M-CS固定化木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的初步研究

M—CS固定化木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶的初步研究

王志彬

邵阳学院生物与化学工程系湖南邵阳422000

指导老师：赵良忠

摘要

以自制壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂,并以Span-80为乳化剂，通过化学共转化法将Fe3O4磁性纳米粒子吸附在壳聚糖微球表面；经活化，得到一种生物亲和性好、分散性好、粒度均匀、表面富含功能环氧基的磁性壳聚糖微球；对木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶固定化，并初步研究了木瓜蛋白酶的用量和固定时间对木瓜蛋白酶固定效果及活性的影响，研究了固定时戊二醛的浓度和固定温度对菠萝蛋白酶固定效果及活性的影响。结果表明：制备微球时，壳聚糖的最佳浓度为3%，戊二醛质量百分数为25%。制备磁性壳聚糖时，适宜操作条件为：在壳聚糖微球中加入摩尔比为1：1的Fe2+和Fe3+的混合溶液，并60℃下浸泡40min，然后加入 2mo1／L的NaOH溶液。60℃水浴中反应40min，所得的磁性壳聚糖微球外观为球形、颗粒大小均匀，具有强磁响应性，加酶量为200mg/g载体。固定化木瓜蛋白酶，最适固定温度为5℃,pH为8；固定化菠萝蛋白酶蛋白酶最适温度为23℃，pH为6.0-9.0。酶活回收率为23.7%，固定化酶在热稳定性、pH稳定性和操作稳定性上较游离酶均得到了较大幅度的提高。

关键词：磁性壳聚糖；木瓜蛋白酶；菠萝蛋白酶；酶活力

The study of Magnetic Chitosan Immobilized Trypsin and Bromelain

Wang zhi-bin

(Department of Biology and Chemistry Engineering,Shaoyang University,Shaoyang

422000,China)

the guided teacher:Zhao liang-zhong

Abstract

Summarize:The study used Magnetic Chitosan asa carrier,

Glutaraldehyde as a crosslingking agent and Span-80 as a emulsifier to embed the chitosan microballoons，and the chitosan microballoons of Fe3O4 that passed by the object's surface by suspengding crosslingking method ,which synthesized a type of Magnetic Chitosan Microspheres of a

high-hydrophilic ,uniform size ,dispersion .At the same time ,the surface of composition was full of Funcional Epoxy .What's more,It also took Papain and Bromelain as Model Encyme to immobilize Protease ,and the study of the effect when it immobilize Papain and Bromelain. The results showed that the best concentration of Chitosan was 3% ,the volume of Glutaraldehyde was 25% ,to make Magnetic Chitosan, the best concentration of Fe 2+Fe3+Towas 1:1, immobilize Trypsi ,the most suitable temperature was 5 centigrade ,pH

8 ;To immobilize Bromelain ,the most suitable temperature was 55 centigrade ,pH for 6.0-9.0 ,and the recovery of enzyme activity was 23.7% .It also showed a more substantional increase than Free Enzyme in thermal stability ,pH stability and operational stability .

Key words :Magnetic Chitosan ;Bromelain ;Trypsin ;Enezy activity

目录

前言 (3)

1 材料与方法 (4)

1.1 材料、试剂、仪器 (4)

1.1.1 材料 (4)

1.1.2试剂 (4)

1.1.3 仪器设备 (4)

1.2操作步骤 (5)

1.2.1壳聚糖微球的制备[5] [6] (5)

1.2.2 磁性壳聚糖微球的制备 (5)

1. 2.3磁性壳聚糖微球的活化 (5)

1.2.4磁性壳聚糖微球固定木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶因素的影响 (5)

1.2.5酶活力测定 (6)

2结果与分析 (7)

2.1 壳聚糖微球制备的影响因素及其结构表征 (7)

2.2 磁性壳聚糖微球制备的影响因素 (11)

2.3 磁性壳聚糖微球的形态 (11)

2.4 酶量的影响 (13)

2.5戊二醛用量对菠萝蛋白酶效果的影响 (14)

2.6温度对固定化菠萝蛋白酶效果的影响 (14)

3结论 (15)

参考文献 (15)

前言

当前，常用来固定化的模式酶有很多很多，最常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等。用蛋白酶制成的食品有很多优点，但是一般所使用的蛋白酶的空间结构对环境变化十分敏感，各种物理因素的影响：如温度、压力、电磁场、振动；化学因素的影响：如氧化剂、还原剂、有机溶剂、金属离子、离子强度、PH值，以及生物因素如酶修饰剂和酶降解剂,均有可能使酶易丧失活性、反应后不能回收、不利于产物的分离、难于连续化生产等缺点,限制了酶在工业生产中的广泛应用[2]。为此,人们不断寻求其改善方法,其中之一就是酶的固定化酶生产多肽技术。该技术将蛋白酶束缚于特殊的相,而与其他相分隔开,但仍能进行相与相之间的分子交换.既可以保留酶的催化特性,又具有能回收、反复或连续使用等优点,且易与产物分离.固定化酶为酶的应用开拓了更广阔的前景.[3]。固定化酶比游离酶具有多方面的优点, 固定化蛋白酶与游离蛋白酶相比,无论对热、酸碱稳定性及在乙醇水溶液中的稳定性等方面都有较大的改善，而且大粒径磁性固定化酶不仅稳定性强于小粒径磁性固定化酶,而且在磁响应性、固定化酶的活性回收率方面也优于小粒径磁性固定化酶[13],所以固定化胰蛋白酶尤其是大粒径磁性固定化酶具有更广的使用范围和更好的使用特性,可用作工业化生产[4]。

固定化酶技术的关键之一是载体材料的选择，目前已有的各种高分子材料和无机材料被用于固定化酶载体的研究。其中，磁性微球载体因其独特的结构和功能已逐渐引起人们的关注。它是近二十年来发展起来的一种功能高分子材料。作为分离材料和载体，已在蛋白质分离纯化、固定化酶技术、免疫测定、靶向药物制备和细胞分离等方面得到广泛的应用[l][2]。磁性高分子微球的制备可采用共混包埋法、单体聚合法和化学转化法等[3][5]，目前常见的是将无机磁性微粒包埋在高分子材料中，在微粒表面直接引入有机官能团，使其与酶分子间的相互作用加强，有利于提高固定化的偶联效率，且磁性载体有在外加磁场下快速分离的优点。本文以壳聚糖磁性微球为载体固定化胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，包括M─CS的制备条件摸索、探索了固定化条件，研究了壳聚糖磁性微球为载体固定化酶的效果。通过磁性微球固定化的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶具有更广的使用范围和更好的使用特性，可用作工业化生产。为生产和研究带来更大的便利。