重组肌红蛋白的原核表达_纯化及其冻干质控品的制备_任艳娜

・研究报告・生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第8期急性心肌梗死（Acute myocardiac infraction，AMI）是严重危害人类健康的常见疾病之一。

近年来，在我国该病的发病率呈明显升高的趋势。

肌红蛋白（Myoglobin，Myo）是AMI 发生时最早升高的心肌损伤标志物之一，在发病2 h 内血清中Myo 的含量开始增加，6-9 h 达到峰值。

1975年，Kagen 等［1］首次提出血清Myo 的测定可用于急性心肌梗塞的诊断，收稿日期： 2013-12-18作者简介：任艳娜，女，硕士研究生，研究方向：兽医药理学与毒理学；E -mail ：yanna052267213@ 通讯作者：唐时幸，男，博士，研究方向：生物医学；E -mail ：tang.shixing@重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备任艳娜 才蕾 武建伟 钱伟 张荣华 王继华 唐时幸（广州万孚生物技术股份有限公司，广州 510663）摘 要： 旨在为市场提供一种廉价、稳定、特异性强、灵敏度高的肌红蛋白质控品；将密码子优化后的肌红蛋白序列通过两步法进行化学合成，并连接到pET -28a 表达载体上，转入大肠杆菌BL21（DE3），用0.5 mmol/L IPTG 37℃诱导表达；目的蛋白经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析进行纯化后，对其特异性进行检测，并研究蛋白稀释液的配方和优化冻干工艺，最后对冻干质控品的稳定性进行检测；结果显示目的蛋白分子量大小为20 kD 左右，具有较强的特异性。

蛋白冻干后具有很好的形态，37℃可以稳定保存10 d ；25℃、4℃可以稳定保存4个月以上。

该蛋白的冻干制品成本低、稳定性好、特异性强、灵敏度高，可用于定性定量肌红蛋白检测试剂盒的质控品。

关键词： 重组肌红蛋白 原核表达 纯化 冻干 质控品The Expression and Purification of Recombinant Myoglobin andPreparation of Its Quality Control SamplesRen Yanna Cai Lei Wu Jianwei Qian Wei Zhang Ronghua Wang Jihua Tang Shixing（Guangzhou Wondfo Biotech Co.，Ltd ，Guangzhou 510663）Abstract: We intended to provide a cheap, stable, highly specific and sensitive lyophilized protein as quality control for diagnositic kits. The myoglobin gene code was optimized and two -step methods were used in this study for the synthesis of myoglobin gene. The DNA fragment of myoglobin was inserted into pET -28a vector forming a recombination plasmid, then, transformed into BL21（DE3）bacteria. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG and purified by Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）. After confirming its specificity, we studied the stability of the lyophilized protein at different storage temperatures（37℃, 25℃, 4℃）. Results showed that the target protein is approximately 20 kD with high specificity, good morphology and stability after freeze -drying under the optimized conditions and protein diluting solution. The lyophilized myoglobin protein with low cost, good stability, high specificity and sensitivity, canbe used as quality control for both qualitative and quantitative myoglobin testing kits.Key words: Recombinant Myoglobin Prokaryotic expression Purification Lyophilized Quality control samples检测病人的Myo 水平可以快速确诊并及时治疗，从而降低病死率［2］。

此外，Myo 是判断急性心肌梗塞患者有无再灌注的最好的无创指标之一。

溶栓治疗开始后90 min，如果肌红蛋白升高近4倍，则可比较准确判定梗死冠脉已完全开通。

因此，肌红蛋白的检测对急性心肌梗死的诊断、预测心肌梗塞面积、指导溶栓治疗及其预后具有重要意义［3，4］。

DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2014.08.019生物技术通报Biotechnology Bulletin2014年第8期190肌红蛋白存在于哺乳动物肌肉中，具有在肌细胞内转运和贮存氧的功能［5］，由一条多肽链构成，有153个氨基酸残基和一个血红素辅基，分子量为17.8 kD［6，7］。

人体心肌、骨骼肌内含有大量肌红蛋白，正常人的血液中很少，主要由肾脏代谢并排泄。

肌红蛋白增高见于急性心肌梗死早期、急性肌损伤、肌营养不良、肌萎缩、多发性肌炎、急性或慢性肾功能衰竭、严重充血性心力衰竭和长期休克等［8-11］。

市场上的肌红蛋白质控品均为进口血源型人肌红蛋白，来源受限，价格昂贵，购买渠道难以保证。

血源型人Myo不稳定，极易降解，严重限制肌红蛋白诊断试剂的发展［12］。

虽然国内外通过基因工程手段表达重组肌红蛋白的报道很多，但所表达的Myo 稳定性有待进一步提高，其表达条件仍需优化［6，13］。

本研究通过基因工程技术，对该蛋白进行体外表达、纯化并优化冻干工艺，旨在为市场提供一种表达效率高、重复性好，蛋白活性高和稳定性高，接近于血液来源样品的产品，填补市场高品质重组肌红蛋白质控品的空白，为我国肌红蛋白诊断试剂和质控品开发提供保障。

1 材料与方法1.1 材料DNA Ex Taq酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司；细菌基因组提取试剂盒、DNA 回收试剂盒购自Promega公司；小量质粒提取试剂盒购自北京奇华盛；中分子量蛋白Marker、预染蛋白Marker购自Fermentas公司；甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、甲双叉丙烯酰胺、考马斯亮兰、丙烯酰胺、IPTG购自Sigma公司；质粒pET-28a、大肠杆菌E.coli BL21（DE3）、大肠杆菌E.coli DH5α为本实验室保存；目的基因由Genewiz公司合成；肌红蛋白抗体购自Hytest公司；辣根酶标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；CHRIST ALPHA1-2型冷冻干燥机购自Martin Christ公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法1.2.1 表达载体pET28a-Myo的构建 通过NCBI获取人源肌红蛋白（Myo）的编码序列后，根据大肠杆菌偏爱性，运用密码子优化工具http：//www.jcat.de/Start.jsp对序列进行优化；并利用化学合成的技术手段获得目的基因片段。

由Genewiz公司合成的优化密码子基因片段经Bam H I和Hin d III双酶切，酶切产物纯化，取3 μL与经同样限制性内切酶双酶切后的质粒pET-28a，16℃连接过夜。

热激法将连接产物转化感受态大肠杆菌株E.coli DH5α，涂布于含50 μg/mL Kan+的LB平板，挑取阳性克隆经菌落PCR和酶切初步鉴定后，送Invitrogen公司测序。

鉴定正确后得到重组表达载体命名为pET28a-Myo。

1.2.2 Myo的诱导表达 将测序正确并经过酶切鉴定的阳性重组质粒用热激发转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3）感受态细胞，复苏后涂布于Kan+浓度为50 μg/mL的LB琼脂培养基上，37℃培养16 h。

挑取4个单菌落接种至含50 μg/mL Kan+的5 mL LB 液体培养基中，37℃，200 r/min培养过夜。

次日，以1∶100比例转接于5 mL新鲜含50 μg/mL Kan+的LB培养基中，37℃，200 r/min培养至OD600≈0.8时加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37℃诱导培养4-5 h。

SDS-PAGE检测4株菌重组蛋白的表达情况，并筛选高效表达的重组菌株。

挑选高效表达菌株进行表达条件优化和扩大培养。

1.2.3 Myo的纯化收集 扩大培养的菌体，在冰浴条件下超声破碎（超声条件为：超声5 s，间隔12 s，共超声15 min），12 000 r/min 4℃离心15 min，上清经Ni Sepharose 6 Fast Flow（FF）亲和层析纯化。

上样缓冲液为20 mmol/L PB，5 mmol/L咪唑pH7.4；平衡缓冲液为20 mmol/L PB，250 mmol/L咪唑 pH7.4；洗脱缓冲液为20 mmol/L PB，500 mmol/L咪唑pH7.4。

1.2.4 Myo特异性检测 为了检测Myo的特异性和灵敏度，实验室用购自Hytest的肌红蛋白抗体1 000倍稀释后做一抗，进行Western blot检测。

1.2.5 Myo的活性检测 将原浓度重组肌红蛋白分别稀释若干倍后（浓度H、浓度M、浓度L），用广州万孚生物技术公司研发的肌红蛋白检测试剂盒（荧光定量免疫层析法）对该蛋白的活性进行检测，从而确定适当的稀释比例进行后续试验。

1.2.6 Myo冻干工艺的筛选 为了增加蛋白的稳定性，筛选蛋白的冻干工艺。

分别用小牛血清和健康人血浆作为稀释液，加入赋形剂和保护剂后，分别2014年第8期191任艳娜等：重组肌红蛋白的原核表达、纯化及其冻干质控品的制备将蛋白稀释上述确定的3个浓度（浓度H、浓度M、浓度L）进行冻干，并通过冻干外观、活性收率和37℃ 1周破坏试验（在37℃恒温培养箱中，每天取出一支进行活性检测）筛选最佳冻干工艺。