Rosetta进行大分子建模(中文)-david baker
Rosetta感受态细胞
Rosetta感受态细胞
Rosetta Competent Cell
规格
Rosetta ：10×100μl
pUC19（control vector）：0.1ng/μl, 5μl
保存条件：-80℃
基因型
F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE(argU，argW，ileX，glyT，leuW，proL)(CamR)
说明：华越洋Rosetta 感受态细胞具有氯霉素抗性补充大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子(AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA) 对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，经pUC19 质粒检测转化效率高达109cfu/μg。
操作方法
1. 取100 μl 冰上融化的Rosetta 感受态细胞，加入目DN（质粒或连接产物）并轻轻混匀，冰上静置25分钟。
2. 42℃水浴热激45 秒，迅速放回冰上，静置2 分钟，晃动会降低转化效率。
3. 向离心管中加入700μl 不含抗生素的无菌培养基（2YT 或LB），混匀后37℃，200 rpm 复苏60 分钟。
4. 5000rpm 离心1 分钟收菌，留取100μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB 培养基上。
5. 将平板倒置放于37℃培养箱，过夜培养。
注意事项
1. 感受态细胞最好在冰上融化。
2. 混入质粒或连接产物时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
生物信息学在蛋白质(酶)改造及设计中应用的新进展
生物信息学在蛋白质(酶)改造及设计中应用的新进展孙伟峰;钟文娟;孙彬;伍圆明;苟赟;林泉秀;陈祥贵;刘义【摘要】蛋白质(酶)的改造和设计是人类面对纷繁复杂自然界的一个重大挑战,是自然进化的突发事件,是人类不断掌握自然规律的必然结果,对人类更深入地了解蛋白质结构与功能,促进生物蛋白工业生产具有重大的意义.本文介绍了新型蛋白质(酶)改造和设计的新思路和实施过程,以及目前生物酶改造和设计的一些前沿研究团队和研究成果,以期为生物酶或蛋白质的改造与设计提供借鉴.【期刊名称】《西华大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(035)002【总页数】5页(P67-71)【关键词】生物信息学;蛋白质改造;酶设计【作者】孙伟峰;钟文娟;孙彬;伍圆明;苟赟;林泉秀;陈祥贵;刘义【作者单位】西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039;西华大学食品与生物工程学院,食品生物技术四川省高校重点实验室,四川成都610039【正文语种】中文【中图分类】Q816从1965年首次获得溶菌酶(PDB：HEWL)晶体结构开始[1]，人类就一直试图寻找和掌握蛋白质(酶)折叠成特定构象的奥秘。
从DNA水平、蛋白质的一级序列、二级结构到高级结构，人们一直在不断地探索以求掌握生命的秘密。
由于早期研究条件所限，仅能达到蛋白二级结构肽的设计水平，尽管如此，蛋白质(酶)改造和设计还是取得了丰硕的成果：研究者从7个氨基酸序列形成的α-helix出发，并在此基础上不断改进，成功设计了(helix-loop-helix- loop-helix)和α/β 折叠等新型蛋白[1]，这些经典设计方法一直沿用至今；最近Koga等[2]在《Nature》杂志上报道了关于设计二级结构α-helix和β-sheet的一般规律。
rosetta方法
rosetta方法
Rosetta方法是一种用于预测、设计和分析生物分子系统的算法，包括蛋白质、RNA、DNA、肽、小分子以及非规范或衍生氨基酸。
该方法可以切割目标序列成互相重叠的小碎片，并产生每个碎片的局部二级结构。
然后，使用基于贝叶斯概率理论的能量函数和Monte Carlo片段插入法将这些局部结构组装成模型，并选择最小能量模型。
此外，Rosetta方法使用命令行界面运行，可以在分布式集群超级计算机上使用简单的命令行界面进行操作。
该方法也可以将不同的协议链接在一起以完成更复杂的任务，这些协议可以更改/评估单个单体单元的内部结构，也可以建模/评估两个独立单体之间的相互作用。
Rosetta方法在生物信息学和结构生物学中有着广泛的应用，可以帮助科学家更好地理解生物分子的结构和功能，从而为药物设计、疾病治疗和生物工程提供重要的支持。
rosetta使用手册
rosetta使⽤⼿册Rosetta的使⽤⼿册波兰⼯业⼤学计算机科学研究所智能决策⽀持系统实验室设计的RSES系统作为可选组件，被嵌⼊其计算核⼼。
本⽂中与其相关的算法带有前缀“RSES”。
简介：本⽂件构成了技术参考了Rosetta软件⼿册。
对主要算法及其选项进⾏简要介绍，并给出相关的引⽤⽂献。
本⼿册不应孤⽴的阅读。
读者应参考相关⽂献和相关理论背景。
⼿册中使⽤通⽤的符号和术语。
本⼿册是在假定读者已具有数据挖掘和知识发现的基础。
此外，还必须了解典型的经验模型是如何实现的334。
在参考⽂献[26]中，有Rosetta应⽤的⼩例⼦，还有其如何使⽤等知识，包括对数据分类的验证。
在在Rosetta图形⽤户界⾯，相同的菜单项出现了许多不同类型的对象。
例如，所有的对象在他们的弹出式菜单项都有⼀个“注解... ”。
Rosetta图形界⾯细节：⼀个决策系统可以通过“Open”被读⼊新⼯程中，它将会出现在“Structure”的⼯程树下。
⼯程树的节点可以被收起或打开。
3⼯程项⽬：⼯程描述：项⽬对象是项⽬树顶层结构对象。
根项⽬不能从图形界⾯中删除。
⼀个项⽬可能有数个⼦项⽬。
3.1 ODBC项⽬：ODBC决策表导⼊描述：允许从各种数据源通过“开放式数据库互连”的⽅法导⼊表格数据，如电⼦表格、关系数据库等。
对话框：图1、图23.2 报告描述：这类算法输出关于项⽬的信息和元信息。
该算法函数只做简单的转换，是该算法的附加功能。
可输出XML、HTML格式3.3 注释注释包括⼀般标注信息和⼀个历史记录列表。
部分信息会⾃动⽣成，这有助于⽣成Rosetta系统⽂件。
注释还拥有⼀个⽂件名。
当使⽤保存时，该对象被保存到这个相应位置。
4 决策表信息系统和决策系统都代表相同的结构。
在表中，所有的所有属性值集以整数表⽰。
因此，信息系统在本质上可被看作⼀个整数的矩阵。
表中整数和其在模型中意义的映射关系由和每个信息系统相关的数据字典处理。
关于数据字典的描述见4.1节。
蛋白质结构预测与设计技术的研究与应用
蛋白质结构预测与设计技术的研究与应用近年来，蛋白质结构预测与设计技术逐渐成为生物信息学领域研究的热门话题，因其对于了解蛋白质的功能、结构和相互作用机制等方面的意义重大，也对药物研发、基因工程、生物制造等领域的发展起到重要的推动作用。
下面将介绍蛋白质结构预测与设计技术的研究与应用。
一、蛋白质结构预测技术蛋白质结构预测是指根据蛋白质序列信息，预测蛋白质折叠成稳定的三维结构的技术。
不同于普通的分子动力学（MD）模拟等实验手段，蛋白质结构预测利用计算机软件进行模拟和计算。
基于能量最小化、机器学习、统计学等方法，目前已有多种蛋白质结构预测算法开发出来。
其中比较有代表性的包括：1. RosettaRosetta是著名科学家David Baker及其团队开发的一款蛋白质结构预测软件。
该软件基于排斥相互作用原理、骨架碎片拼接技术和Monte Carlo退火模拟等算法，通过对结构多样性的探索，逐步寻找最佳的结构能量最小值，实现高精度的蛋白质结构预测。
2. AlphaFoldAlphaFold是由DeepMind研究团队开发的蛋白质结构预测软件，其特点是采用了深度学习技术，并且在2018年拿下了CASP13的蛋白质结构预测大赛的冠军。
AlphaFold的结构预测精度和准确性都非常高，能够以较快的速度预测出二级结构、域结构、全局结构的信息。
3. I-TASSERI-TASSER是基于蛋白质序列拼装的一款结构预测软件，其优点是具有高速、高效、准确的优点。
I-TASSER通过采用自适应模板拼贴和先进的物理力场优化算法，实现了一系列的分子建模和模拟操作，并将获得的结构导出为pdb格式文件。
第二、蛋白质结构设计技术蛋白质结构设计是指通过人工干预蛋白质质量、构件和环境，控制蛋白质折叠成特定结构的过程，从而改变其性质或功能的技术。
与蛋白质结构预测相比，蛋白质结构设计技术更具有操作性和可控性。
蛋白质结构设计技术可以应用于药物设计、酶催化、材料科学等领域，可实现人工设计“特异性结构”以及“新功能酶”等目标。
人工酶
分子印迹酶
印迹底物及其类似物
• 将 4(5)-乙烯基咪唑聚合可以得到一种模
拟氨基酸酯水解酶的印迹聚合物，可选
择性水解与印迹分子结构相关的氨基酸 酯底物 [N-Boc-氨基酸对硝基苯酯]
• 由于底物在单体聚合时可能发生水解，
因此用其结构类似物 [N-Boc-氨基酸-2吡啶甲酰胺] 为印迹分子 • 聚合后抽提除去模板，在聚合物孔穴内 的特定距离位置留下咪唑基（聚合物骨 架），能起到催化基团的作用
分子印迹酶
什么是“分子印迹酶（molecular imprinting enzyme）”？
• 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底
物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生 催化基团，并与底物定向排列
• 分子印迹酶面临的最大挑战之一是如何利用分子印迹技术来模
拟复杂的酶活性中心部位，使其最大限度地与天然酶相似，即 选择合适的印迹分子是关键的一环 – 底物 – 底物类似物 – 酶抑制剂 – 反应过渡态类似物
• 维生素 B6 通常以磷酸化的形式参与转氨酶的催化反应
• 维生素 B6 自身即能实现转氨基作用，但缺乏底物结合位点， 高效的转氨酶模型必须具有合适的底物结合部位，环糊精的空 腔能够为底物提供良好的结合位点 • 1980 年报道了第一个人工转氨酶模型，它具有良好的底物选 择性，可以使反应加速 200 倍
分子印迹酶
印迹过渡态类似物
• 利用分子印迹技术印迹磷酸单酯（充当
酯水解过渡态类似物），通过与含脒基 （催化部位）的功能单体结合，形成稳 定的复合物。此印迹酶表现出很强的酯 水解活性 • 适当地设计模板分子和催化基团，将稳
N H O N H O CH3 N H O P N H O O CH3
Nature｜人工智能助力蛋白质折叠预测
Nature｜人工智能助力蛋白质折叠预测2021年11月23日，Nature杂志发表文章Artificial intelligence powers protein-folding predictions。
在该文章中，多位专家对AI 应用于蛋白质折叠预测的现状和问题进行了评述。
以下是全文内容。
摘要AlphaFold2和RoseTTAFold等深度学习算法现在可以根据蛋白质的线性序列预测其三维形状，这对结构生物学家来说是一个巨大的福音。
前言很少有科学软件能引发如此轰动。
英国广播公司（BBC）宣称："生物学中最大的谜团之一被人工智能'基本解决'了"。
福布斯称其为"有史以来人工智能领域最重要的成就"。
谷歌DeepMind的人工智能系统AlphaFold2于2020年11月首次亮相，用于预测蛋白质的三维结构，自从该工具在7月免费提供以来，人们对它的讨论更加激烈。
使用AlphaFold2和结构数据建立的人类核孔复合体的模型。
资料来源：Agnieszka Obarska-Kosinska这种兴奋与该软件有可能解决生物学中最棘手的问题之一（从线性氨基酸序列中预测蛋白质分子的功能性折叠结构，以及3D空间中每个原子的位置）有关。
蛋白质如何形成其三维结构的基本物理化学规则仍然过于复杂，人类无法解析，因此这个"蛋白质折叠问题"几十年来一直没有解决。
研究人员已经研究出了大约16万种蛋白质（来自所有生命世界）的结构。
他们一直在使用实验技术，如X射线晶体学和冷冻电子显微镜（cryo-EM），然后将其三维信息存入蛋白质数据库。
计算生物学家在开发补充这些方法的软件方面取得了稳步的进展，并且已经正确地预测了一些来自研究良好的蛋白质家族的分子的三维形状。
尽管取得了这些进展，研究人员仍然缺乏大约4800个人类蛋白质的结构信息。
不过AlphaFold2已经将结构预测策略提升到了一个新的水平。
生物大分子仿真模拟技术
生物大分子仿真模拟技术生物大分子仿真模拟技术是一种利用计算机模拟大分子的结构、动力学和行为的技术。
大分子包括蛋白质、核酸、脂质和多糖等，它们在生物体内扮演着重要的角色。
在过去的几十年中，随着计算机技术的不断发展，生物大分子仿真模拟技术已经成为探索生命科学和制药科学的强有力工具。
生物大分子的功能与构象密切相关，因此，准确地模拟它们的三维结构和动力学行为对于揭示它们的功能机制非常重要。
但是，由于生物大分子的尺度与时间范围很大，而计算机的运算能力有限，所以模拟生物大分子的结构和动力学行为是非常具有挑战性的。
目前，生物大分子仿真模拟技术已经成为物理、化学、生物学和计算机科学等领域相互交叉的前沿领域。
生物大分子仿真模拟技术可以分为分子动力学模拟和蒙特卡罗模拟。
分子动力学模拟是一种基于牛顿力学原理的计算方法，通过数值积分来模拟大分子中原子的运动。
它可以提供关于生物大分子的结构、动力学、热力学等方面的信息。
最初，分子动力学模拟主要用于研究同源模型系统，但是随着计算机技术的飞速发展，现在可以研究更复杂的大分子系统，例如蛋白质-配体复合物和蛋白质-蛋白质相互作用等。
分子动力学模拟需要选择一个合适的势函数来描述原子之间的相互作用能，通常采用力场模型来描述分子内相互作用，而溶剂效应则可以通过模拟水溶液的方式来处理。
分子动力学模拟通常需要进行长时间模拟，以获得足够的统计学意义。
目前，分子动力学模拟已经广泛应用于蛋白质稳定性、蛋白质构象转换、蛋白质-配体相互作用等方面的研究。
蒙特卡罗模拟是一种随机模拟方法，需要选择一个合适的模型来描述分子。
蒙特卡罗模拟通常用于研究热力学和统计力学问题，例如蛋白质的折叠和相变。
相比于分子动力学模拟，蒙特卡罗模拟的计算效率较高，但是在处理分子内精细结构方面较为困难。
除了分子动力学模拟和蒙特卡罗模拟，还有许多其他的生物大分子模拟方法，例如正则伸缩模拟、聚集态动力学模拟和量子力学模拟等。
每种方法都有其各自的优点和适用范围，需要根据具体研究问题选择合适的模拟方法。
蛋白质结构从头预测方法研究进展
蛋白质结构从头预测方法研究进展周建红;艾观华;方慧生;陈凯先【摘要】蛋白质结构从头预测是不依赖模板仅从氨基酸序列信息得到天然结构.它的关键是正确定义能量函数、精确选用计算机搜索算法来寻找能量最低值.基于此,本文系统介绍了能量函数和构象搜索策略,并列举了几种比较成功的从头预测方法,通过比较得出结论:基于统计学知识的能量函数是近年来从头预测发展的主要方向,现有从头预测的构象搜索都用到Monte Carlo法.这表明随着蛋白质结构预测研究的深入,能量函数的构建、构象搜索方法的选择、大分子蛋白质结构的从头预测等关键性问题都取得了突破性进展.%Ab initio protein structure prediction is not dependent on the template , only from the amino acid sequence information. The key to this kind of protein prediction is the proper definition of energy function, accurate selection of a computer search algorithm to find the lowest energy value. Based on this, this paper describes energy functions and conformational search strategies, and lists several successful ab initio prediction methods, We conclude that the major direction of ab inino prediction in recent years is the statistical knowledge - based energy function, the existing conformational search of ab initio prediction methods all use Monte Carlo method. This shows that with the study of protein structure prediction, the critical issues such as the building of energy function , the choice of comformation search method and ab initio prediction of macromolecular proteins have made breakthrough development.【期刊名称】《生物信息学》【年(卷),期】2011(009)001【总页数】5页(P1-5)【关键词】从头预测;能量函数;构象搜索;Rosetta【作者】周建红;艾观华;方慧生;陈凯先【作者单位】中国药科大学,生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,南京,210009;中国药科大学,生命科学与技术学院,南京,210009;中国科学院上海药物研究所,药物发现与设计中心,上海201203【正文语种】中文【中图分类】Q518.2传统蛋白质预测方法分为同源模建、折叠识别、从头预测，但实际上这种分类会混淆众多蛋白质结构预测的方法，尤其是现在大多数从头预测技术依赖结构数据库和统计学原理及其它技术。
RNA的三维结构模型制作报告
RNA的三维结构模型制作报告
简介
本报告旨在介绍RNA的三维结构模型制作过程，包括选择适
当的软件工具和方法，以及相关技术和步骤。
软件工具
在制作RNA的三维结构模型时，可以使用多种软件工具。
以
下是一些常用的软件工具：
1. PyMOL：强大的分子可视化工具，可用于展示RNA的三维
结构。
2. NAST：用于RNA序列比对和结构预测的工具。
4. Rosetta：用于蛋白质和RNA三维结构建模和优化的软件包。
方法与步骤
制作RNA的三维结构模型可以采用以下步骤：
1. 序列比对：使用NAST等工具，对RNA序列进行比对，以
识别共有的结构元素和保守区域。
3. 结构优化：使用软件如Rosetta对初步结构进行优化，以改善结构的可靠性和稳定性。
4. 结构可视化：使用PyMOL等工具，将最终的三维结构进行可视化展示，并进行结构分析和解释。
结论
通过选择合适的软件工具和方法，以及按照步骤进行操作，可以制作RNA的三维结构模型。
这些模型对于理解RNA的功能和相互作用具有重要意义，并有助于进一步的研究和应用。
以上为RNA的三维结构模型制作报告的概要。
详细的步骤和技术细节可以根据具体需求和实际情况进行进一步的研究和探索。
rosettafold原理
rosettafold原理RosettaFold原理是一种基于深度学习的蛋白质结构预测方法，它通过分析蛋白质序列之间的相关性，推断出蛋白质的三维结构。
本文将介绍RosettaFold原理的基本原理和应用领域。
蛋白质是生命体内最重要的分子之一，它们在细胞内发挥着各种功能。
蛋白质的功能往往与其结构密切相关，因此了解蛋白质的结构对于深入理解其功能和开发新药具有重要意义。
然而，实验测定蛋白质结构的过程复杂且耗时，因此需要一种快速准确的结构预测方法。
RosettaFold原理基于人工神经网络，通过学习已知蛋白质序列和结构的数据集，建立了一个预测模型。
该模型能够根据给定的蛋白质序列，预测其可能的三维结构。
具体而言，RosettaFold原理包含以下几个步骤。
将蛋白质序列编码为数值向量。
这一步骤将蛋白质序列转化为计算机能够理解的形式，为后续的计算提供数据基础。
然后，将编码后的蛋白质序列输入到神经网络中。
神经网络是一种模拟人脑神经元工作原理的计算模型，通过学习大量数据，能够拟合出复杂的非线性关系。
在RosettaFold原理中，神经网络的作用是学习蛋白质序列和结构之间的映射关系。
接下来，通过反向传播算法优化神经网络的权重和偏置。
反向传播算法是一种基于梯度下降的优化方法，它通过不断调整神经网络的参数，使其能够更好地拟合训练数据。
在RosettaFold原理中，反向传播算法的目标是最小化预测结构与实际结构之间的差距。
通过模型输出的结果，预测蛋白质的三维结构。
预测结果可以通过可视化软件进行展示，帮助研究人员更好地理解蛋白质的结构和功能。
RosettaFold原理在蛋白质结构预测领域取得了显著的成果。
它能够高效准确地预测蛋白质的结构，为蛋白质功能研究和药物设计提供了重要参考。
此外，RosettaFold原理还可以应用于蛋白质工程和蛋白质折叠机制研究等领域。
通过对蛋白质结构的预测，可以为生物工程和医药领域的研究提供有力支持。
一种基于Rosetta的神经网络数据预处理方法
提出一种基于Rosetta的神经网络数据预处理方法，解决试验过程中因样本参数多而导致故障分类模型收敛速度慢的问题。
详细介绍如何利用Rosetta软件实现粗糙集理论，对样本参数进行预处理。
首先，选择条件属性和决策属性进行属性编码，对构造的信息表连续变量离散化，通过属性约简去除冗余参数，得到最小规则集，继而在MATLAB中训练神经网络故障诊断模型，最后对比Rosetta约简前后训练结果。
经粗糙集约简后，样本参数减少，BP神经网络输入层节点个数减少，故障诊断的准确率平均值高于全参数条件4.62％，表明了应用Rosetta软件的粗糙集属性约简有利于去除故障信号干扰信息，有效地减少了BP神经网络的输入节点数，提高了网络的收敛速率、分类准确率及可操作性。
一种基于Rosetta的神经网络数据预处理方法西安工程大学工程训练中心 刘宇程西安中车永电捷通电气有限公司 赵 熙1 引言大型设备具有连续化、自动化、强载化以及系统模型建立困难、数据复杂、容量大等特点，投入生产使用前，产品须经过大量工况试验，在实验过程中一般采用测控技术进行故障检测，根据早期的状态参数和已出现的故障现象进行诊断，增加系统自诊断能力，对试验台故障的位置、成因和严重程度分别进行判别。
轴承性能试验台就是以测控系统为基础建立的平台，用以实现产品检测的工艺流程和系统故障诊断（刘宇程，轴承性能试验台测控系统的研制：西安科技大学，2015）。
BP神经网络算法作为故障诊断常用手段之一，已经具备较成熟的网络理论和性能。
其突出优点就是具有很强的柔性的网络结构和非线性映射能力。
但是，由于样本参数影响着网络的拓扑结构，网络的中间层图1 系统总体硬件框图（①安装平台；②电机控制润滑系统；③高低压供水冷却系统；④加载系统；⑤监控系统；⑥数据采集系统。
）数、各层的神经元个数会随着结构的差异而显现出不同的性能，样本的多维、多钢、多源的特点易导致学习速率降低。
许多研究人员对样本处理做了深入的研究，主要是围绕数据数值的处理（朱庆生，周冬冬，黄伟，BP神经网络样本数据预处理应用研究：世界科技研究与发展，2012）。
用RoseTTAFold All
用RoseTTAFold All⁃Atom进行广义的生物分子建模与设计赵林(编译)
【期刊名称】《广东药科大学学报》
【年(卷),期】2024(40)2
【摘要】深度学习方法已经彻底改变了蛋白质结构预测和设计,但目前仅限于蛋白质系统。
研究人员描述了RoseT‐TAFold All Atom(RFAA),它可以将氨基酸和DNA碱基的基于残基的表示符号与所有其他基团的原子表示符号相结合,从而对给定序列和化学结构的包含蛋白质、核酸、小分子、金属和共价修饰的组件进行建模。
通过对去噪任务进行微调,科学家们获得了RFdiffusionAA,它能围绕小分子构建蛋白质结构。
从围绕目标小分子的氨基酸残基的随机分布开始,研究人员通过晶体学
和结合测量学,设计并实验验证了与心脏病治疗药物地高辛、酶促辅因子血红素和
光捕获分子bilin结合的蛋白质。
【总页数】1页(P90-90)
【作者】赵林(编译)
【作者单位】不详
【正文语种】中文
【中图分类】G63
【相关文献】
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Rosetta表达意义
Rosetta表达意义BL21中质粒不稳定是因为：BL21不像DH5a，JM109那些克隆用菌一样是DNA酶缺陷型，所以时间一长，BL21中的外源质粒有可能会被降解，而克隆用菌中的质粒则相当稳定。
至于为什么BL21中的外源质粒丢失后，还能在相应抗性的平板上长出来的问题是因为：BL21不是RecA缺陷型。
质粒上的抗性基因有可能被整合到菌的基因组上，所以质粒丢失后还能在相应的平板上长出来。
rosetta菌种本身含有一种质粒，此质粒编码稀有密码子的tRNA，因此如果目的基因中含的稀有密码子较多，用此菌种表达比较合适。
rosetta菌中的质粒还带有抗氯霉素标记因此rosetta菌本身可以抗氯霉素，但这个一般是用于筛选菌种防止污染，而与原核表达无关。
因此表达过程中无需全程都加氯霉素RosettaTM宿主菌是BL21衍生菌，能明显增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。
该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs。
这样Rosetta菌株实现了“万能”的翻译。
而一般情况下，由于受大肠杆菌密码子使用频率的限制，真核蛋白表达常有困难。
tRNA基因由它们的天然启动子驱动。
在Rosetta（DE3）pLysS和Rosetta（DE3）pLacI中，稀有tRNA基因存在于分别带有T7溶菌酶和lac阻遏基因的同一质粒上。
大量摇菌表达前，先要划板挑若干单菌落做小量诱导表达，在上样量相同的情况下，我们能看到他们的表达量是不同的，保存表达量高的单菌落，尽快大摇表达，如果放时间过久，还得划板挑克隆选取表达高的单菌落大摇（虽然都来源于一个单克隆菌，但是划板后每个克隆表达量又有不同，原因不明，望大家赐教），这样能尽可能得到高表达。
另外，选Rosetta的原因，是因为它能满足一些稀有密码子的表达，BL21则不行（导致有些蛋白不表达），所以我们有时候不得不选前者。
毕竟能出结果是最重要的至于Rosetta为何不适宜用于工业化生产，其实与它的表达量有关的，试想一个菌株中拥有N多的质粒或表达框架在里面，那么同样的表达质粒导入，而在别的菌株中就只有一个表达质粒在里面，在相同的培养与诱导条件(即提供的材料量一样)下，可以想像Rosetta菌株中期望的表达质粒能用到的材料量占多少？那么你期望的表达量就肯定不会够了。
NatMethods特刊｜2021年度方法：蛋白质结构预测
NatMethods特刊｜2021年度方法：蛋白质结构预测2022年1月11日，Nature Methods 发表文章，将蛋白质结构预测命名为2021年度方法，并推出特刊。
在特刊中，AlphaFold的开发者John Jumper和Demis Hassabis、RoseTTAFold的开发者David Baker等多位专家发表文章，探讨了蛋白质结构预测方法对结构生物学的影响、预测结构的注意事项以及该领域未来的发展。
此外特刊还列出了在不久的将来有望大放异彩的一些技术。
本文是特刊介绍。
基于深度学习的蛋白质结构预测方法已经在结构生物学界掀起了惊涛骇浪。
我们预计将产生深远而持久的影响。
几十年来，预测蛋白质三维结构的潜力一直吸引着计算生物学家的目光。
虽然该领域已经取得了相当大的进展，但没有一种方法能够可靠地产生接近、更不用说与实验确定的结构质量相匹配的模型。
在过去的一年里，基于深度学习的方法AlphaFold2和RoseTTAfold已经成功地在一系列目标上实现了这一壮举，永远地改变了结构生物学领域的进程。
更令人印象深刻的是，欧洲分子生物学实验室和DeepMind之间的合作已经为21种模式生物预测了超过35万种蛋白质的结构，并在AlphaFold蛋白质结构数据库中免费提供（计划在2022年将预测扩大到数百万种结构）。
由于这些卓越的成就，我们选择蛋白质结构预测作为2021年度方法。
蛋白质的三维形状决定了它的生物功能，并为潜在地改变它以提供有用的生物技术工具或调节其功能提供重要信息。
通过实验解决结构问题是一个缓慢而费力的过程，尽管最近在方法上取得了进展，特别是在冷冻电子显微镜（cryo-EM）方面，但它仍然具有挑战性。
计算研究人员一直认为，如果对一个氨基酸序列（蛋白质的组成部分）以及其生物化学和生物物理行为充分理解，解决"蛋白质折叠问题"的理论方法将是可行的。
在过去的几十年里，已经探索了许多方法，但从历史上看，进展是在短期内爆发的，并有很长的停滞期。
Operetta实验数据导出方法
实验数据导出方法实验数据导出有2种方式：
1.setting-Data Management-Export Data:
点击页面右上角的Setting选项，出现如下界面：
点击Data Management选项：
点击Export Data选项：
注：
Analysis Sequences: 导出.aas文件，可以导入columbus使用
Measurement index and images：导出图片结果，可以在个人电脑上用Image J软件打开。
也可以上传Columbus软件进行分析。
选择存储路径，最后点击Start。
2.setting-Data Management-Write Archive:
点击页面右上角的Setting选项，出现如下界面：
点击Data Management选项：
点击Write Archive：
点击选择框：
点击OK，则数据被选中，系统计算数据大小；选择存储路径；最后点击Start。
archive文件的生存需要一定时间，请耐心等候。
生成的archive文件，可以拷走，包含全部的原始数据，如果日后有需要，可以再用Read Archive选项读取回来。
注：可以保存所有的原始数据并带走，archive文件可以重新用harmony软件读取再次分析，但是不能直接传上Columbus 进行分析。
推荐数据存储方式：
A 若不需要保留原始数据，实验完毕请及时导出并清理自己的实验数据。
B 导出的实验数据可以上传到Columbus服务器进行分析处理。
C 若需要保留原始数据，请及时生成archive文件拷走并清理自己的实验数据。
膜蛋白结构预测
结果分析
用12个已知结构的膜蛋白测试文中方法。 两种说明结果的表示形式：RMSD和GDT。
The y axis represents a Cα distance cutoff (in Angstroms) under which the model was fitted to the native structure, the x axis represents the percentage of Cα atoms in the model that fit below that distance cutoff value. Dark blue—the largest cluster center, cyan—cluster centers 2–5, orange—cluster centers 6–10,green—best RMSD model, red—worst RMSD model.
Байду номын сангаас索嵌入的位置
因为一个结构的能量是由它在膜层中的位 置决定的，所以我们在它每次插入之后寻 找最佳的嵌入，搜索到最低能量的嵌入。 有三个分数项与嵌入有关：1、惩罚不跨膜 的预测的TM螺旋。2、惩罚在膜的核心的 非螺旋的骨架扭转角度。3、在膜的不同层， environment和 pair 的打分项也会不同。
Multipass Membrane Protein Structure Prediction Using Rosetta
基于Rosetta的多螺旋膜蛋白结构预测 的多螺旋膜蛋白结构预测 基于
问题描述
预测膜蛋白的结构：主要是对有多个 α-helical的膜蛋白的预测 Rosetta从头结构预测方法对膜蛋白结构预 测同样适用：使用Rosetta 片断组装方法建 立蛋白质构象 ，使用Rosetta 低分辨率能 量函数中的一个新的膜蛋白能量函数对这 个构象进行打分
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Rosetta进行大分子建模Rhiju Das, DavidBakerAbstract近年来的进展使接近原子精度的蛋白质预测和设计成为可能。
这些进展来自于高精度高计算效率的全原子能量函数和用于搜索极端崎岖势能面的有效采样策略的开发，这两者都由结构预测和设计的测试结果的反馈所推动。
Rosetta程序中统一的能量和运动框架可广泛用于大分子建模的问题中，从微纤结构预测到RNA折叠再到设计新的蛋白质界面，都易于进行研究和突出区域的改进设计。
该方法可创建具有一定有用功能的新颖分子，并可帮助揭示结构实验的结论。
本文还介绍并评价了晶体图像分析，NMR建模以及低分辨率方法等之间的联系。
Contents介绍分子建模的关键能量函数构象采样生物分子建模和设计的统一框架多种问题中的共同要素INTRODUCTION生物分子演化出了令人惊叹的本领，那就是它们可以由化学序列指导折叠成唯一的三级结构。
仅由序列来预测这些结构，以及设计具有新功能的分子，是生物物理领域中的传统问题。
虽然这些难题的普适的解决方案尚未得到，但近年来已经有了长足的进步。
在2004年，从头蛋白结构建模Rosetta算法中所用的理论和方法被文献总结，此后，这个方法完成了若干主链精度达到2Å的盲预测。
本综述的第一个目的，在于阐述四年来，几个基本方法是如何在蛋白质从头结构预测领域的生物分子建模问题中取得广泛成功的。
第二个目的是概述未来四年中，这些方法可能会随着大量分析和操作分子体系的科研工作而愈发成熟。
在简单介绍Rosetta方法的基本组成后，我们介绍这些理论如何推广到解决实际应用中，包括：loop建模，考虑主链和侧链柔性的蛋白和配体的docking，RNA折叠等问题。
我们最后强调了这些高分辨方法与实验手段的新联系，以及在广泛使用这些混合计算/实验的方法时所出现的问题。
KEY INGREDIENTS OFMOLECULAR MODELING大分子结构预测和设计基于这样一个前提：观察到的折叠大分子的构象总处在自由能最低的状态。
也就是说，结构预测的根本问题是找到给定序列的生物大分子最低能量的结构，而设计则是要找到使目标结构具有最低能量的序列。
这两个建模问题的关键在于合理的精确自由能函数和能够定位所研究生物分子的能量函数最小值点的采样方法。
Energy Function大分子折叠结构的显著特点是非极性基团会远离水埋藏起来；埋藏基团或原子会十分紧密的堆积；几乎完全嵌入的极性原子形成分子内氢键。
第一个特征产生的直接原因是疏水作用，很多年前被Kauzmann认为是蛋白质折叠的主要驱动力。
第二个特征反应了埋藏原子间的VDW相互作用，或许更重要的，是在溶剂中的孔穴容纳蛋白质分子耗费很高的自由能。
第三个特征由于折叠时从极性基团剥去水分子的自由能开销，必须由蛋白或核酸分子内新产生的氢键来补偿。
承认这些特点，尤其是氢键，是早期Pauling和合作者进行蛋白基本而结构预测，以及Watson和Crick对核酸的研究的重要基础。
一个成功的自由能函数必须提高这些优势的贡献来保证大分子的稳定。
在Rosetta中，原子-原子间的相互作用LJ势高效的计算来描述堆积，隐式溶剂化模型来描述疏水作用和与埋藏极性原子的静电去溶剂化开销，显式的氢键势来描述氢键相互作用。
如我们曾经讨论过的，显式的氢键处理比大多MM势中经典的静电模型有很大的进步，因为氢键的方向性被更好的建模。
此外，长程静电相互作用，有名的难以准确计算极化作用，被大大阻止。
一个对于Rosetta和其他不同库中使用的能量函数的有洞察力的比较近期被发表。
键合相互作用在Rosetta中被固定为理想键长和键角。
剩下的自由度即为二面扭转角，相应的能量函数可能是所有力场中最困难的方面，要准确考虑内在的量子力学效应，而它们很难被严格的分解为独立的经典部分。
这些势在Rosetta中采用由高分辨晶体结构中得到的经验模型。
这个过程远远不是最优的，因为两次计算了已经在非键相互作用项中考虑过的作用，以及在审美层面（？）。
总之，严格的键相互作用处理仍然是一个难以克服的挑战。
最终得到编码了分子相互作用基本物理信息的能量函数，还必须进行近似。
比如，显示溶剂结构，长程静电作用，分子中残留动态被忽略掉了。
另一个显著的省略是在分子得到有序结构时可观的熵改变；我们假设，引入一个近似，堆积的很好的蛋白构象间的构象熵差异很小。
然而，重要的是要认识到，成功地预测和设计蛋白质并不要求一个精度极高的能量函数指标。
在一定程度上，结构预测的成功来自于实验测得结构与大量非native构象间的巨大能量差异。
在蛋白结构预测中，一个分子被“折叠”意味着在平衡状态，它处在单一的native构象的概率极高。
如果这个概率达到99.9%，那么，由Boltzmann关系，native态和非折叠态间的自由能差至少将达到ΔG=kBT log(0.999/0.001) = 4kcal/mol。
实际上，这个自由能垒的典型测量值为3~10 kcal/mol。
然而由于伴随折叠产生的巨大熵减，能量的差异（相比于自由能）将会更大。
实验和理论的研究通过对构象熵的估计认为，native态与其他非折叠态间的能量差异在100kcal/mol量级（大约每残基1.4kcal/mol）。
假设native态的能量函数误差在实际能差的10%以内就可以被以合理的信度定位，那么可以允许很大的误差存在。
（这个理由过度简化；实际上结构预测需要的精度更大，因为可能有若干能差在几kcal/mol的简并native构象。
）虽然几kcal/mol的能量误差不会对结构预测带来太大的拖累，但实际应用时仍需要高质量和高分辨率的自由能函数。
而且，与估计构象熵改变相关的挑战使精确的计算折叠或对接的绝对自由能格外困难。
不管在假定的全原子能量函数中做了如何的近似，辨别native结构和可行的设计的一个决定性方面在于把接触原子维持在它们特定的距离。
不幸的是，这些接触距离会导致非常崎岖的势能面，即使非常接近最低能点也会遇到很高的能垒。
为了使采样更加容易，建立一个更加平滑的全原子势会十分有帮助，借此高频涨落相关的自由度被高效的“积掉了”。
比如在Rosetta中，很多计算的最初阶段会在一个平滑的势能面上进行搜索，把侧链的自由度表示为软作用中心。
对于蛋白质，主要驱动力来自非特异的疏水基团的掩埋和β折叠的形成，以及侧链中心虽然有特异性但会被平均掉的相互作用的少许贡献。
对于核酸，平滑势中的力来自于粗粒的碱基配对和堆积。
ConformationalSampling搜索全局最小值的第一个策略是用一个粗粒化的低分辨势来定位大量的局部极小值。
尽可能多的搜索局部极小很有必要，因为采用了平滑的粗粒势，忽略关键的分子间堆砌作用的贡献，必然会导致很大的误差。
其实，给出低分辨能量函数的近似性质，在任何可能的地方根据外部信息引入偏倚采样是很重要的。
比如，在Rosetta中对蛋白和RNA分子的低分辨结构预测基于这样的折叠图像，局部链段在给定序列的相对低能分布构象中采样。
折叠在组合的局部链段被采样到能量很低的三级相互作用时发生。
这种在两个不同结构间的摇摆的建模，假设对孤立的序列片段采样得到的结构的分布可以用先验的实验得到该序列晶体结构的分布来很好的近似。
搜索自由能全局最小的第二个策略，是重构由低分辨方法初步找到的可能的最小构象被省略掉的全原子细节。
在蛋白质折叠中，这个策略先对离散的氨基酸rotamer的组合进行模拟进行退火搜索。
在蛋白质设计的计算中，整个过程类似，还需要考虑所有的氨基酸的rotamer可能处在任意位置，而不是固定的native 序列。
进一步优化几何结构，Rosetta采用多步MonteCarlo最小化过程，包括给扭转角配列一个扰动，并一个一个rotamer进行连续的基于梯度的侧链和主链扭转角的优化。
超过前面所说的侧链优化过程，这里的构象扰动包括主链扭转角的微小改变和多个区域的刚体方向的变化。
这些移动对常规建模问题的实施以及当前搜索方法的能力和挑战在下一章讨论。
A UNIFIEDFRAMEWORK FOR BIOMOLECULAR MODELING AND DESIGN过去几年，全原子能量函数和高效的高分辨搜索方法的进步被很好的扩展到从头预测球状可溶蛋白分子结构的分子建模中。
相同的基本成分，即，相同的软件核心，被用来建立相应的大蛋白模型，用于蛋白质-蛋白质界面预测，设计新的蛋白质，甚至研究高分子而非蛋白质。
在这部分，我们简单的介绍这些看似多样的分子建模问题如何在一个统一的框架中解决。
Same Ingredientsfor Multiple Problems非常普遍的，任何预测和设计的问题都可以明确的表达为一个包含适当自由度和约束的全局最优化问题。
所有这些问题的步骤都很相似。
首先，定义运动规则，原子随着扭转角或刚体自由度而改变。
第二，相应的，截然不同的子树的离散状态的可选集合被指定（在序列每个位置不同侧链rotamers是预测问题，考虑所有或者选定子集中的氨基酸的rotamers是设计问题）。
第三，内坐标自由度由模版进行初始化和参数化。
最后，构象改变的安排被加入；这个过程和相关的能量函数在很多不同的问题中都非常相似。
不同建模问题间的主要的不同在于，第一个成分也就是对运动的定义。
在模拟分子动力学的软件包中，用一个文件来存储模拟的原子和原子间的键接信息。
在Rosetta中，这些运动规则被编码到一个“树状”表示中（文中atom tree），如图所绘。
在每个Rosetta的Monte Carlo移动中，分子的内坐标子集，比如随机选择残基的主链扭转角被改变。
原子树中改变的残基被标记为“祖先”原子保持不变，被影响的原子以及它们的“后代”被平移和旋转来演化运动。
另外，为了改变扭转角，两个相关区域的刚体方向可以被改变，这个运动会用过非共价连接编码到原子树。
另外，当前的原子树框架允许键长和键角的偏离，虽然这个特征并没有被广泛的检测。
作为图解，用比较模型从头重构loops的低分辨原子树直方图表示在图a、b中。
从头预测使用了一个简单的原子树，每个骨架原子都与其邻居相连；内扭转角被初始化为相同的值并在模拟中被改变。
对于loop建模，需要对重构部分的骨架进行移动而不改变其余部分，所以原子树中引入暂时的链打开，图b。
在这步执行后，进行相似的重新和loop重构模拟过程，使用基本一样的移动集合，除了最后额外的关闭loop步骤。
在上述框架中，处理一个新的问题，可以简单的处理为增加一个新的适当的原子树。
这个方法的能力会用柔性骨架蛋白-蛋白docking进一步阐释。
骨架构象会在蛋白质dock时发生频繁的改变；所以当前大部分docking算法中所用的固定骨架近似会妨碍高分辨的预测。