中国部分地区非综合征型耳聋患者GJB2基因233～235delC突变频率分析

ｈｄｙ３０１＠２６３．ｃｏｍ） 【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】 ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＧＪＢ２ ２３３～２３５ｄｅＩＣ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ（ＮＳＨＩ）ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ。ＭＥＴＨＯＤＳ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｉｎｃｌｕｄｅ ９１ ７ ｓｔｕｄｅｎｔｓ
ＣＨＩＮ ＡＲＣＨ ＯＴＯＬＡＲＹＮＧＯＬ ＨＥＡＤ ＮＥＣＫ ＳＵＲＧ／Ａｐｒｉｌ ２００６，Ｖ０１．１ ３，Ｎｏ．４ ２２３
万方数据
中国耳鼻啊囊头翻外科／２００６年４月，第１３卷，第４期
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ Ｔｈｅ ｈｏｔ ｓｐｏｔ ｏｆ ＧＪＢ２ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉＳ ２３３～２３５ ｄｅｌＣ．Ｔｈｅ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｉＳ １ ７．０１％ａｎｄ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ．Ａｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｒｅ
基金项目：国家８６３课题资助项目（２００４ＡＡ２２１０８０）和国家自然科 学基金资助项目（３０５７２０１５） 第一作者简介及通讯：于飞，女，吉林人，在读博士，主治医师，主 要研究方向为聋病的分子诊断。 Ｅｍａｉｌ：ｐｌａｙｕｆｅｉ＠１ ６３．ｃｏｍ 通讯作者：韩东一（Ｅｍａｉｌ：ｈｄｙ３０１＠２６３．ｃｏｍ）
Ｌｉｘｉａｎｌ。ＹＵＡＮ Ｈｕ∥ｕｎｌ．ＹＡＮＧ Ｗｅｉｙａｎｌ，ＷＵ Ｂａｉｌｉｎ２ （１ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｙ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｕｒｇｅｒｙ，
ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｅａｆｎｅｓｓ，ＰＬＡ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，１ ００８５３，Ｃｈｉｎａ； ２ Ｇｅｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’Ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，０２１１５，ＵＳＡ） ＣＯ ｒｒｅＳＰＯｎｄｉｎｇ ａｕｔｈＯ ｒ：ＨＡＮ ＤＯｎｇＹｉｆＥｍａｉｌ：
ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（ｘ２＝１ ７．９９８，Ｐ＜０．０５）． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｇｅｎｅｓ；Ｍｕｔａｔｉｏｎ：Ｈｅａｒｉｎｇ Ｉｍｐａｉ ｒｅｄ
Ｐｅｒｓｏｎｓ
耳聋是临床上一种常见的疾病，造成耳聋的原因 很多，一半以上的儿童期耳聋为遗传性聋，发病率为 １／８００Ｎ１／１０００‘…，其中８０％的患者除耳聋外不伴有其 他症状，称为非综合征型耳聋（ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ，ＮＳＨＩ）瞄】。ＮＳＨＩ的遗传方式多为常染色 体隐性遗传，占７５％～８０％。根据人口调查，约有 ５０％的白种人常染色体隐性遗传的耳聋是由ＧＪＢ２基因 突变导致的ｐＪ。本文采用酶切的方法，对我国广东、广 西、河南、河北、山西、黑龙江、吉林、内蒙古等地区 聋哑学校的９１ ７例散发非综合征型耳聋患者进行ＧＪＢ２基 因２３３Ｎ２３５位点的检测，以了解中国不同地区人群的 ２３３～２３５ｄｅｌＣ突变频率是否不同，并期待为不同地区耳 聋患者家庭未来的婚育指导提供遗传学上的理论基础。
（含ＭｇＣｌ２１ ５ ｍｍｏｌ／Ｌ）５ ＵＩ，１ ０倍脱氧核苷三磷酸 ５ Ｕ Ｊ，上下游引物（浓度２ ｐｍｏｌ／Ｌ）各２。５ ｐｌ，力Ｉ］ＤＮＡ 聚合酶（法特捷，２．５ Ｕ／ｐ１）１ ｐｌ。ＰＣＲ反应在（美国生 物公司ＡＢＩ ２７００）热循环仪上完成，反应条件为９４℃５ 分钟；９４℃３０秒，５８℃３０秒，７２℃３０秒，３０个循环； ７２。Ｃ延伸５分钟。ＰＣＲ产物４℃保存。取４ ｐｌ ＰＣＲ产物 进行１％琼脂糖凝胶电泳（含溴化乙锭０．５ ｐｇ／ｍ１）检测 产物，扩增片段９４４ ｂｐ。 １．２．４酶切分析。在１０ ＵＩ的反应体系中加入５ ＵＩ的ＰＣＲ 产物，１０倍缓冲液１ ｐｌ，Ａｐａ Ｉ酶（ＴａＫａＲａ，宝生物 工程有限公司）１５ Ｕ，３７℃水浴２小时。设置阳性对照 和阴性对照标本。将１ ０ ｕ Ｊ酶切产物全部进行２％琼脂糖 凝胶电泳（含溴化乙锭０．５ ｐｇ／ｍ１）检测。阴性对照在 ５８５ ｂｐ、３５９ ｂｐ呈现两条电泳带，阳性对照在９４４ ｂｐ 可见一条电泳带。女Ｄ２３３Ｎ２３５ ｄｅＩＣ突变，则酶切位点 消失。仅见～条９４４ ｂｐ的扩增带者为纯合子患者；５８５ ｂｐ、３５９ ｂｐ处可见两条带者为无２３３－２３５ ｄｅｌＣ突变患 者；９４４ ｂｐ、５８５ ｂｐ、３５９ ｂｐ－－条带者为杂合子患者。 １．２．５统计方法。用ＳＰＳＳ １ ０．０软件进行统计学分析，
１．１临床资料。选取来自广东、广西、河南、河北、山 西、黑龙江、吉林、内蒙古等地区聋哑学校的９２８例散 发耳聋患者，人选患者共９１７例，均为非综合征型耳聋 患者，年龄３Ｎ２５岁，平均年龄１２．９岁。人选标准：３岁 以上耳聋患者全部接受纯音听力检查，提示所有耳聋患 者均为双侧重度，极重度耳聋；３岁以下耳聋患者既往脑 干诱发电位提示为双侧重度／极重度感音神经性耳聋。排 除标准：排除与国外种族联姻家族史者：外耳、中耳畸 形者；伴有全身疾病者；智力障碍者：综合征性耳聋患 者。所有患者家长均签署知情同意书。对照组：听力正 常儿童２０４例，所有家长签署知情同意书。 １．２方法。 １．２．１ ＤＮＡ铜Ｊ备。试剂盒提取ＤＮＡ（上海华舜生物工 程有限公司），取适量用紫外分光光度计（ｂｅｃｋｍａｎ ＣＯＵＩｔｅ ｒ ＤＵ８００）进行定量和纯度检测，其余保存 于一７０℃冰箱（ＳＡＮＹＯ）备用。 １．２．２引物设计与合成。ＧＪＢ２基因的编码区位于第 －９１、显子，设计引物为５。一ｔｔｇｇｔｇｔｔｔｇｃｔｃａｇｇａａｇａ一３’，５’一 ｇｇｃｃｔａｃａｇｇｇｇｔｔｔｃａａａｔ一３。，扩增片段９４４ｂｐ，扩增产物 覆盖全部编码区。 １．２．３聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＰＣＲ）扩增。通过ＰＣＲ反应扩增ＤＮＡ编码区。在５０ ＵＩ 的反应体系中加入１００ ｎｇ的基因组ＤＮＡ，１０倍缓；中液
２３３Ｎ２３５ｄｅｌＣ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＧＪＢ２ ｇｅｎｅ ｉｎ ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ ｈｅａｒｉｎｇ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ ＹＵ Ｆｅｉ７；ＤＡＩ Ｐｕ７，ＨＡＮ Ｄｏｎｇｙｉ７，ＣＡＯ Ｊｕｙａｎ９１，ＫＡＮＧ Ｄｏｎｇｙａｎ９１ ｔＬＩＵ Ｘｉｎｌ。ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎｌ．ＬＩ Ｍｅｉｌ。ＬＩＵ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ），ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＪＢ２ ｇｅｎｅ
ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃＩｅａｓｅ．ＲＥＳＵＬＴＳ ２３３～２３５ｄｅＩＣ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ
ｉｎ １ ５６ ｃａｓｅｓ（１ ７．０１％）．Ｓｉｘｔｙ—ｎｉｎｅ ｃａｓｅｓ（７．５２％）ｗｅｒｅ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ａｎｄ ８７ ｃａｓｅｓ（９．４９％）ｗｅｒｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＳＵｂｊｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｇｉｏｎｓ：Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ（２５．１ ８％）。Ｈｅｂｅｉ（２３．１ ９％），Ｊｉｌｉｎ （１８．９７％），Ｓｈａｎｘｉ（１ ８．０８％），ＨｅｉＩｏｎｇｊｉａｎｇ（１７．７８％）， Ｈｅｎａｎ（１ ５．０９％），Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（１ ３．０２％），Ｇｕａｎｇｘｉ（６．５９％）．
朝
满
瑶
侗
（语前／语后）
苗
有
无
不详
突！竺变。：ｋ６ｅ，ｒ＝１巴４ Ｌ２２３０５０ｄ０ｅ；ｌＣ２纯望合！ｉ突登变矍；；７３，，８４，阴９性，翌１１照，ｊ１２５，。．１３１０
２３５ｄ ｅＩｃ詈盒
２３５ｄｅｌＣ阴性
图１ ＧＪＢ２基因ＰＣＲ产物Ａｐａ Ｉ酶切图
～一～一～一”…一。 ７、。一… 图２不同地区非综合征型耳聋患）Ｌ２３３～２３５ｄｅｆｃ突变检出率
２２４ ＣＨＩＮ ＡＲＣＨ ＯＴＯＬＡＲＹＮＧＯＬ ＨＥＡＤ ＮＥＣＫ ＳＵＲＧ／Ａｐｒｉｌ ２００６，Ｖ０１．１ ３，Ｎｏ．４
万方数据
中雹耳鼻咽鼍头魏外科１２００６年４月，纂１３卷，纂４羽
表１ ９１７例不同地区非综合征型耳聋病例特点
性别
民族
耳聋
耳毒性药物用药史
地区 例数
（男Ｉ女） 汉
蒙
回
；｜士
（图１）。 ２．４全部患者中２３３～２３５ｄｅＩＣ纯合子患者６９例
（７．５２％），杂合子患者８７ｔ７０（９．４９％），余７６１例 为未见２３３～２３５ ｄｅｌＣ突变患者。对照组２０４＇ｆ列正常儿 童中检测只有２例（０．９８％）可见２３３～２３５ ｄｅｌＣ杂合 突变，余均为正常。耳聋患者总突变率为１７．０１％， 与听力正常儿童存在显著的统计学差异（Ｘ２＝３５．４２２， Ｐ＜０．００１）。参检地区患者２３３～２３５ｄｅｌＣ突变率不 同，８个地区间存在显著的统计学差异（Ｘ２＝１７．９９８， Ｐ＜０．０５），南方地区的检出率明显小于华北及东北地 区（图２，表２）。
ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｄｅａｆ ａｎｄ Ｍｕｔｅ Ｓｃｈｏｏｌｓ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｈｅｎａｎ，Ｈｅｂｅｉ，Ｓｈａｎｘｉ，
Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，Ｊｉｌｉｎ ａｎｄ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔｓ．Ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
［摘要】目的分析中国部分地区非综合征型耳聋患者 ＧＪＢ２基因２３３—２３５ｄｅｌＣ的突变频率。方法收集广东、 广西、河南、河北、山西、黑龙江、吉林、内蒙古等地 区聋哑学校９１ ７例非综合征型耳聋患者的血样，正常对 照２０４例，提取ＤＮＡ后经聚合酶链反应扩增ＧＪＢ２基因 编码区，用酶切方法分析已知２３３Ｎ２３５位点的Ｃ缺失突 变，对各地区２３３Ｎ２３５ｄｅＩＣ的突变频率进行统计。结果 ９１７例患者中１ ５６例（１ ７．０１％）发现有２３３～２３５ｄｅＩＣ 突变，其中纯合突变６９例（７．５２％），杂合突变８７ 例（９．４９％）。正常对照２０４例，发现杂合突变２例