TGF_1对不同肺癌细胞生物学行为的影响

收稿日期:2001-10-19.

基金项目:湖北省教育厅重点资助项目(2001A08009).

作者简介:魏文科(1956-),男,副教授,主要从事医学细胞生物学和分子生物学研究.

TGF -β1对不同肺癌细胞生物学行为的影响

魏文科,侯建军,刘希林

(湖北民族学院医学院,湖北恩施445000)

摘要:用重组人转化生长因子β1(TG F -β1)处理不同的肺癌细胞95C 、95D ,研究TG F -β1对不同肺癌细胞迁

移、粘附等生物学行为的影响,从而揭示肿瘤细胞的恶性行为机制.按Dean Sheppard 方法测定细胞迁移能力;

用划痕法和琼脂滴法测定细胞迁移能力;同时还测定了各肺癌细胞的铺展.结果表明:95C 的迁移能力、细胞

铺展率和增殖率最高,95D 次之;用TG F -β1处理后,95C 、

95D 与Fn 的粘附率和铺展率较对照组都有显著增加,TG F -β1处理24、48h 后可以明显增加两株肺癌细胞的迁移率.TG F -β1处理对两株肺癌细胞的增殖和生

长无显著影响.提示不同肺癌细胞迁移和粘附能力存在差异,TG F -β1对肺癌细胞生物学行为存在显著影响.

TG F -β1对所介导的信号转导通路起着重要的调控作用,从而影响肺癌细胞的若干生物学行为.

关键词:TG F -β1;肺癌细胞;生物学行为

中图分类号:R734.2;R73-37 文献标识码:A 文章编号:1008-8423(2002)02-0040-05

整合蛋白是一类存在于细胞表面的跨膜粘附分子,主要介导细胞与细胞外基质(Extracellular Matrix ,EC M )以及细胞与细胞之间的粘附作用.整合蛋白由α与β亚基以异源二聚体的形式形成20余种不同的受体.整合蛋白不仅作为细胞骨架分子的成员之一,其所介导的粘附作用以及信号转导机制参与调节多种细胞功能,在胚胎发育、形态发生、炎症反应、血栓形成、细胞增殖分化、凋亡和肿瘤细胞的迁移、浸润等方面均起

着重要的作用[1,2].近年来有关研究表明,多种信号分子在信号转导过程中有“串话”

(Cross -T alk )现象,尤其是生长因子受体和整合蛋白分别介导的信号转导的通路之间[3,4].目前的工作已发现TG F -β1对许多组织细

胞表面的数种整合蛋白亚基α1、α2、α3、α5,β

1有调节作用,从而影响这些细胞的由整合蛋白所介导的信号转导及其所参与调节的细胞生物学行为[5,6].本文拟在上述工作的基础之上,研究TG F -β1对不同肺癌细胞生物学行为的影响,探讨其与不同肺癌细胞恶性行为的关系.

1　材料和方法

1.1　材料

巨细胞肺癌高、低转移株95C 、95D 来自北京解放军总医院病理科;RPMI1640培养基为GI BC O 公司产品;小牛血清为上海市放射医学研究所监制产品.小牛血清白蛋白(BS A )购自Sigma 公司.纤维连接蛋白(Fi 2bronectin ,Fn );左旋多聚赖氨酸(L -poly -lysine )购于北京中山科技公司.重组人转化生长因子-β1购自R &D System Inc.6孔、24孔、96孔细胞培养板为美国C oring 公司产品,C O 2培养箱为法国Jouan 公司产品,倒置相差显微镜为日本Olym pas 公司产品.

1.2　方法

1.2.1　细胞培养　将2株肿瘤细胞在含10%热灭活小牛血清,青霉素(100U Πml )和链霉素(100μg Πml )的RP 2

MI1640培养液中于37℃,5%C O 2下培养.TG F -β1处理肺癌细胞的方法参考Jones 等的方法[7].

1.2.2　细胞粘附能力测定　按照Dean Sheppard 方法[8],将用P BS 稀释的多聚赖氨酸(LP L )(100μg Πml ),Fn

(10μg Πml ),BS A (1%)各100μl 包被96孔板,37℃包被1h 后以P BS 洗2遍,再用1%BS A 封闭1h ,P BS 洗2遍.细胞以2m M E DT A 脱壁收集后用P BS 离心洗涤2次,用无血清培养液制成细胞悬液,每个样品计数3第20卷第2期

2002年6月湖北民族学院学报(自然科学版)Journal of Hubei Institute for Nationalities (Natural Science Edition )V ol.20　N o.2Jun.2002

次,取平均值,然后将细胞悬液尽可能调节成相同浓度,以每孔100μl 加入包被好的培养板中,37℃,5%C O 2孵育1h.取出96孔板,轻柔洗去未粘附的细胞,每孔用100μl l0%中性福尔马林于室温固定,30min 后洗去,每孔加100μl 0.5%结晶紫染色过夜,洗后用Bio -RAD 公司的S LT 210酶标仪测定(波长570nm )其OD 值.细胞粘附率的计算如下:

细胞粘附率(%)=OD 570细胞粘附于Fn -OD 570细胞粘附于BS A OD 570细胞粘附于LP L -OD 570细胞粘附于BS A

1.2.3　划痕法测定细胞迁移能力[9,10]　取80%汇合的细胞,胰蛋白酶消化后以1.2×106

个细胞Π孔接种于包被有Fn 的6孔培养板上,贴壁12h 后换无血清培液培养24h ,细胞基本汇合.用无菌1ml 枪头垂直在培养板底划平行、垂直的4条“划痕”,无血清培液冲洗若干次,以洗去被划下的细胞,加入对照培液及含10ng Πml 的TG F -β1的培养液,于指定时间点在倒置相差显微镜下计数距离划痕0.2mm 内的细胞数,每组设双复孔,3次独立实验.

1.2.4　琼脂滴法测肿瘤细胞迁移能力[11,12]　将肿瘤细胞混入琼液溶液,利用琼脂溶液可凝固特性,将肿瘤

细胞置于一定位置,琼脂中的细胞可向周围作全方位移动,因此用来测定细胞的移动特性.取无菌2%琼脂

糖融化备用.将80%汇合细胞消化脱壁制成单细胞悬液,离心后加入100μl RPMI 1640培养液重悬,置37℃,

加入16.7

μl 2%琼脂糖溶液,混匀制成0.3%琼脂糖肿瘤细胞悬液,用微量加样器将1.5μl 悬液加入24孔培养板中,每孔3～4滴,置4℃10min 使冷却凝固,在倒置相差显微境下测量琼脂糖滴的半径为基数(r ),加入含1%血清的培养基培养6～8min 后,无血清培养液洗涤2次,加入对照无血清培养液及含10ng Πml 的TG F -β1

无血清培养液培养过夜.于指定时间点测定8个方位的半径值,计算均值(r ’),以r ’-r 评价细胞迁移的能

力.每个点计数5个琼脂滴,3次独立实验.

1.2.5　细胞铺展能力测定[13]　胰蛋白酶消化细胞,收集细胞以P BS 洗涤,培养液悬浮细胞并调节至15000

个细胞Πml.以200μl 孔加入到Fn 包被好的24孔培养板,37℃、5%C O 2条件下孵育.每30min 观察细胞的铺展百分率.随机取视野计数200个细胞,呈球形透明的为未铺展状态,边缘伸出伪足并伸展呈扁平圆形的为铺展状态.每个时间点均作复孔,每次实验重复3次.

1.2.6　细胞生长曲线[14]　对数生长期的细胞经胰酶消化后,每个10ml 培养瓶接种2×105

细胞,培养8d.

每2d 随机取3瓶进行细胞计数,每瓶细胞计数3次.

1.2.7　数据处理　用SPSS 统计软件包进行t -测验.表中数据以均值±标准误表示.2　结果

2.1　TG F -β1处理不同肺癌细胞时其与Fn 粘附力的变化

以Fn 包被96孔板时,分别用1、5、10、15ng Πml 的TG F -β1处理95C 、

95D 两株肺癌细胞.48h 后,两株细胞在Fn 包被板上粘附率逐渐增高,与未处理组比较,95C 在不同TG F -β1浓度下分别是处理组的1.02、

1.32、1.98、1.74倍,95D 则分别为未处理组的1.21、1.53、

2.35、2.07倍.同样,以10ng Πml TG F -β1处理不同细胞以不同的时间后,细胞与Fn 的粘附率也增加,两株细胞增加的幅度有所不同.如图1所示

.

图1　不同浓度生长因子对肺癌细胞粘附率影响

Fig.1　E ffect of various concentration of TG F -β1on lung carcinoma cell adhesion.

2.2　用TG F -β1处理后各肺癌细胞株迁移能力变化

应用划痕法和琼脂滴法测定TG F -β1处理后各肺癌细胞株的迁移能力,其结果分别见表1、

表2.14第2期魏文科等:TG F -β1对不同肺癌细胞生物学行为的影响