诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(3):456~460

*基金项目： 国家科技支撑计划（No.2006BAD14B08­09） 和河北肉用绵羊品种选育项目 （No.06220402D­3） 资助。

**通讯作者。Author for correspondence.教授， 主要从事动物配子 /胚胎生物工程技术领域的研究。E­mail: . 收稿日期：

2007­10­31 接受日期： 2007­12­10 ·研究论文

· 诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产 *

陈晓勇 1 ,田树军 1,2 **, 桑润滋 1,2 , 孙树春 1,2 ,赵驻军 1,2 ,李俊杰 1,2 , 敦伟涛 3

（1.河北农业大学动物科技学院， 保定 071001； 2.河北省牛羊胚胎工程技术研究中心， 保定 071001；

3.河北省畜牧兽医研究所，

保定 071001） 摘要：研究了羔羊年龄、运输应激和重复超排对幼羔所获卵母细胞数量的影响，以及胚胎发育液中添加乙二胺四乙酸 （EDTA ） 对幼羔体外胚胎发育能力的影响。结果表明： 6～8周龄组幼羔超排的每只平均获卵数和可用卵数 （60.8 枚和 58.2枚） 显著高于 12～14周龄组 （27.3枚和26.0枚）（ <0.05）； 运输应激不影响幼羔超排所获卵母细胞数量 （ >0.05）， 但重复幼羔超 排显著降低所获卵母细胞数量 （ <0.05）。 在胚胎发育液中加入10滋 mol/L EDTA 可显著地提高幼羔体外早期胚胎的发育能力 （ <0.05）， 并且部分体外胚胎移植后成功产下健康后代。

关键词： 幼羔； 卵母细胞； 胚胎 中图分类号: S185 文献标识码:A

文章编号: 1006­1304(2008)03­0456­05

Inducement of Lamb Follicular Development and Embryo Production

CHEN Xiao­yong 1 ,TIAN Shu­jun 1,2 **,SANG Run­zi 1,2 ,SUN Shu­chun 1,2

,

ZHAO Zhu­jun 1,2 ,LI Jun­jie 1,2 ,DUN Wei­tao

3

Effect of lamb age,transport stimulation and repeated hormone superovulation on the number of collected oocytes

were determined,and effect of the culture medium containing ethylene­diamine­tetra­acetic acid (EDTA)on the development of produced embryos from lamb oocytes

were studied.Results indicated that the mean number of collected and available oocytes

from per 6­to 8­week lamb were 60.8依 13.9and 58.2依 12.3respectively,which were more than that those (27.3依 5.1and 26.0依 4.9) from per 12­to 14­week lamb ( <0.05),respectively;The transport stimulation didn ’ t decreased the number of collected oocytes from the superovulation lambs( >0.05),however,the number of collected oocytes in the repeated superovulation group was reduced significantly compared with the control group ( <0.05);The embryonic culture medium containing 10滋 mol/L EDTA could improve significantly the development capability of produced embryo from lamb oocytes ( <0.05),and the healthy lambs were born

by the embryo

transfer.

juvenile lamb;oocyte;embryo

诱导幼羔卵泡发育技术，

简称幼羔超排技术， 可 使每只 1～2 月龄羔羊平均每次超排获得可用卵母 细胞 80～160 枚 （Kelly ,2005a,b ）， 显著高于成

年羊超排 10～20 枚 （Koema ,2003）， 而成年羊 不超排则仅能获得 3.6～6.6 枚 (Shirazi

.,2005)

可用卵母细胞。 因此， 如果将幼羔超排技术与羊体外 受精技术、

胚胎移植技术进行组装集成 （juvenile embryo transfer,JIVET ） 运用于养羊生产，

可将 羊的繁殖效率较常规胚胎移植提高约 20 倍， 较自然 繁殖提高约 60 倍，并使世代间隔缩短到正常的

1/3～1/4， 这将大大加快羊育种及品种改良进程， 同 时也将解决羊胚胎移植商业化所需胚胎来源匮乏及 胚胎生产成本昂贵的问题， 应用前景十分广阔。 目前， 国外对幼羔超排的研究结果表明，

幼羔超

第 3期 陈晓勇等:诱导幼羔卵泡发育及体外胚胎生产

排所获可用卵母细胞数量易受供体羔羊品种、年龄 等因素影响 （Morton ,2005a）， 且所生产体外胚 胎发育能力较成年羊弱 （Morton .,2005b;Leoni .,2006）。 目前， 对我国地方良种羊进行幼羔超排 尚无相关报道。 为此， 本研究开展了小尾寒羊羔羊年 龄、 运输应激和重复超排对所获卵母细胞数量， 以及 发育液中添加乙二胺四乙酸 （EDTA） 对幼羔体外胚 胎发育能力的影响， 目的是为 JIVET技术在我国养 羊生产中推广应用提供参考依据。

1材料和方法

1.1 试剂

促卵泡素 （FSH） 购自 Immuno Chemicals Products Ltd.(Auckland,New Zealand)和宁波第二激 素厂； 胎牛血清购自 Hyclone(Utah,USA)， 孕酮栓 （CIDR） 购自 Pharmacia&Upjohn Pty.Ltd； 孕马血清 （PMSG） 购自天津市华孚高新生物技术公司， 发情 羊血清为自制。 除非特别说明， 其它化学试剂均购自 SIGMA(Sigma Chemical,St.Louis,MO,USA)。 1.2 幼羔超排方法

在幼羔年龄对超排所获卵母细胞数的影响试验 中，选择发育整齐、健康状况良好的 6～8周龄和 12～14周龄哺乳小尾寒羊羔羊，参照 Kelly （2005a） 报道方法进行幼羔超排， 具体方法为： 间隔 12h进行连续 4次肌肉注射 FSH(Immuno Chemicals Products Ltd.Auckland,New Zealand)， 每 只羔羊总剂量为 160mg，最后一次注射 FSH同时 肌肉注射 PMSG500IU。在运输应激对幼羔超排所 获卵母细胞数的影响试验中， 运输应激组 （简称应激 组）羔羊在开始超排前大约 24h用机动车运输 100 km（约 2h）， 对照组不运输， 应激组和对照组羔羊龄 为 6～8周龄， 每只羔羊 FSH总剂量为 240IU(宁波 第二激素厂)， 超排方法同上。在幼羔重复超排对所 获卵母细胞数的影响试验中， 重复超排是在 6～8周 龄羔羊第 1次超排后间隔 3周，进行第 2次重复超 排， 超排方法同第 1次超排， 每只羔羊 FSH总剂量 为 240IU(宁波第二激素厂)。

1.3 幼羔卵母细胞采集

超排羔羊于最后一次肌肉注射 FSH后 6～14 h， 采用手术法活体采集卵母细胞， 方法为： 将卵巢引 到腹腔外，用带有 18G针头的 20mL注射器抽吸 卵巢上可见卵泡，在显微镜下将卵丘 ­卵母细胞复 合体 （COCs） 检出， 其中形态正常、 胞质均匀和颗粒 细胞不少于 3层的 COCs为可用卵母细胞。记录每 只羔羊所获卵母细胞数和可用卵母细胞数。 1.4 卵母细胞体外成熟

将可用卵母细胞在成熟液中洗 3次，移入 100滋 L成熟液滴中 （Nunc产 35mm伊 10mm培养皿， 液 滴上覆盖矿物油， 在培养箱中预先平衡 4h）， 每个液 滴放入 15～20枚卵母细胞,置于 5%CO 2、 饱和湿度 和 39 ℃的 CO2培养箱中成熟培养 24h。成熟培养 液组成为： M199+100滋 mol/L半胱氨酸 +l0滋 g/mL促卵泡素 +10滋 g/mL促黄体素 +1滋 g/mL 雌二醇 +10%(V/V)胎牛血清。

1.5 体外受精

体外培养成熟的卵母细胞用口吸管进行吹打， 除去部分颗粒细胞， 在受精液中洗 3次， 移入 30滋 L 的受精液滴中（Nunc产 35mm伊 10mm培养皿， 液 滴上覆盖矿物油， 在培养箱中预先平衡 4h）， 每个液 滴放入 10～20枚卵母细胞， 然后加入密度为 1伊 10 6个 /mL的获能精子。精子和卵母细胞在 5%CO2、 饱 和湿度和 39℃的 CO 2培养箱中共孵育 24h。 受精液 组成为： SOF液 +20%发情羊血清(V/V)+5IU/mL肝 素钠。

1.6 胚胎体外发育

于体外受精 24h，将受精卵用口吸管吹打脱除 颗粒细胞， 在胚胎发育液中洗 3次， 移入 30滋 L发 育液滴中 （Nunc产 35mm伊 10mm培养皿， 液滴上 覆盖矿物油， 在培养箱中预先平衡 4h）， 每个微滴放 入假定受精卵 15～20枚，置于含有混合气 （5% CO2， 5%O2， 90%N2）、 100%湿度和 39 ℃的 CO2培 养箱中进行体外发育培养。EDTA组胚胎发育液组 成:SOF+1%非必需氨基酸 (V/V)+1%必需氨基酸 (V/V)+8mg/mL牛血清白蛋白 +10滋 mol/L EDTA,对照组胚胎发育液组成:SOF+1%非必需氨基酸 (V/V)+1%必需氨基酸 (V/V)+8mg/mL牛血清白蛋 白。

1.7 受体羊同期发情及胚胎移植

受体绵羊阴道埋植 CIDR15d， 撤去 CIDR同时 每只受体注射 PMSG250IU。于受体羊发情后 2d， 采用手术法将胚胎移入受体卵巢上黄体发育良好的 同侧输卵管内， 每只受体移入 4～8细胞的体外受精 胚胎 5～6枚。统计移植受体的产羔结果。

1.8 统计分析

实验结果采用 SPSS统计软件 One­Way ANOVA程序进行方差分析。

2结果

2.1 幼羔年龄对超排所获卵母细胞数的影响

不同周龄羔羊超排所获卵母细胞数的结果如表

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