进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法

*基金项目：宁波局重大科技项目（No.K01-2002）。

闻伟刚:男,1975生,博士。E-mail:.收稿日期:2003-04-28接受日期:2003-06-09

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(2):167~169

·研究论文

·进口饲料中牛、

羊源成分的PCR 同时检测方法*闻伟刚赵秀玲贺水山

杜华宏黄绍棠

（宁波出入境检验检疫局，

宁波315012）摘要：为防止疯牛病和痒病的传入，研究提供了一种利用Chelex-100快速提取动物基因组DNA 的方法，并依据牛、羊线粒体基因的同源性序列片段，设计1对通用引物，通过PCR 扩增，实现了对进境饲料中牛、羊源成分的同时检测。该方法简单、快捷，在口岸检疫部门中有一定的推广价值。

关键词:Chelex-100;PCR;通用引物;牛、羊源成分;同时检测

Simultaneous Detection of Bovine and Sheep Derived Materials

from Imported Feedstuff by PCR

WEN Wei-Gang ZHAO Xiu-Ling HE Shui-Shan

DU Hua-Hong HUANG Shao-Tang

（Ningbo Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningbo 315012,China

）

In order to control the spread of bovine spongiform encephalopathy and scrapie,a method has been developed for

simultaneous detection of the bovine and sheep derived materials from imported feedstuff,in which Chelex-100as matrix for fast extractfion of animal genomic DNA was adopted and a pair of common primers designed on the homological sequence of bovine and sheep mitochondrial DNA were used for PCR.This method is of great value to quarantine department for its simple and rapid

detection.

Chelex-100;PCR;common primers;bovine and sheep derived materials;simultaneous detection

由于疯牛病和痒病的朊病毒能够通过肉骨粉等

动物源性饲料传播[1]，因此，对进口饲料中牛、羊源成分的检测是防止疯牛病和痒病传入我国的一个重要措施。

目前，国内外对饲料中牛、羊源成分的检测方法主要有显微镜观察法、ELISA 方法和PCR 方法[2]。Tartaglia 等[3]对牛源成分检测以及Herman [2]对羊源成分检测分别做了研究；国内检验检疫系统在参照Tartaglia 方法的基础上制订了饲料中牛、羊源成分PCR 检测的行业标准[4]。本研究在依据该标准进行日常检测的基础上，对该标准方法作了全新的改进，使之更具有简单和快捷，供检测工作者参考和应用。

1材料和方法

1.1材料

牛(黄牛、水牛、奶牛)和羊（绵羊、山羊）

的肉骨头由宁波市农业局提供，猪、狗、鸡等动物的肉骨头

均购自宁波当地的超市，经120℃高温烘烤5h ，在研钵中磨成细粉。鱼粉为日常检测的进口样品，来自美国、智利、俄罗斯和日本等国。

牛、羊肉骨粉分别按重量百分比与鱼粉混合成1%、0.1%和0.01%的样品，用于灵敏度测试。

PCR 引物由上海生工合成。Chelex-100由宁波

市公安局刑事科学技术研究所惠赠。

DNA 聚合酶和dNTP 等试剂购自上海博亚生物技术公司。1.2牛、羊成分的PCR 同时检测

1.2.1基因组DNA 提取取磨碎的肉骨粉30mg ，加入200滋L Chelex-100（5%），同时加入蛋白酶K 至终浓度为0.5mg/mL ，于56℃水浴30min ，然后100℃水浴8min ，12000r/min 离心5min ，此时上清液即可作为PCR 模板。1.2.2PCR 扩增牛、羊通用引物序列为：

农业生物技术学报2004年

BS1：5′-ATGCGGTTATATAAGATTGCT-3′；

BS2：5′-GATCTATTATAGAATTCTCAATATGATA-3′。

其预扩增产物大小为233bp。PCR反应体系包括：4μL模板，引物BS1（10mmol/L）与BS2（10 mmol/L）各1μL，dNTP（10mmol/L）1μL，10×PCR buffer（Mg2+plus）5μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.4μL，重蒸水37.6μL，总体积为50μL。PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，35个循环；最后72℃延伸5min。同时，设立阳性对照和空白对照，阳性对照为牛特异性引物和羊特异性引物分别扩增牛和羊的产物[4]。

1.3PCR结果分析

1.3.1PCR产物电泳检测PCR反应结束后，取20μL扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，在SX-300凝胶成像系统上观察并记录结果。

1.3.2PCR产物的酶切验证PCR产物可以直接选用限制性内切酶Ⅰ进行酶切分析，该酶可将羊的PCR扩增产物酶切为168bp和65bp2个片段，而不能酶切牛的PCR产物。也可以通过简单纯化获得更好的图谱效果。纯化方法如下：100μL PCR产物经氯仿抽提1次，取上清液，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀过夜；12000r/min离心10min，70%乙醇洗1遍，沉淀最后溶于20μL重蒸水中。酶切反应体系包括：10μL PCR产物，2μL内切酶（5U/μL），2μL酶切缓冲液，6μL重蒸水，总反应体积为20μL。37℃温育4h以上，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.3.3PCR产物的测序PCR产物纯化后，其核苷酸序列由上海博亚生物技术有限公司进行单向测定，序列分析采用BioEdit软件，同源性比较在GenBank()中通过Blast 程序进行。

2结果和分析

2.1引物设计

选择牛Y染色体基因上的保守区域作为PCR 检测的目标序列[5,6]。通过网上检索，获得牛线粒体基因部分核甘酸序列，并应用Blast程序比较了该序列与其它动物的基因组DNA序列之间的同源性，结果发现，它与羊的线粒体部分基因有一定的同源性。比较结果如图1。选择同源性较高的29位点到49位点（BS1）和244位点到266位点（BS2）处的两条序列作为扩增牛、羊成分的通用引物。

2.2PCR扩增结果

PCR扩增结束后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳显示，以牛、羊基因组DNA为模板的样品都能够特异性扩增得到分子量为233bp大小的条带，而猪、狗、鸡、鱼等均没有特异性条带产生，说明这对引物对牛、羊有很好的特异性，也符合同源性检索结果。同时，从图中可以看到，牛特异性引物和羊特异性引物也都扩增得到各自的特异性条带，分子量分别为271和294bp，这表明PCR结果准确可靠。

2.3PCR结果的验证

通过限制性内切酶Ⅰ的酶切，牛的PCR产物未被酶切，羊的PCR产物被酶切成168和65bp 两个不同大小的片段，符合预期的结果（图3）。PCR产物经过测序和同源性比较后发现，黄牛、水牛和奶牛的核苷酸序列与目标基因序列的同源性分别为93.6%、90.1%和98.7%，绵羊和山羊的核苷酸序列与目标基因序列的同源性分别为97.9%和90.1%。排除品种之间的碱基差异以及PCR扩增和测序中的碱基错配等因素，可以完全确证PCR扩增产物是牛、羊的特异性产物。

图1.牛和羊线粒体基因部分序

列的比较

parison of partial

nucleotide sequences of

mitochondrial DNA of bovine and

sheep

下划线代表PCR引物位置；.代表相

同的碱基；-代表缺失的碱基。The

primers′sequences are underlined;

The identical bases are marked as.;

The base deletions are marked as

-. 168