断奶前后仔猪小肠Proglucagon mRNA的时空特异性表达

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2007,15(4):719~720
*基金项目： 国家自然科学基金项目(No.30270975)和国家重点基础研究发展规划（973）项目(No.2004CB117505)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 主要从事营养生理学研究。

E­mail:<lapb@>.
收稿日期： 2006­09­19接受日期： 2006­11­16·研究简报·
断奶前后仔猪小肠不同肠段胰高血糖素原mRNA的表达 *
王丽娜, 张 磊,倪迎冬,杨晓静, 陈 杰, 赵茹茜 **
（南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室,南京 210095）
关键词：仔猪；断奶；小肠上皮；胰高血糖素样肽 ­2
中图分类号： S188 文献标识码： A 文章编号： 1006­1304(2007)04­0719­02
Pattern of mRNA Expression in Different Small Intestine Segments
of Weaning Piglets
WANG Li­na,ZHANG Lei,NI Ying­dong,YANG Xiao­jing,CHEN Jie,ZHAO Ru­qian
**
piglets;weaning;intestinal epithelium;glucagon­like peptide2
研究表明， 成年猪的肠上皮细胞大约2~4d更新 1次， 而 新生仔猪肠上皮细胞7~10d才能完成1次更新。

仔猪的胃肠 道功能发育迟缓，使其不能适应生产上早期断奶的需要， 出 现食欲不振、 腹泻， 甚至死亡。

仔猪断奶后小肠的功能发生相 当大的改变(Boudry ,2004)。

但这个转变的内在机制目前 还不清楚。

胰高血糖素样肽 ­2（GLP­2） 是由小肠L细胞分泌的一种 33个氨基酸组成的小肽， 与小肠上皮生长关系密切(Petersen .,2002)。

对 GLP­2的研究发现其可能在动物断奶前后小 肠结构与功能的变化中起重要作用， 然而， 断奶前后仔猪小 肠上皮更新缓慢是否与编码 GLP­2的基因胰高血糖素原 （ ） 的时空特异性表达有关， 尚未见文献报道。

因 此，本实验采用相对定量 RT­PCR方法研究
mRNA在仔猪断奶前后不同肠段粘膜的表达模式。

1材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
试剂盒 (Ambion Inc.Austin,Texas,USA)； M­MLV Reverse Transcriptase(Promega， USA)； 电泳凝胶成像分析系统 (EASTMAN KODAK COMPANY Rochester,New York,USA)。

1.2 动物及采样
选取 2或 3胎龄的新淮经产母猪 9头， 其分娩后的 9窝 仔猪自由吮乳和饮水， 按常规程序免疫。

仔猪12日龄时开始 饲喂全价乳猪料 （正大集团， 江苏）， 于 35日龄断奶， 并分别 于 28、 35、 38、 42和 45日龄时从 9窝仔猪中随机选取 6头， 屠宰， 迅速采取十二指肠、 空肠 （后段） 和回肠肠段分别纵行 剖开，生理盐水冲洗后用载玻片刮取粘膜并置于液氮中速 冻。

-70 ℃下冷冻保存。

1.3 相对定量 RT­PCR
采用异硫氰酸胍­酚 ­氯仿一步法提取各肠段黏膜组织 的总 RNA。

鉴定总 RNA提取质量后取 2滋g 进行反转录， 总 体系为 25滋 L， 按照试剂盒说明书操作。

胰高血糖素原基因的引物根据 GenBank（AY242124） 提 供的全序列设计。

上游引物为： 5'­ACTCACAGGGCACGTTTA­3'；
下游引物为： 5'­CTCGGGTGGCAAGATTAT­3'。

引物由大连宝生物公司合成。

采用 rRNA作内标， 用 混合样品(待测样品等比例混合)建立最佳反应条件和校正不同 批次反应的差异。

PCR反应体系为 25滋 L， cDNA2滋 L， 0.5U DNA聚合酶， 2.5滋 L10伊 PCR Buffer， 0.4滋 mol/L dNTP,1.6 mmol/L MgCl2， 0.4滋 mol/L目的基因引物， 0.36滋 L rRNA 引物和 1.64滋 L Competimer。

PCR扩增条件为： 94 ℃ 5min， 94℃ 30s， 54℃ 30s， 72℃ 45s,共28个循环； 72℃ 10min。

每 个样品作2次重复，同时用 ddH 2 O和RNA样品分别取代RT 产物作对照,以检验是否有外源和基因组DNA污染。

取 20滋 L PCR产物在 2.0%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化 乙锭 （EB） 染色。

用 Kodak1D图象分析系统分析条带灰度， 根据目的基因胰高血糖素原和内标 PCR产物的灰度比， 确定样品中胰高血糖素原mRNA表达的相对含量。

1.4 数据统计和分析
农 业 生 物 技 术 学 报 2007年
数据用平均值依标准误表示。

采用 SPSS11.0统计软件 ()进行数据处理和差异显著性分析 （单因 子方差分析 one way ANOVA， LSD）。

2结果
2.1 仔猪十二指肠、空肠和回肠中胰高血糖素原 mRNA 的 表达
胰高血糖素原在3个肠段表达量不同。

十二指肠胰高血 糖素原 mRNA表达非常弱，而空肠和回肠中的表达丰度显 著高于十二指肠 （图1)。

图 1.十二指肠、 空肠和回肠中胰高血糖素原 mRNA的表达 Fig.1. mRNA expression in duodenum,jejunum and ileum
of weaning piglets
2.2 空肠胰高血糖素原mRNA的时间 （日龄） 特异性表达
由图 2可见，仔猪空肠胰高血糖素原 mRNA的表达丰 度28~38日龄均保持较高水平， 而在断奶后 1周时 （42日龄） 达到最低， 断奶后 10d（45日龄） 时有所回升， 但仍低于断奶 前水平。

图 2.断奶前后空肠中胰高血糖素原 mRNA表达的变化 Fig.2.Age­related changes of mRNA expression in
jejunum of weaning piglets
A.电泳图，M,PUC19marker；
B.统计图， 不含相同英文字母者存在显著性差 异( <0.05, =6)。

A.Electrophoresis images,M,PUC19marker;B.Column diagrams of statistical results.Means not sharing common letter differ
significantly( <0.05, =6). 2.3 回肠胰高血糖素原mRNA的时间 （日龄） 特异性表达
图 3显示，回肠中胰高血糖素原基因 mRNA的表达在 整个实验观察期保持稳定， 在断奶前后并没有显著的变化。

图3.断奶前后回肠中胰高血糖素原mRNA表达的变化 Fig.3.Age­related changes of mRNA expression in ileum
of weaning piglets
A.电泳图， M,PUC19marker；
B.统计图。

A.electrophoresis images,M,PUC
19marker;B.Column diagrams of statistical results.
3讨论
本实验结果表明胰高血糖素原基因在小肠中的表达呈 现明显的空间 （肠段） 特异性， 空肠和回肠表达丰度较高， 而 在十二指肠表达很少,这与肠道中 L细胞的分布一致(Otto and Dworzecki,2004)。

胰高血糖素原 mRNA在仔猪空肠和回 肠的表达显示截然不同的时间 （日龄） 特异性模式。

空肠胰高 血糖素原 mRNA表达在 42日龄之前保持较高水平， 而在断 奶后1周和断奶后 10d显著下降。

有研究报道了 21d断奶 的仔猪血浆中 从胚胎期到断奶后水平的变化规律(Pe­ tersen ,2003)，从其结果看 GLP­2蛋白水平的变化规律 与本实验中基因表达的变化规律恰恰相反。

以此看来 GLP­2在血浆中水平与其在细胞中的表达存在复杂的相互调节， 但 也不能排除摄食， 动物品种和断奶时间的影响。

回肠中胰高 血糖素原 mRNA表达水平未检测到日龄相关的变化，但回 肠中的表达水平一直维持在较高的水平。

仔猪生长发育阶段胰高血糖素原 mRNA的表达和 GLP­2肽的分泌呈现不同的调控方式， 其机制还有待于进一
步的研究。

参 考 文 献
Boudry G,Peron V,Huerou­Luron I,Lalles J P and Seve B.Weaning
induces both transient and long­lasting modifications of absorptive,
secretory,and barrier properties of piglet intestine(J).
,2004,134(9):2256~2262
Otto B E and Dworzecki T.Glucagon­like peptides-synthesis,biological
actions and certain clinical implications(J). 2004,
61(9):947~950
Petersen Y M,Elnif J,Schmidt M and Sangild P T.Glucagon­like
peptide2enhances maltase­glucoamylase and sucrase­isomaltase
gene expression and activity in parenterally fed premature neonatal
piglets(J). 2002,52(4):498~503
Petersen Y M,Hartmann B,Holst J J,Huerou­Luron I,Bjornvad C R
and Sangild P T.Introduction of enteral food increases plasma
and decreases receptor mRNA abundance during pig
development(J) ,2003,(133):1781~1786 720。