第10章 蛋白质测定

蛋白质（酸、碱或酶解）→氨基酸 构成蛋白质的氨基酸主要是其中的20种， 而在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮氨 酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色
氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，
必须依靠食品供给 。
2、测定蛋白质的意义 蛋白质是食品的最重要质量指标，其含 量与分解产物直接影响食品的色、香、味。 测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食 品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高 产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生 产过程控制均具有极其重要的意义。
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说明：
① 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。
② 消化时不要用强火，应保持缓和沸腾，以免 粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存 在的情况下消化不完全而造成氮损失。
③ 消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用 冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进 其消化完全。 ④ 样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生 大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化 时应用小火加热，并时时摇动
消化液 + 40%氢 氧化钠加热蒸馏， 放出氨气。
3. 吸收与滴定
（1）用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示 剂用混合指示剂（甲基红—溴甲基酚绿混合指示剂pH5.1） 国标用亚甲基蓝+中性红（pH7.0绿→ 紫蓝）。 指示剂 红色 → 绿色 → 红色 滴定 吸收 （酸） （碱） （酸） （2）用过量已知量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸 收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用 甲基红指示剂（红→ 黄）。
％） ，主要是因为它能冒充蛋白质。
三聚氰胺的检测方法
1、阳离子交换柱/高效液相色谱测定乳与乳制品中的三聚氰胺
美国，Agilent公司
采用ZORBAX300SCX强阳离子交换色谱柱分析三聚氰胺， 在不含离子对试剂的简单流动相下能够很好地控制三聚氰 胺的保留；且该方法对三聚氰胺的选择性好，为乳与乳制 品中的三聚氰胺检测提供了一个的快速、简便而可靠的液
（二）茚三酮比色法
氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化台物
(除脯氨酸外均有此反应)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨
基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可以测 定样品中氨基酸含量。
二．个别氨基酸的定量测定
介绍了8种氨基酸的定量测定方法。P 179~186
第七节
一．薄层色谱法
氨基酸的分离与测定
在现有奶粉检测的国家标准中，主要进行蛋白质、脂肪、细 菌等检测。三聚氰胺属于化工原料，是不允许添加到食品中的， 所以现有标准不会包含相应内容。亦即三聚氰胺检测目前并无 国家标准。 食品中蛋白质含量的检测一般测出食品中的含氮量（N约为 16％），就可以推算出其中的蛋白质含量。要是蛋白质不够多，
说明牛奶兑水兑得太多。牛奶和奶粉添加三聚氰胺（N约为66.6
第三节 蛋白质的定量测定
一、 凯氏定氮法
由Kieldhl于1833年提出，现发展为常量、 微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。 书中只介绍前三种。
（一）常量凯氏定氮法
1、 原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋
白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸 出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫 酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。 ① 用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标 也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收
3、蛋白质的测定方法 凯氏定氮法——最常用的，国内外应用普遍。 双缩脲法、染料结合法、酚试剂法 国外：红外分析仪 用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质 换算系数（p151）。这里也包括非蛋白的氮，所以 只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等含非蛋白氮多 的要单测）。
4、氨基酸的测定
氨基酸总量——酸碱滴定-甲醛法测定。 另外还有茚三酮光度法、非水滴定法、邻苯二 甲醛荧光法、乙酰丙酮和甲醛荧光法、三硝基苯 磺酸法等 各种氨基酸的分离与定量——色谱技术。 有多种氨基酸分析仪。
上进行分离，采用不同的pH值和离子浓度的缓冲溶液洗脱，
酸性氨基酸和极性较大的氨基酸先被洗脱，其次是非极性的 和芳香性氨基酸，最后是碱性氨基酸；分子量小的比分子量
大的先被洗脱下来。
洗脱下来的氨基酸用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。
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双向展开：
二、气相色谱法
将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析 的衍生物——三氟乙酰基正丁酯。它包括用正丁醇的酯 化和用三氟乙酸酐(TFAA)的酰化两个步骤。将酰化好 的氨基酸衍生物进行气相色谱分析。
三、高效液相色谱法
由于大多数氨基酸无紫外吸收及荧光发射特性，因此
用HPLC法测定氨基酸时，需要对氨基酸进行衍生化后，
双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合 物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）
蛋白质分子中含有肽键 —CO—NH— ，与双缩脲 结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件 下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度 计来测其吸光度，确定含量。（560nm）
注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化.
（1）加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，
纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后可以提高 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
（2）加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点 指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。 （3）加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。
2. 蒸馏
蛋白质是生命的物质基础，人体11%~13%总 热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质， 只是含量及类型不同。
一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物 性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，
猪肉 9.5%，
兔肉 21%，
鸡肉 20%， 牛乳
3.5%， 带鱼 18.0%， 大豆 40%，面粉 9.9%， 菠菜 2.4%， 黄瓜 1.0%，苹果 1.4%
⑦蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢 氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。（氢 氧化铜在70～90℃时发黑）。
CuSO4作用： 蒸馏时碱性指 示剂
（二）微量凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前 2、与常量法不同点：
加入硼酸量50 ml 可用微量滴定管。 10 ml,
滴定用盐酸浓度0.1 mol/L
第十章 蛋白质和氨基酸的测定
第一节 概述
1、蛋白质概况
蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主
要由C、H、O、 N、S五种元素组成。某些蛋白质 中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。 在食品和生物材料中常包括蛋白质，可能还包 括有非蛋白质含氮的化合物，（如核酸、含氮碳水 化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色 素）。
相新方法。
8～10min/sample
LD：10μg/g
2、HPLC-UV检测三聚氰胺方法 美国食品药品监督管理局(FDA)和中国农业部
需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，采 用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，可以得到良好的分
离效果。
LD：2μg/g
3、LC-MS检测三聚氰胺方法 艾杰尔科技公司
0.01 mol/L ,
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（三）自动凯氏定氮法
1、原理及适用范围同前
2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶， 红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品
（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收
二、双缩脲法
1. 原理
脲（尿素NH2—CO—NH2 ）加热至150~160℃ 时，两分子缩合成双缩脲。
取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层 板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各 组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等 作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同 的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。 然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别 各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致 确定其含量。
2. 方法特点及应用范围
本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学 领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、 油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。
3．绘制标准曲线用标准样： 采用凯氏法测出的蛋白质样品。
三．紫外吸收法
1．原理：利用蛋白质的特有基团， 对紫外光有吸收作用在280 nm下，吸光度与蛋白 质浓度成直线关系，求含量。
⑤ 当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧 瓶冷却，加入30％过氧化氢 2—3 ml 后再继续 加热消化。
⑥ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但 对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品．如含赖 氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需 适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈 蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。
2．适用范围：
常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在 食品分析领域应用不广泛。
四．三聚氰胺检测
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮 杂环有机化工原料。简称三胺，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-
1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、 蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。
法，采用艾杰尔(Agela)ASB系列亲水色谱柱，不用离子对试
剂也能得到有效的保留与分离。因此方法中流动相不含离子 对试剂，可以用于质谱检测。
LD：0.5μg/g
第六节
（一）甲醛滴定法
氨基酸定量测定
一．氨基酸的一般定量测定
氨基酸具有酸性的羧基（一COOH）和碱性氨基（一 NH2 ）相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛 溶液时，一NH2 与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就 可以用强碱标准溶液来滴定一COOH，并用间接的方法测 定氨基酸总量。
三聚氰胺性状为纯白色单斜棱晶体，无味，溶于热水，，