌多种炎性介质和细胞因子，参与疾病发生、发展的不同环节[2]。

正常胃黏膜上皮细胞的分离和鉴定方法

正常胃黏膜上皮细胞的分离和鉴定方法
程永波;房殿春
【期刊名称】《胃肠病学》
【年(卷),期】2006(11)3
【摘要】原代培养的胃黏膜上皮细胞是进行胃生理功能、病变机制、药物治疗等研究的重要工具，其整体生理状态和结构特点与体内姊妹细胞相似，临床实用价值较大，是肿瘤组织衍生细胞系所不能比拟的。

然而在我国，几乎所有相关研究采用的都是各类细胞系。

而非原代培养细胞，很重要的一个原因就是胃黏膜上皮由多种细胞成分组成。

对分离条件要求较高，原代培养不易成功。

【总页数】3页(P175-177)
【作者】程永波;房殿春
【作者单位】中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心,400038;中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化专科中心,400038
【正文语种】中文
【中图分类】R4
【相关文献】
1.一种简便的人正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法 [J], 程永波;房殿春;郭立萍;王自强;罗元辉;周建嫦
2.正常胃黏膜上皮细胞原代培养方法 [J], 程永波;房殿春
3.构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型 [J], 郑金旭;黄振杰;汤艳;丁明
4.正常SD新生大鼠结肠上皮细胞体外分离的培养与鉴定研究 [J], 翟荣林;王国斌;蔡开琳;田元;许飞
5.大鼠胃黏膜上皮细胞分离方法的实验研究 [J], 杨宗保;邹小平;严洁
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

上皮细胞培养

上皮细胞培养1）表皮细胞培养1．取材：取外科植皮或手术残余皮肤小块，以角化层薄者为佳，早产流产儿皮肤更好，切成0.5～1平方厘米小块。

2．EDTA处理：先置入0.02％EDTA中室温置5分钟。

3．冷消化：换入0.25％胰蛋白酶中，置4℃过夜。

4．分离：取出皮肤，用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开。

5．温消化：取出表皮单独处理，用剪刀剪成更小的块后，置入新的0.25％胰蛋白酶中，37℃再消化30～60分钟。

6．用吸管轻轻反复吹打，使成细胞悬液。

7．培养液：通过80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸上清，直接加入Eagle液和20％小牛血清，制成细胞悬液，接种入碟皿中，CO2温箱培养。

2）乳腺组织培养直接培养法：（适于培养含纤维少的软组织）1．在含有少量培养液或Hanks液的容器中，用锋利刀片将组织反复切割成碎块。

2．把组织碎块连同液体注入离心管中，再补加少许培养液，用吸管吹打片刻，置试管架3～5分钟。

吸除上层液可排除非乳腺细胞部分。

重复2～3次。

3．末次处理结束后，向沉降管中再补加培养液，用吸管稍吹打，使沉降物重悬。

不待细胞团块下降立即通过3～4层无菌纱布滤入另管中。

4．调整好适宜密度，接种入培养瓶中培养。

胶原酶消化法：（适于处理含纤维多的较硬组织）其过程与培养其它组织相同。

3）胃上皮细胞培养1．取材：取胃溃疡或胃癌手术切除胃标本远端非病变区粘膜少许。

2．清洗：用含庆大霉素（400微克/毫升）和二性霉素（2微克/毫升的Hanks）液漂洗后，用钝器剥离下粘膜，剪成1mm3大小。

3．消化：在I型胶原酶和透明质酸酶中，于37℃中消化80分钟。

4．离心：收集细胞悬液，800转/分离心后，Hanks液漂洗两次。

5．接种：末次离心后加入含有1％～2％胎牛血清的完全培养基，接种入不同孔数的培养板中，接种量依不同实验目的而定。

4）肝细胞培养初代组织块培养：取新鲜肝脏，先剥除被膜和血管等纤维成分，用刀或剪刀把肝脏剪成1mm3左右的小块，采用帖壁培养法。

改良成人胃粘膜上皮细胞原代培养

改良成人胃粘膜上皮细胞原代培养
李志芳;林庚金;蔡定芳
【期刊名称】《胃肠病学》
【年(卷),期】2000(005)001
【摘要】目的:建立成人胃粘膜上皮细胞原代培养方法.方法:采用胰酶和胶原酶冷消化法消化分离手术切除的成人胃粘膜,细胞培养于含20%小牛血清的
DMEM/F12培养液中.结果:细胞于种植24h后开始生长,3天长成片状,相差显微镜下可见90%以上的细胞具有上皮细胞特征.免疫组化显示90%以上的细胞上皮角蛋白染色、上皮膜抗原阳性.MTT比色法显示活细胞数于第4天达到高峰.3H-胸腺嘧啶核苷(TdR)掺入法显示细胞具有合成DNA的能力,并于第3天达到高峰.结论:本方法培养的细胞特异性高,存活时间长,为体外研究提供了较理想的模型.
【总页数】2页(P34-35)
【作者】李志芳;林庚金;蔡定芳
【作者单位】上海医科大学附属华山医院消化内科 200040;上海医科大学附属华山医院消化内科 200040;上海医科大学附属华山医院消化内科 200040
【正文语种】中文
【中图分类】R573
【相关文献】
1.胚胎鼠胃粘膜上皮细胞的原代培养 [J], 周京军
2.改良兔角膜上皮细胞原代培养及纯化的方法 [J], 石妍;杨帆;葛红岩;刘平
3.改良人牙龈上皮细胞原代培养方法 [J], 余婧婷;孟焕新;刘凯宁
4.正常宫颈上皮细胞原代培养体系的改良 [J], 李雅;荣守华;智艳芳;樊婷婷;邱翠;李肖甫
5.构建一种分离培养原代小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞改良方法 [J], 严玉玲;周园红;叶红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养_刘小勇

广东医学 2007年 2 月第 28 卷第 2期
1 81
人羊膜上皮细胞的原代及传代培养*
刘小勇 1 陈剑 1 吴静 2 周清1 王彦平 3 李红 4 徐锦堂 2 赵松滨2
暨南大学 1附属第一医院眼科, 2 医学院眼科研究室, 3 病理生理学教研室, 4 附属第一医院病理科 ( 广州 510630)
【K ey words】 Amn io tic m emb rane Epithe lia l cells Ce ll culture
人羊膜上皮细胞位于羊膜的最内层, 羊膜上皮细胞在受精后第 8天从外胚叶发育而来, 使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性 [ 1]。人羊膜上皮细胞不表达 HLA - A, B, C 或 DR 抗原, 移植后不易引起免疫排斥反应 [ 2] 。在一定的条件下, 羊膜上皮细胞可分化为成熟的神经元细胞 , [ 3] 毛囊和皮肤上皮细胞 [ 4], 羊膜上皮细胞理论上可以分化成各种组织细胞 [ 1]。因此, 对羊膜上皮培养方法的探索及对羊膜上皮的生长特性的研究具有重要意义, 可为将来的组织工程应用奠定基础。
* 广东省重大科技计划项目 (编号: 2003A 3020104) , 国务院侨办重点学科基金项目 ( 编号: 51205004 )
通讯作者, 电话: 020- 38688003
1 2 方法 1. 2. 1 人羊膜上皮细胞的原代培养人羊膜取自经家属同意的且 H IV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖宫产分娩产妇的胎膜。将羊膜与
【摘要】目的建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法, 观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性。方法取足月剖宫产术后羊膜, 经胶原酶和胰蛋白酶消化后, 获取的羊膜上皮细胞接种于含 10% 胎牛血清培养基中进行原代和传代培养, 探索其合适的培养条件, 用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征。用苏木精 - 伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。结果人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代, 体外可连续传 8~ 10代。体外培养细胞呈多角形, 长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观。扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛。细胞角蛋白 keratin 单克隆抗体染色阳性。结论人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养, 体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力。

细胞培养的操作步骤

细胞培养的操作步骤一、原代培养及其操作步骤原代分离细胞培养是指从供体内取出组织后;经机械以及消化分离成单个细胞或单一型细胞群;使之在体外模拟人体生理环境;在无菌、适当温度和一定的营养条件下;生存、生长和繁殖..原代培养细胞常有不同的细胞成分;生长缓慢;但是更能代表所来源的组织细胞类型和表达组织的特异性特征..利用原代细胞培养做各种实验;如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好..其操作步骤如下..1.剪切组织先将所取得的组织;用D-Hanks或Hanks液清洗;以去除表面血污;并用手术镊去除黏附的结缔组织等非培养所需组织..再次清洗后;用手术刀将组织切成若干小块;移入青霉素小瓶或小烧杯中;加入适量缓冲液;用弯头眼科剪;反复剪切组织;直到组织成糊状;约1mm3大小..静置片刻后;用吸管吸去上层液体;加入适当的缓冲液再清洗一次..2.消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞;以利于进一步的培养;常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶..3.培养细胞悬液用计数板进行细胞计数..用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／ml;或实验所需密度;分装于培养瓶中;使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜..置CO2培养箱内;5％CO2;37℃静置培养..一般3～5d;原代培养细胞可以黏附于瓶壁;并伸展开始生长;可补加原培养液量1／2的新培养液;继续培养2～3d后换液;一般7～14d可以长满瓶壁;进行传代..4.注意事项1无菌操作：细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因;必须加强各个环节的无菌操作观念;以预防为主;一旦污染;一般很难消除..2培养液：所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件..由于细胞来源的动物种类、组织类型不同;对培养液的要求有一定的差异;必要时可用预实验的方法选择适当的培养液..3小牛血清：小牛血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用..可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析..一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后;就保持应用至实验完成..4胶原酶溶液：必须新鲜配制;贮存时间过长即使是-20℃低温保存;也将影响消化效力;导致消化时间过长;细胞损伤增加..5L-谷氨酰胺：几乎所有细胞对谷氨酰胺都有较高的要求;细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质;在缺少谷氨酰胺时;细胞会因生长不良而死亡..谷氨酰胺在溶液中很不稳定;加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱贮存两周以上时;就应重新加入原来量的谷氨酰胺..6静置培养：原代细胞在消化分离后;置于CO2培养箱的头24～48h 必要时72h内;应处于绝对静置状态;切忌不时地取出培养瓶观察生长状况;这将使原代分离细胞难以贴壁;更谈不上伸展和增殖;初学者尤应注意..不必担心培养液中的营养成分会消耗光;在细胞增殖之前对营养的要求并不大..原代培养初期仅加一薄层培养液的目的也在于有利于细胞贴壁伸展..7消化时间：一般消化至肉眼尚可见微小组织颗粒即可;因为此时组织颗粒已经松散;略经吹打即成细胞团或单个细胞;过久的消化往往导致细胞损伤加重;细胞培养成活率降低..8其他生长因子：经过以上处理;一般原代分离细胞培养均可以成功..对于少数特殊类型细胞也可以考虑加一些特殊的生长因子;如胰岛素能促使细胞摄取葡萄糖和氨基酸..另外;内毒素、EGF、FGF等均有促有丝分裂作用;但费用较高..二、传代培养及其操作步骤原代细胞培养成功以后;需要进行分离培养;否则细胞会因生存空间不足或密度过大;营养障碍;影响细胞生长..细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中培养的过程称之为传代培养..传代细胞允许培养的细胞扩增形成细胞株;可以进行细胞克隆;易于保存;但可能丧失一些特殊的细胞和分化特征..传代细胞形成细胞株的最大利处在于提供了大量持久的实验材料;便于实验..1.操作步骤1吸掉或倒掉培养瓶内旧培养液..2向瓶内加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量..以能覆盖培养瓶底为宜..3置37℃孵箱或室温25℃温度下进行消化;2~5min后把培养瓶放在倒置显微镜下进行观察;当发现胞质回缩、细胞间隙增大后;应立即中止消化..4吸出消化液;向瓶内加入Hanks液少量;轻轻转动培养瓶;把残留消化液冲掉;然后再加培养液..如果仅使用胰蛋白酶消化;在吸除胰蛋白液后;可直接加入少量含血清的培养液;终止消化..5使用弯头吸管;吸取瓶内培养液;按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞;使之从瓶壁脱离形成细胞悬液..吹打时动作要轻柔;以防用力过猛损伤细胞..6用计数板计数后;分别接种于新的培养瓶中;置CO2培养箱中进行培养..7细胞培养换液时间应根据细胞生长的状态和实验要求来确定..一般2～3d后应换一次生长液..待细胞铺满器皿底面;即可使用；也可继续传代扩大培养或换成维持液..2.注意事项1掌握好细胞消化的时间;消化时间过短时;细胞不宜从瓶壁脱落;过长的消化会导致细胞脱落、损伤..2掌握好消化浓度;当消化液浓度过高时;消化时间应缩短;过低时细胞消化时间相对延长..三、体内细胞培养及其操作步骤1．瘤细胞悬液接种1无菌选取生长良好有光泽;淡红色瘤组织或对数生长期培养瘤细胞..2在PBS中将瘤组织剪碎后用匀浆器研磨;经80～100目筛网过滤成细胞悬液..3培养细胞应用PBS洗两遍..4计数并调整细胞浓度至107～108／ml..5常规消毒后;于接种部位通常为背部或腋窝腹股沟皮下用医用注射器皮下潜行一段后注入细胞悬液0.1ml／部位;＞106细胞..初次接种成功率低;细胞数尽可能多一些..6次日注意观察动物一般情况..初次接种一般有一段较长的潜伏期;以后随着传代潜伏期逐渐缩短;最后固定为一个相对稳定的时间..2．腹水瘤的建立与腹水瘤的接种将实体瘤细胞直接种于小鼠腹腔、腹壁或其他部位;引起腹水;腹水中含有瘤细胞;将这种腹水反复传代;即可成为腹水瘤..初次传代时;腹水常呈血性含大量红细胞;反复传代后腹水逐渐变成乳白色..腹水瘤的接种过程如下..1将冻存或培养的腹水瘤细胞离心和洗涤;进行细胞计数..2消毒动物;左下腹穿刺接种106腹水瘤细胞..3接种腹水瘤细胞后约7~12d;待小鼠腹部明显膨大..用碘酒棉球消毒小鼠腹部;用9号针头抽取腹水;也可行腹部解剖后;用滴管吸取..每只小鼠可抽3~5ml..4抽取的腹水经3000rpm离心15min;收集上清;分装冻存备用..四、培养细胞的冻存及复苏细胞低温冻存是培养室常规工作和通用技术..细胞冻存在-196℃液氮中;储存时间几乎是无限的..细胞冻存及复苏的原则是慢冻快融..1．冻存细胞1选对数增生期细胞证明无支原体污染;在冻存前1d换液..2按常规方法把培养细胞制备成悬液;计数;使细胞密度达5×107／ml 左右密度;离心;去上清..3加入配制好的冻存液培养液6.8ml;小牛血清2ml;DMSO 1ml;5.6%NaHCO3 0.1ml;按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中;然后用吸管轻轻吹打令细胞重悬..冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜DMSO或甘油;可使冰点降低;使细胞内水分在冻结前透出细胞外..4分装于无菌冻存管中;每管加1.5m悬液..5旋好冻存管并仔细检查;一定要盖紧;做好标记..6冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中;按-1℃／min的速度;在30～40min时间内;下降到液氮表面;再停30min后;直接投入液氮中..要适当掌握下降冷冻速度;过快能影响细胞内水分透出;太慢则促进冰晶形成..操作时应戴防护眼镜和手套;以免液氮冻伤..2.复苏细胞1从罐中取出冻存管..2迅速放入36℃～37℃水浴;不时摇动;使其急速融化;30～60s内完成..3冻存管用70％酒精擦拭消毒后;打开盖子;用吸管将细胞悬液注入离心管中;再滴加10ml培养液..4低速离心500～1000r／min 5min;去上清后再用培养液洗一次..5用培养液适当稀释后;装入培养瓶37℃培养;次日更换一次培养液后;继续培养..以后仍按常规进行培养..冻存细胞数量要充分;密度应达到107／ml;在融后稀释20倍时;仍能保持5×105／ml数量..。