论文定稿

Pb，Cu污染对土壤中蔗糖酶活性的影响研究
王子名
（陕西理工学院化学与环境科学学院环科101班，陕西汉中 723000）
指导教师：汤波
[摘要]通过对土壤中蔗糖酶活性的测定,研究了重金属离子(Pb2+、Cu2+)单因素污染、复合污染对蔗糖酶活性的影响,进而找出重金属污染程度与土壤酶活性的关系,为建立土壤中的酶活性可以表征重金属污染程度的生化指标平台提供试验依据。

实验方法采用3,5-二硝基水杨酸比色法。

结果表明, 重金属Cu2+对蔗糖酶具有抑制作用,但未达到显著水平；蔗糖酶活性随着Pb2+浓度的增加有一定的上升，但趋势不明显。

重金属复合污染对土壤酶具有一定的的抑制作用，且复合污染抑制作用大于单一污染时的抑制作用。

[关键词]重金属污染; 土壤; 蔗糖酶酶活性
1引言
1.1研究背景及研究意义
1.1.1研究背景
随着社会的快速发展及城市化进程的不断加快，对土壤的利用强度不断增加，在工农业生产、矿产资源开采与冶炼过程中，土壤受到了严重的污染，尤其是重金属污染。

重金属污染已成为当今土壤污染中面积最广、危害最大的环境问题之一。

据估计，全球每年释放到环境中的有毒重金属高达数百万吨，其中As为12.5万t，Cd为3.9万t，Cu为14.7万t，Pb为34.6 万t，Ni为38.1万t，Hg为1.2万t[1]。

农业部调查表明：我国污灌区面积约140万hm2，受重金属污染的土地面积占污染总面积的64.8%，其中轻度污染占46.7%，中度污染占9.7%，严重污染面积占8.4%，其中以Hg和Cd的污染面积最大[2]。

目前，全国受到Hg污染的耕地约有3.2 万hm2，涉及15个省市的21个地区，受到Cd污染的耕地约有1.3万hm2，涉及11个省市的25个地区[3]。

据统计，全国每年被重金属污染的粮食多达1200万t，因重金属污染导致的减产超过 1000万t，合计经济损失达200亿元，重金属污染造成了巨大的损失[4].
土壤重金属污染不仅能降低土壤肥力、农作物的产量和质量，还会通过各种途径进入水和大气，造成污染，并通过食物链进入人体内，危及人类的健康甚至生命。

另外，重金属污染因其具有隐蔽性、潜伏性和难降解性，造成的后果严重。

因此土壤中的重金属污染的指示和评价研究对土壤重金属的预防和防治具有十分重要的意义.
所谓土壤酶，是指土壤中产生的一种生物化学反应的催化剂，主要来自于微生物的活动及植物根系的分泌，它参与土壤中一切生化反应，直接参与土壤的物质循环和能量代谢过程[5]，其活性大小能较敏感地直接反映土壤中发生的生物化学变化的强度和方向。

研究表明，土壤酶活性与土壤重金属之间存在一定剂量关系。

由于酶类对重金属离子的抑制或激活作用比较敏感，且其活性变化直接影响着从土壤中获取养分的作物的生长，因而土壤酶活性的测定将有助于判明土壤中重金属污染的程度及其对土壤质量和作物生长的影响[6].有研究表明，土壤酶活性的变化可作为土壤环境质量监测的生物学指标[7-9]。

本文选取与土壤生态环境生物转化密切相关的蔗糖酶为研究对象，通过实验室模拟重金属Pb2+、Cu2+单一及复合污染下蔗糖酶活性的动态变化，探讨Pb2+、Cu2+单一及复合污染对酶产生的不同效应，以此为基础寻找能够表征土壤重金属污染的酶活性指标，为土壤重金属污
染的监测和评价，进一步为土壤重金属污染的控制与治理提供科学依据和理论基础.
1.1.2研究意义
随着土壤环境污染问题的日益严重，土壤重金属污染的防治问题成为生态环境修复研究领域的重要内容之一，其中利用土壤酶活性来表征土壤重金属污染程度是其中一个尤为重要的方面[10,11]。

通过考查土壤重金属含量与土壤酶活性之间的关系，可以在一定程度上反映重金属污染的土壤环境容量，为土壤质量评价提供参考。

通过研究重金属种类与土壤酶活性的线性关系，寻找能够指示土壤污染程度的特征土壤酶，将其一定范围的活性变化值作为重金属污染的预警阈值，确定其预警指标和分级指标。

总之，加强重金属污染与土壤酶活性关系的研究，对于阐明和揭示土壤环境污染效应机理具有重要的指导意义，为进一步研究利用土壤酶活性评价土壤重金属污染的可行性提供理论基础，为完善土壤重金属污染酶监测指标体系、建立土壤生物安全预警系统提供科学依据。

1.2国内外研究动态
1.2.1国外研究动态
对土壤酶活性的研究过去多集中在土壤肥力等方面，而其在环境中的应用是随着环境问题的日益严重才逐渐受到人们的关注，很多学者研究发现，重金属对土壤酶活性有一定的抑制或者激活作用。

Kumar等（1986）发现不同的金属离子对脲酶活性的抑制存在明显差异，其作用的顺序为： Ag+≥Hg2+>Au3+>Cu2+>Cu+>Co2+>Pb2+>As3+>Pb+>Cr3+>Ni2+> 其它离子[12]。

Todorov 等（1987）认为 Pb 对蛋白酶活性没有影响，而明显激活脲酶活性，抑制淀粉酶[13]。

Lebedeva（1995）发现重金属对土壤酶活性呈现明显的剂量效应，其研究表明质量分数为20mg/kg的Cd不会引起脲酶活性明显降低，10～150mg/kg的Zn和80～100mg/kg的Pb则使脲酶活性显著降低[14]。

Speir等（1999）和Morenoa等（2001）研究的结果也表明，土壤重金属Cr6+、As5+及Cd 对土壤酶活性有明显的抑制作用。

由于土壤酶活性监测土壤重金属污染操作简捷，反应快捷灵敏等优点，众多学者对采用土壤酶活性监测土壤重金属污染进行过积极探索。

这些研究表明，土壤酶活性对重金属污染（如 Hg、Cd、As、Cr、Pb 和 Zn 等）的敏感性很强，可利用土壤酶活性监测重金属污染区的污染状况。

1.2.2国内研究动态
国内众多学者也对土壤酶活性和重金属的关系进行了大量研究。

许多学者通过重金属单一污染及复合污染对土壤酶活性的研究表明，土壤重金属对土壤酶活性具有一定的抑制或激活作用，土壤重金属与土壤酶活性之间存在一定的相关关系[15-17]。

用土壤酶活性来监测重金属污染的方法也有少量研究。

周凯礼等提出用土壤脲酶作为土壤Hg污染的评价指标[18]；李博文等的研究表明，过氧化氢酶、脲酶活性与碱性磷酸酶或转化酶活性可构成综合评价体系，反映土壤Cd、Zn、Pb污染含量以及土壤Cd-Zn、Zn-Pb 复合污染效应，用其评价土壤Cd、Zn、Pb复合污染具有一定的可行性[19]。

高大翔等通过室内模拟重金属污染土壤发现 Hg、Cd、Hg+Cd 浓度与脲酶、脱氢酶活性存在着显著的相关，并认为脲酶和脱氢酶活性均可作为土壤 Hg、Cd 及 Hg+Cd 污染程度的生化监测指标[20]。

黄永杰等认为土壤酶活性可作为检测土壤中重金属 Cu 污染程度的参考指标之一[21]。

然而这些研究多集中于对单一重金属污染的评价，而对于复合污染评价的研究还很少。

2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1土壤采集与预处理
实验室模拟所用土壤样品采自汉中市汉台区雷家巷周围地区的耕地，该地区耕地正常灌溉，无污灌历史，受重金属污染较轻。

选择远离交通干道的耕地进行土壤样品的采集。

采集深层洁净的土壤去掉植物残体和杂物后，装入塑料袋，带回实验室。

将带回实验室的土样倒于塑料膜上，摊成约2cm厚的薄层，并间断地进行翻动，使其自然风干。

在风干过程中，拣出碎石，沙砾及植物残体等杂质。

样品风干后，研磨，过100目筛，置于封口袋中，用于实验室培养和各项测定分析。

2.1.2 主要实验仪器和器材：
表2.1 实验中主要仪器和器材
仪器厂家
EL-104型电子天平（精确到 0.0001 g）上海梅勒-托利仪器有限公司
电热恒温水浴锅北京科伟永兴仪器有限公司
722E型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司
恒温培养箱广东省医疗器械厂
100目筛上虞市道墟张兴纱筛厂
2.1.3实验中的主要药品：
表2.2 实验中主要药品
名称分子式纯度
分子量
（g/mol）
试剂公司
二水氯化铜CuCl2·2H2O AR 170.48 西安化学试剂厂
硝酸铅Pb﹙NO3﹚2AR 331.21 西安化学试剂厂蔗糖C12H22O11AR 342.29 广东·汕头市西陇化工厂葡萄糖C6H1206AR 180.16 天津市恒兴化学试剂厂
甲醇CH3OH AR 32.04 天津市富宇精细化工有限公
司
二硝基水杨酸C7H4N2O798% 228.12 上海科丰化学试剂有限公司
氢氧化钠N A OH AR 40 天津市恒兴化学试剂制造有
限公司
酒石酸钾钠C4H406KN A·4H20 99.0% 282.22 天津市福晨化学试剂厂磷酸氢二钠N A2HPO4·12H2O AR 358.14 广东·汕头市西陇化工厂磷酸二氢钾KH2PO4AR 136.9 天津市东丽区心中科技园区
苯酚C6H5OH AR 94.11 天津市东丽区天大化学试剂
厂
甲苯C6H5CH3AR 92.14 天津市化学试剂厂
2.2 实验设计
预处理后的土用于进行实验室模拟，人为添加不同浓度的重金属，根据不同处理条件下土壤酶活性的变化，来研究重金属Cu2+和Pb2+单一污染及复合污染对土壤蔗糖酶活性的影响。

（1）重金属溶液浓度设计
重金属单一污染各设计5个浓度水平，浓度设计见表2.3；复合污染合见表2.4，每个浓度水平设3个平行实验。

其中Cu2+以入CuCl2·2H2O加入，Pb2+以Pb﹙NO3﹚2加入。

表2.3 重金属单一污染浓度设计
元素浓度(mg/kg) 元素浓度(mg/kg)
Cu-1 50 Pb-1 0
Cu-2 100 Pb-2 200
Cu-3 150 Pb-3 400
Cu-4 200 Pb-4 600
Cu-5 250 Pb-5 800
表2.4 重金属Pb和Cu交叉污染浓度设计
重金属Pb-2 Pb-3 Pb-4 Pb-5
Cu-1 （Cu-1，Pb-2）（Cu-1，Pb-3）（Cu-1，Pb-4）（Cu-1，Pb-5）Cu-2 （Cu-2，Pb-2）（Cu-2，Pb-3）（Cu-2，Pb-4）（Cu-2，Pb-5）Cu-3 （Cu-3，Pb-2）（Cu-3，Pb-3）（Cu-3，Pb-4）（Cu-3，Pb-5）Cu-4 （Cu-4，Pb-2）（Cu-4，Pb-3）（Cu-4，Pb-4）（Cu-4，Pb-5）
（2）培养时间设计
分别称取将过100目筛子的土壤样品土样5 g于锥形瓶中，根据设计的重金属浓度分别向土壤中添加重金属溶液，充分混匀，并调节土壤水分至60%饱和含水量，置于37℃的恒温培养箱中培养。

分别于第1、3、5天取样测定土壤蔗糖酶的活性。

2.3测定方法
2.3.1葡萄糖标准曲线的制作
①预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

②然后准确称取50 mg葡萄糖与烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存约一个星期）。

若该溶液发生浑浊和出现絮状物，则应弃之，重新配置。

③分别吸1mg/mL的标准葡萄糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8于试管中，在补加蒸馏水至1mL,加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min(从试管放入重新沸腾时算起)，取出立即冷水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。

2.3.2蔗糖酶活性的测定—3,5-二硝基水杨酸比色法
蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，而3,5-二硝基水杨酸与葡萄糖在强碱溶液中在沸水浴中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物。

该有色物质在540nm处有最大吸光度，且在一定范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定吸光度，查对标准曲线并计算，
即可求出样品中还原糖的量。

①称取5g 土壤，置于50mL 三角瓶中，注入15mL8%蔗糖溶液，5mLpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。

摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养1d 、3d 、5d 。

②到时取出，迅速过滤。

从中吸取滤液 1 mL ，注入50 mL 容量瓶中，加入 3 mL DNS 试剂，并在沸腾的水浴锅中加热 5 min
③随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min 。

溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色
④最后用蒸馏水稀释至50mL ，并在分光光度计上于540nm 处进行比色。

（为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需座无土壤对照；如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应增加分倍数或减少培养的土样。

）
③结果计算：蔗糖酶活性(M )以1d 、3d 、5d ，1 g 干土生成葡萄糖的毫克数表示。

--a M=
a a v n m
⨯⨯样品无土无机质
式中:a 样品—样品吸光值由标准曲线求得的葡萄糖毫克数，mg ；
a 无土—无土对照吸光值由标准曲线求得的葡萄糖毫克数，mg ； a 无基质—无基质对照吸光值由标准曲线求得的葡萄糖毫克数，mg ； v —显色液体积，mL ；
n —分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积；
m —烘干土重，g 。

3数据处理与分析
3.1葡萄糖标准曲线
表3.1 不同浓度葡萄糖溶液的吸光度
葡萄糖浓度（mg/mL ） 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08
吸光值
0.009 0.124 0.236 0.343 0.435 0.549 0.641
0.763
00.20.40.60.8
10
0.02
0.040.060.080.1
葡萄糖浓度（mg/mL）
吸光度
图3.1 葡萄糖标准曲线
3.2不同浓度重金属与土壤蔗糖酶活性的关系
3.2.1重金属Cu 2+
对蔗糖酶活性的影响
表3.2 列出了蔗糖酶在重金属Cu 2+
不同浓度及不同培养时间下生成的葡萄糖的含量
编号 浓度(mg/kg)
1d
3d
5d
生成葡萄糖的含量（mg ）
Cu-1 50 15.8 127.8 342.4 Cu-2 100 11.0 63.6 306.0 Cu-3 150 12.2 57.4 190.8 Cu-4 200 10.4 69.8 279.8 Cu-5
250
7.0
62.0
210.0
5010015020025030035040050
100
150200
250
Cu浓度（mg/kg）
葡萄糖生成量（m g ）
图3.2 蔗糖酶在重金属Cu 不同浓度及不同培养时间下生成的葡萄糖的含量
由表3.2和图3.2反映的蔗糖酶活性的变化情况来看:(1)蔗糖酶活性随着Cu 2+
浓度的增加有一定的下降趋势（2）从时间来看，相比较于第一天，第三天酶活性平均增幅为580%，相比较于第三天，第五天酶活性平均增幅为264%，由此得出：随着时间梯度的增加，酶活性是在不断上升，但上升幅度却在逐渐减小，最后趋于平缓。

3.2.2重金属Pb 2+
对蔗糖酶活性的影响
表3,3 列出了蔗糖酶在重金属Pb 2+
不同浓度及不同培养时间下生成的葡萄糖的含量
编号 浓度(mg/kg)
1d
3d
5d
生成葡萄糖的含量（mg ）
Pb-1 0 59.6 134.4 224.2 Pb-2 200 156.6 200.8 237.0 Pb-3 400 304.0 221.0 330.0 Pb-4 400 323.6 220.4 335.6 Pb-5
800
337.8
195.0
343.0
501001502002503003504000
200
400600800Pb浓度（mg/kg）
葡萄糖生成量(m g )
图3.3 蔗糖酶在重金属Pb 2+
不同浓度及不同培养时间下生成的葡萄糖的含量
由表 3.3和图 3.3反映的蔗糖酶活性的变化情况来看：(1)从浓度来看，当浓度低于
400mg/kg 时，蔗糖酶活性随着Pb 2+
浓度的增加上升趋势较快;当浓度大于400mg/kg 时，蔗糖
酶的活性随着浓度的增加趋于平缓甚至下降。

由此说明低浓度Pb 2+
对蔗糖酶活性有激活作
用，高浓度Pb 2+较低浓度Pb 2+
对蔗糖酶活性激活作用不明显甚至有抑制作用（2）从时间来看，当浓度低于400mg/kg 时，蔗糖酶活性随着时间的增加而增加; 当浓度高于400mg/kg ，随着时间的增加蔗糖酶活性先下降然后上升。

3.2.3重金属Pb 2+和Cu 2+
复合污染对土壤蔗糖酶活性的影响
表3.4 重金属 Pb 2+和Cu 2+
复合污染下生成的葡萄糖含量（mg ）
重金属 Pb-2 Pb-3 Pb-4 Pb-5 Cu-1 16.8 20.7 20.6 19.4 Cu-2 15.6 24.8 15.7 10.2 Cu-3 15.8 24.0 10.2 6.3 Cu-4
16.8
22.6
9.8
7.5
图3.4 重金属Pb 2+
和Cu 2+
交叉污染下生成的葡萄糖含量
由表3.4反应的蔗糖酶活性的变化情况来看，(1)当Cu 2+浓度一定时，蔗糖酶活性随着Pb 2+浓度的增加先上升然后下降，说明低浓度Pb 2+对复合重金属下蔗糖酶的活性有激活作用，高浓度Pb 2+对复合重金属下蔗糖酶的活性有抑制作用；(2)当Pb 2+浓度一定时，随着Cu 2+浓度的增加蔗糖酶活性总体具有下降趋势。

4. 结论及展望
4.1结论
重金属浓度会影响土壤酶的活性，当重金属含量较低时，对土壤酶有一定的促进作用，超过一定含量，会抑制土壤酶的活性。

通常情况下，重金属复合污染的生态效应和毒性效应较单一污染更为复杂，复合污染比单一污染对酶的影响更显著。

通过向土壤中人为添加不同种类不同浓度的重金属，根据土壤酶活性的变化及重金属与土壤酶活性之间的分析，得到以下结论：
（1）短时间内重金属对土壤酶活性的影响随着时间的延长而增大，但随着时间的继续增加基本上趋于平衡。

（2）重金属Cu 2+对蔗糖酶具有抑制作用,但未达到显著水平；蔗糖酶活性随着Pb 2+
浓度
的增加有一定的上升，但趋势不明显。

（3）重金属复合污染对土壤酶具有一定的的抑制作用，且复合污染抑制作用大于单一污染时的抑制作用。

4.2展望
由于土壤重金属污染状况具有时空变换性，其研究需要长时间的监测工作为研究基础，但由于受时间和研究条件等限制，本次研究中还存在一些不足之处。

许多问题还值得进一步深入的研究和探讨。

（1）论文仅对一种土地利用方式—耕地，并只对一定区域—汉中市耕地中的酶活性和重金属进行了研究，而没有与其他利用类型的土地和其他地区土壤中的酶活性和重金属进行对比研究，得出的数据不具有广泛的应用性，只能代表部分地区的特征，不能广泛的应用于其他地区。

（2）对于土壤酶活性指示重金属污染特性，本文虽然验证了土壤酶活性指示重金属污染的可行性，但没有提出土壤酶活性的统一监测方法，另外,土壤酶活性受到环境影响因素较多,对于能否在实际监测过程中，有效控制误差,快速简便的实施等，还有待进一步验证。

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Effects of Heavy Metals (Pb,Cu) on Soil sucrase
Activities
Author: Wang Ziming
（Grade10,Class101,Major Environmental science,Chemical and Environmental Science Dept.Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000,Shaanxi）
Tutor: Tang Bo
[Abstract]Based on the determination of soil invertase activity, studied the heavy metal ions (Pb2 +, Cu2 +) single factor pollution, the influence of compound pollution of invertase activity, and then find out the relationship between the heavy metal pollution and soil enzyme activity, in order to establish the soil enzyme activity can be biochemical index representing the degree of heavy metal pollution platform to provide experiment basis. Experimental methods using 3, 5-2 nitro salicylic acid colorimetry. The results showed that the heavy metal Cu2 + has inhibitory effect on sucrase, but did not reach significant level; Invertase activity increased with the increase of concentration of Pb2 + rose to a certain extent, but the trend is not obvious. Compound pollution of heavy metals on soil enzymes have certain inhibitory effect, and compound pollution inhibition is greater than the single pollution of inhibition。

[Keywords]heavy metal contamination; soil ; Invertase activity。