基因打靶技术
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶技术 (Gene Targeting) 是一种分子生物学技术，建立在基因同源重组技术和胚胎干细胞技术的基础上。
它通过将目的基因和与细胞内靶基因同源的 DNA 片段重组到载体 (或质粒) 上，构建打靶载体 (基因表达载体),然后利用限制酶将打靶载体线性化，以提高重组率。
通过显微注射技术将打靶载体导入胚胎干细胞，这样打靶载体和与细胞内靶基因同源的区段就有机会发生同源重组。
为了筛选发生同源重组的细胞，可在培养液中加入新霉素和丙氧鸟苷。
最后，通过 DNA 分子杂交技术鉴定同源重组的细胞，获得大量打靶成功的细胞。
这些细胞可以注射入小鼠囊胚，移植到同种、生理状态相同的母鼠体内，一段时间后对受体母鼠进行妊娠检查，确保其生下嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后，体内同时存在被修饰过的基因和未被修饰的基因。
如果某些小鼠的生殖细胞恰巧被修饰过了，则它们的杂交后代中，就可能出现基因完全被修饰过的小鼠。
基因打靶名词解释
基因打靶名词解释
基因打靶是一种基因工程技术，它利用特定的DNA序列，将外源基因精确地导入到一个特定的基因位点中。
这种技术可以用来研究基因功能、修复基因缺陷以及开发新的基因治疗方法。
基因打靶的过程包括两个主要步骤：识别和切割。
首先，研究人员使用特定的酶或蛋白质来识别目标基因的特定序列。
这些序列通常是一段短的DNA片段，称为“打靶位点”。
一旦打靶位点被识别，酶或蛋白质会结合到该位点，并启动下一步的切割。
接下来，酶或蛋白质会切割目标基因的DNA序列。
这个切割过程会导致DNA链的断裂，并触发细胞的DNA修复机制。
细胞会尝试修复这个断裂，但通常会出现错误的修复方式，导致插入或删除一些基因序列。
这些插入或删除的基因序列可以是研究人员提前设计好的，也可以是随机发生的。
基因打靶的最终目标是通过插入或删除特定的基因序列，改变目标基因的功能或修复基因缺陷。
例如，科学家可以使用基因打靶来修复一些遗传性疾病中的突变基因。
他们可以通过删除或替换这些突变基因来恢复正常的基因功能，从而治疗相关疾病。
此外，基因打靶还可以用于研究基因功能。
通过切割和修改特定的基
因序列，研究人员可以观察到这些基因对生物体的影响，并进一步理解基因在不同生物过程中的作用。
总而言之，基因打靶是一种精确编辑基因的技术，可以用于研究基因功能和开发基因治疗方法。
随着技术的不断发展，基因打靶有望成为一种重要的工具，用于治疗遗传性疾病和改善人类健康。
2007年诺贝尔生理医学奖
三、定义
• 所谓基因打靶技术， 简单的说就是人为的 操纵基因的表达，也 就是说在基因序列上 加入或减去基因的技 术。通过对基因片断 的加加减减，达到预 期的生物形状改变的 结果。
四、应用
• ①“基因靶向”技术可允许科学家利用胚胎干细 胞，灭活或修改小鼠的特定基因，使实验鼠体内 的一些“不活跃”基因失去作用，从而发现这些 基因的实际功能，研究这些基因对健康和疾病的 影响。利用该技术，科学家在小鼠的胚胎干细胞 中引入特定基因进行修饰，将这些细胞注入小鼠 的胚胎后，从该胚胎出生的小鼠和其它小鼠繁殖 的后代将产生基因变异。科学家希望借此发现人 类一些疑难杂症在分子水平上的发病原因，并最 终找到治疗途径。
④用来提供廉价的异种移植器官。
众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的 一大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的 器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基因 会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子， 如果能将产生这些异源分子的基因消除，那么动 物的器官将能用于人体的疾病治疗，这将为患者 带来巨大的福音。再就是用于定向改造生物，培 育新型生物提供了重要的技术支持。由此可见其 潜在的巨大应用价值。
2007年诺贝尔生理医学奖 ——“基因靶向”技术的坚定基
础
一、概述
• 2007年诺贝尔奖评审委员会将诺贝尔生理 学或医学奖分别授予两名美国人马里奥·卡 佩基、奥利弗·史密斯和一名英国人马丁·埃 文斯，以表彰他们在“基因靶向”技术方 面的突出贡献。
马丁-埃文斯
• ②全世界的科学家已经利用该技术先后对 小鼠的上万个基因进行了精确研究。根据 导致人类疾病的各种基因缺陷，科学家培 育了超过500种存在不同基因变异的小鼠， 这些变异小鼠对应的人类疾病包括心血管 疾病、神经病变，糖尿病和癌症等。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
基因敲除2
PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
Gene targering 基因打靶
(四)外源基因的时间可控性表达：
实现了组织特异性基因打靶后，导入的外源基因表 达时间仍是无法控制的，因而仍无法确定外源基因的表 达在动物发育不同阶段中的作用。另外，由于外源基因 表达的时间不能控制，有时可造成转基因动物在胚胎期 死亡。为了解决这一问题，Mentzger等人(1995)用编码 Cre重组酶与人雌激素受体(estrogen receptor,ER)融合 蛋白的基因制备了Cre – ER转基因小鼠，给这种转基因 小鼠注射人雌激素，可诱导Cre – ER的大量表达。再用 插入两个反向loxP序列之间的基因制备另一种基因打靶 小鼠，并使该基因DNA序列与其上游的启动子方向相反， 则该基因必须依赖Cre重组酶调转方向后方能表达。
1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman 首先分离培养成功。
基因打靶的原理
基因打靶的结局有如下可能：
(1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新 的基因。
(2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。
(3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以 正常基因替代突变的内源基因。
loxP位点 DNA序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的
DNA序列连同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的
DNA序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则
被调转方向。
Loxp 位点
两个loxp位点的方向相同
loxp
gene
loxp
Cre
两个loxp位点之间的基因被切除
两个loxp位点的方向相反
逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲 合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因 治疗方面具有较大的发展潜力。
第一章：基因打靶概述
在科学界，转基因动物被定义为“由于外源DNA导入动物基因组而产 生了可遗传的改变，这样的动物叫转基因动物”（陈永福，《转基因动 物》）。科学界对转基因动物的狭义定义主要指外源DNA被整合到生殖系 中（即可遗传），而不包括非生殖系整合的体组织基因导入。 具体含义： －转基因动物体内含有导入的外源DNA片段 －外源DNA必须整合到动物的基因组中 －动物的所有细胞基因组中都应含有导入的DNA －外源DNA可通过猪、鱼基因工程育种 “ 863”七五、八五计划, 转羊MT/猪GH基因:
转大马哈鱼和草鱼GH基因： 2. 乳腺生物反应器 “863”九五、十五计划重大专项,
3. 异种器官移植 “ 863”九五计划, 转hDAF基因：
猪(1989), 兔(1990) ， 绵羊(1991), 鱼(1986) （1995-2005）
二，什么是转基因动物（transgenic animal)
美国FDA：A transgenic animal is defined as an animal which is altered by the introduction of recombinant DNA through human intervention. This includes two classes of animals; those with heritable germline DNA alterations, and those with somatic nonheritable alterations. （转基因动物就是一种GE animal！）
第一章
基因打靶概述
第一节 基因打靶的概念
一，什么是基因修饰（或遗传修饰）（ Genetic Modification，GM)
基因打靶技术
1
意 义：
基因打靶技术作为最有效的定向修饰小鼠基 因的技术手段在揭示基因的生理功能、研究 人类疾病的遗传机制以及寻找新的药物靶标 的过程中发挥着重要的作用。
定
义
理论基础 操Байду номын сангаас流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
2
基因打靶技术是一种定向改变细胞或者生物个 体遗传信息的实验手段，是利用基因转移方法， 将外源DNA序列导入靶细胞后，通过同源重组， 将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定 的位点，从而改变细胞遗传特性的方法。
2008年中科院： 比较基因打靶技术与RNAi这2种方法的异同点 2008年南大： 若有一哺乳动物新基因的开放阅读框序列已测出，但对其功能 一无所知。请设计3种以上研究途径和方法，研究此基因有何 功能。
何为RNA干扰？说明其基本原理及它与反义RNA技术的主要差别
8
ES 细胞技术与同源重组技术的结合使得在生物整体水平上定向 改变和修饰哺乳类动物的遗传物质成为可能。
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
4
打靶载体的构建
同源重组指导序列、外源DNA序列
转化受体细胞
显微注射、电穿孔DNA - 磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导
筛选
正筛选标记：同源序列内；负筛选标记：同源序列外侧
定
义
理论基础 操作流程 应 用
基因打靶技术和RNAi
3
基因打靶技术是在胚胎干细胞(ES)技术和同源重 组技术成就的基础之上产生和发展的。
Joshua Lederberg 由于50 多年前在细菌中首先证实同源基 因间重组的原理而获得了1958 年的诺贝尔奖。 Capecchi 和Smithies都首先预见并证实到新的遗传物质可 以通过同源重组引入哺乳动物细胞的基因组, 从而对基因进行特 异性修饰和改造。 Evans贡献了制造小鼠生殖细胞系的工具——胚胎干细胞 。
基因敲除
• 1987年，Evans等和Monk等的研究小组在小鼠胚胎干细胞 中分别对次黄嘌呤磷酸转移酶基因(Hprt)的进行改造，并 获得了经生殖系遗传的突变小鼠。
• 1989年，真正通过同源重组获得的基因敲除小鼠诞生。
基因打靶技术的发展简史
• Joshua Lederberg由于在细菌中首先证实同源基因间重组的 原理而获得了1958年的诺贝尔奖。
• Capecchi和Smithies都首先预见到新的遗传物质可以通过同 源重组引入哺乳动物细胞的基因组，并对基因进行特异性 修饰和改造。
• 1980年，Capecchi报道用玻璃针将DNA直接注射入细胞核 可以显著提高基因转移的效率。
同源染色体交叉互换
• 同源重组是指发生在减数分裂或者有丝分裂过程中相同或 者相似DNA序列间的重组。它通常通过一对同源分子非姊 妹染色体间的断裂而产生新的重组片段。同源重组在进化 过程中高度保守。
• 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：胚胎干细胞是早期 胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺种分离出来的一类细胞。 具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
同源重组基因敲除
• Capecchi随后证明同源重组可以发生在外源DNA和哺乳动 物细胞染色体的同源序列间。证明这种有缺陷的抗性基因 可以通过与外源DNA间的同源重组得到修复。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因打靶技术
基因靶位操作技术还为人类遗传疾病的基因治 疗提供了有力手段。所谓基因治疗 基因治疗，即通过对缺陷 基因治疗 基因的修复，使病灶细胞重新获得正常功能。靶位 操作技术对缺陷基因结构进行精确改正，与功能弥 补性基因治疗不同，修复后的细胞表达正常蛋白， 不表达错误产物，因此它是一种理想的基因治疗策 略。
4 转基因动植物和生物反应器方面 转基因技术就是将体外重组的结构基因导入动 转基因技术 植物体内，使外源基因与动植物本身的基因整合在 一起，实现体内表达，从而培养出转基因动植物的 技术。基因靶位操作技术的出现，使转基因动植物 和生物反应器研制更为精确。如果应用基因打靶技 术把外源基因准确地插入受体细胞的基因组中，定 点改造原有基因的功能，使转基因动植物和生物反 应器的研制更为精确。
3 在病理模型和基因治疗方面 目前，越来越多的人类疾病被证实是由基因 缺陷所致，人类疾病的动物模型对病理学研究和 临床治疗都非常重要。自发或诱变病理模型需要 漫长的时间；应用转基因技术，外源基因在基因 组中的随机整合可能带来不确定的表型。而基因 靶位操作技术在很大程度上克服了上述局限，它 通过胚胎干细胞的体外转染、筛选和胚胎嵌合体 途径，获得含特定突变基因的模型小鼠，得到多 种病理模型。
基因打靶技术的原理
进行基因打靶，首先要设计和合成一个将要 导入靶细胞的靶载体。该载体不仅含有需要插入 的DNA序列，其两端还含有与靶基因座上的序列 相同的核苷酸片段，即同源重组指导序列 同源重组指导序列。将此 同源重组指导序列 载体导入靶细胞，通过外源载体和内源靶位点相 同的核苷酸序列之间的同源重组，使外源DNA定 点整合到靶细胞的特定的基因座上。因此，同源 重组是基因打靶技术的分子生物学基础。
图2：正负选择载体的筛选原理
染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区； 之间斜线部分为同源区； Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体 正负选择 ； ； A、B：染色体上的两个基因 、 ： E：外源基因； ：外源基因；
基因打靶技术
基因打靶的产生和发展
基因打靶技术最早是20世纪70年代在酵母细胞中发展起来的。对 于酵母来说，大多数的外源DNA 片段通过同源重组整合到基因组内， 随机插入仅占小部分，多为同源位点整合， 后来基因打靶技术逐渐应
用于哺乳动物细胞，并得到进一步的发展和改进。
80年代早期，基因打靶技术开始在哺乳动物细胞中进行模式试验，
基因打靶的基本环节
4 检测：
观察被击中细胞的生物学特性，并进行分子生物学检 测。可以用特异PCR 方法鉴定， PCR 引物一端以基因组 DNA 的特定基因座为模板，另一端以导入的外源基因为模 板，这样保证扩增后的片段为同源重组产生的特殊片段。 对经PCR 鉴定的克隆用Southern 杂交产生特殊带谱的方法 来进一步确定同源重组克隆。
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究 (2) 建立人类疾病的动物模型 (3) 用于疾病的基因治疗 (4) 用于改造生物和培育新的生物品种
基因打靶技术的应用
(1) 基因功能的研究
后基因组时代主要任务就是研究大量新基因的功能。用体细胞 基因打靶技术通过定点改造基因组中的特定基因，有可能在细胞水平 上研究某一基因的功能及调控机制；从定点突变的干细胞获得基因突 变型个体，可在生物体整体水平上了解某些基因在体内的具体作用。 另外，胚胎发育是非常复杂的生命现象，在这一过程中包含着许多生 理、生化的复杂变化，尤其是要考察某一基因对某一组织器官发育的 影响，用传统的研究方法很难进行观察研究。基因打靶为这一领域的 研究提供了理想的方法
变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是 同源重组效率的关键因素，基因打靶载体的同源重组序目标的DNA 序列进行扩增得到。
7 8 neo 8
6
78
基因打靶技术
loxP (locus of crossing over (x),P1)位点是由 34对核苷酸为基本单位组成的DNA重复序列。来自 P1噬菌体的Cre (causes recombination)重组酶可 特异地识别loxP位点而使两个位点之间的DNA序列 发生重组，其机制是Cre重组酶可在loxP位点中切开 DNA序列而造成粘性末端。如果两个loxP位点 DNA 序列方向相同(头一尾相对)，它们之间的DNA序列连 同一个loxP位点被切除；如果两个loxP位点的DNA 序列方向相反(头一头相对)，它们之间的DNA序列则 被调转方向。
(一)基因打靶的原理
基因打靶(gene targeting)是根据 DNA同源重组的原理而设计的一项技术。 在这一技术中，体内细胞基因组的某一段 DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建 的欲导入的外源基因DNA序列被视为 “弹头”，这样导入的外源基因进入受体 细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚 准“靶子”进行准确的定点整合。
G418
GANC
打靶ES细胞的鉴定与扩增
筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方 法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆与囊胚体外 共孵育或用显微注射的方法注入囊胚的胚泡中，再 将囊胚植入假孕母鼠的子宫中发育。
3.基因打靶小鼠的繁育(breeding)
用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合 体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基 因打靶的ES细胞共同发育而来。因此并非小鼠的 全部细胞中都整合有导入的外源基因。为获得纯 合子的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性 小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交(back– cross)。回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠 (-/-),即完全不携带有外源基因。也有杂合子的小 鼠(-/+)。再用杂合子小鼠互交（intercross）， 从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因 打靶小鼠。再经繁育可建立转基因小鼠品系，其 实验流程见下图 。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型，此后基因敲除技术得到进一步的发展和完善，目前该技 术已经成为研究基因功能最直接. 、最有效的方法之一。 2
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Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
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7
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超 基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它不 仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。
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11
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12
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13
Cre/loxP系统作. 用原理示意图
14
ห้องสมุดไป่ตู้
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
基因打靶技术
同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法
建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础
之上的基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段
基因打靶原理
生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术 的发展，促进了基因打靶的广泛应用。 同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组 的相应片段发生交换（即重组）。ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状 态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。
杀死细胞
随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死， 无整合的将被G418杀死。
用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk
基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。
2018/10/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
基因打靶的筛选
3.基因打靶的筛选方法
基因打靶的主要步骤
2、外源DNA导人的方式
外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法 等。目前应用最广的是显微注射法。 显微注射每次只能注射一个细胞； 电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES 细胞稳定转染； 逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性 基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
4.基因打靶的策略
• 完全基因剔除(complete knotk-out)的策略 • 大规模随机基因剔除—基因捕获(gene trapping) • 精细突变的引入 打了就走策略 (Hit and Run 法) “标记和置换”法 (Tag and Exchange) • 条件性基因打靶
基因打靶技术.
四、外源DNA导人的方式
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外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔 法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最 广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射 法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA 细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个 细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。 Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定 转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细 胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶， 在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。
常用的选择标记基因
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正选择标记基因有新霉素磷酸转移酶 （neo）、潮霉素B磷酸转移酶（hph）、黄 嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶（gpt）、次黄嘌呤 磷酸转移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk） 及嘌呤霉素乙酰转移酶（puro）。 负选择标记基因有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶 激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、 tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB 等。
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胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合 体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的 一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的 特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛 地应用于建立转基因动物之中。从80年代 到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已 发展到成熟阶段。
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1984年， Bradly等成功地用显微注射法将 ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠， 获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获 得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首 次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发 育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子 代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除 (Gene knockout)的动物模型。此后，这项技 术得到了普遍应用和长足发展。
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能
传统ES打靶基因敲除敲入小鼠技能传统ES 打靶基因敲除/敲入小鼠技术技术原理传统的基因打靶技术制备基因敲除（KO ）/敲入（KI ）基因打靶技术是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA 片段与宿主基因组片段同源性高时，同源DNA 区部分可与宿主DNA 的相应片段发生交换（即同源重组）。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。
基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。
尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠，该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段，并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程和周期、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。
在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。
管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。
线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。
、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。
基因打靶
基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段，它的产生和发展建立在胚胎干(ES)细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
基因打靶技术将广泛应用于基因功能研究、人类疾病动物模型的研制以及经济动物遗传物质的改良等方面。
原理首先获得ES细胞系，利用同源重组技术获得带有研究者预先设计突变的中靶ES细胞。
通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。
经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传。
获得的带有特定修饰的突变动物提供研究者一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。
目前，在ES细胞进行同源重组已经成为一种对小鼠染色体组上任意位点进行遗传修饰的常规技术。
通过基因打靶获得的突变小鼠已经超过千种(相关数据库参见文献)，并正以每年数百种的速度增加。
通过对这些突变小鼠的表型分析，许多与人类疾病相关的新基因的功能已得到阐明，并直接导致了现代生物学研究各个领域中许多突破性的进展。
特点基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
通过对生物活体遗传信息的定向修饰包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。
基因打靶技术的发展己使得对特定细胞、组织或者动物个体的遗传物质进行修饰成为可能。
基因打靶技术在基因功能研究中的应用、应用基因打靶技术研制人类疾病动物模型、应用基因打靶技术改良动物品系和研制动物反应器等。
gene knock-out将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。
去除原核生物细胞、真核生物的生殖细胞、体细胞或干细胞基因组中的基因等。
基因转移技术和基因打靶技术
simplex virus) 胸腺嘧啶(mì dìnɡ)激酶 (thymidine kinase)
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一、胚胎干细胞系的建立 （一）胚胎的收集与胚泡的培养
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一、目的基因的制备和转基因载体的构建 （一）目的基因的制备 1、cDNA法扩增目的基因 2、双链DNA与载体连接(liánjiē)构建重组体 3、将重组体转入受体菌 4、筛选和鉴定重组体 5、扩增获得大量重组体
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（二）转基因载体的构建 载体通常由结构基因及其调控序列(xùliè)组
成。常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光 蛋白等报告基因。
根据不同目的选择相应调控序列(xùliè)：如 观察外源基因表达的生物学效应，即选择表达 效率高而无组织特异性的强启动子如CMV、 pGK等。如观察外源基因再特定靶器官的功能， 即选择组织特异的启动子。
线性DNA分子比环形DNA分子更容易整合到
分离胚胎，体外培养胚胎形成(xíngchéng) 胚泡。 （二）内细胞团（ICM）的离散 （三）干细胞克隆的识别 （四）干细胞的收集与传代培养 （五）干细胞的冻存与复苏 （六）ES细胞系的特征 精品文档
二、基因打靶
基因打靶就是按照预定计划通过(tōngguò)外部打靶 DNA与内源性靶基因之间的同源重组对胚胎干细胞进 行遗传修饰。
瞬间
细胞
细胞膜核膜通透性增加(zēngjiā)
高压脉冲
DNA渗入细胞
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（五）体细胞核移植法
1997年，英国科学家Schnieke和Wilmut等通过体细胞 核移植技术成功克隆了“多莉”。 原理：
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目标序列特异性 列，且识别序列常受 何序列，且特异
上下游序列影响
性高
细胞毒性
较高
低
脱靶情况
11%
1%
实验周期 长，（Sigma8个月)
短
实验费用
高
低
实验成功率
～10%
高
机制： 1，外源DNA整合到宿主5’端两个重复序列之间，
成为新的间隔序列 2，转录和加工前体的 靶向性切割 外源DNA序列
crRNA由宿主基因组转录出来，那如何避免降解自身序 列的？
1，外源DNA的原 间隔序列旁 有 PAM（NGG）， 而宿主没有 2，成熟的crRNA 还包含有部分重复 序列，可与宿主基 因组配对，而外源 DNA不能
应用时，只需转染能表达Cas蛋白和gRNA的质粒
CRISPR-Cas9
CPISPR/Cas系统优缺点
入DNA片段，染色体倒转和异位。破坏基因功能
Homology directed repair: 同源重组修复 需要donor Homologous
template 可插入某基因或通过点突变修
改某个基因
TALEN=TALE+ FokI
TALE是黄单胞杆菌的一类分泌蛋白，能够与寄主靶基因的 启动子DNA序列进行特异性识别和结合，从而调控寄主的 基因表达。
TALE由N端的转运信号、C端的核定位信号、中间的 DNA结合域—一组氨基酸重复单元串联而成，每个重复单 元有34个aa,其中第12、13有多态性，识别并结合一个核 苷酸
287AA
295AA
TALE 对核苷酸的特异性
一个氨基酸序列模块 识别一个碱基，简单且特异性好。通过组 合各类模块，可对任何核苷酸序列进行靶向性特异性敲除
优点： 1，耗时短 成本低 （ZNF和TALEN需设计并组装识别单元，CRI/CAS只需改变一段RNA 序列） 2，经改造的Cas9蛋白可以只切割单链DNA，造成单链损伤，通过 HDR进行基因组的点突变。优于TALEN和ZFN。 3，可同时切割多位点，而TALEN和ZFN只能针对一个位点
缺点： 1，crRNA识别靶序列时3’端必须有PAM序列（NGG） 2， crRNA识别靶序列的识别长度只有14bp，容易在 基因组重复出现，造成脱靶效应 3，TALE和ZFP可以与其他效应结构域融合，如转录 激活、抑制结构域。CRISPR不能 4，还需更多数据来评估其有效性和特异性
分子大，使构建载体和转染细胞增加难 度。空间结构大，更难以接近靶基因 TALE识别的靶序列必须以T开头 局限性 一对一，特异性强
未观察到 来源于植物致病菌，免疫原性高
锐普PPT论坛chinakui发布：
技术名称
ZFN
TALEN
实验设计难易
复杂
简单
无法识别任意目标序 可特异性针对任
ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods
目的： 基因编辑 基因功能的研究：如konck out
nc-RNA表达丰度低，knock-down不可靠
个体化治疗
构造：
特异性DNA结合域： 蛋白类：ZFP TALE RNA类：CRISPR
功能域： 转录激活(VP16.VP64.p65) 转录抑制(KRAB.SID) DNA甲基化(DNMT) 去甲基化(TET) 核酸内切酶(FOKI)
同引物的设计
模块组装： Golden gate 分子克隆 高通量固相组装 酶切-连接等
ZFN和TALEN优缺点对比
ZFN的一个锌指识别3bp DNA。
TALEN一个氨基酸重复序列 识别一个碱基
分子小，空间结构小。
特。 ZFP识别DNA位点受邻近氨 基酸影响，特异性会改变 来源于人sp1和鼠zif268的骨 架，免疫原性低
ZFN=ZFN+ FokI
ZFN 由 锌指蛋白 ZFP和FokI 融合而成 ZFP识别并结合特异DNA序列，FokI 通过二聚化产生核酸内切酶活性，在 该序列附近造成DNA双链断裂 （DSB）。 细胞在修复DSB时，可产生各种类型 的序列改变。
D
NHEJ:非同源性末端接合 将两断端快速连接起来，可随机丢失或插