L-Asp诱急性髓细胞白血病细胞株HL-60凋亡

发现不同类型疾病以及相同疾病的不同患者对L-Asp敏感性和疗效都不尽相同，而且这些患者血液中的Asn都已被耗竭。

这提示细胞对L-Asp的敏感性存在于细胞内部对这种氨基酸耗竭的反应性不尽相同，从而表明不能将血浆中Asn是否已被完全耗竭作为L-Asp是否发挥作用的标准。

以往临床上主要是将L-Asp用于治疗ALL和NHL，一般不用于治疗髄系白血病。

但是最近国内外研究表明用甲基硫氮二烯五环四唑分析法（MTT法）体外测定L-Asp对急性髄系白血病（AML）FAB分型（French-American-British subtype of acute myeloid leukemia）中M4,M5型细胞的毒性等同于对ALL细胞的毒性[2],并且此现象可用于预测临床上用L-Asp初始化疗的疗效反应。

其中M5型AML对临床常规化疗药物的疗效差，预后不良，死亡率高，以上研究提示L-Asp治疗M5型AML具有独有的优势。

国外还有将L-Asp联合其他化疗药物对AML患者进行化疗，或者联合异基因造血干细胞移植治疗AML患者，并取得良好疗效的报道。

这些研究结果提示L-Asp具有临床治疗AML的潜在应用价值，其作用机制还没有完全阐明。

L-Asp诱导AML细胞株HL-60细胞凋亡的研究国内尚无报到，要进一步了解L-Asp的治疗潜能开展本课题研究是有必要的，以下为本课题研究内容。

目的：为进一步了解L-Asp临床治疗潜能和其作用机制以及开发更有效的药物治疗AML打下实验基础。

方法：众所周知，L-Asp治疗ALL的疗效是肯定的，本研究以ALL细胞株Jurkat作为阳性对照，按照MTT法原理用细胞计数Kit-8试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8试剂盒）测量经L-Asp处理后两种细
胞株的细胞生长抑制情况和半数抑制浓度（IC50），再做对比确定差异的统计学意义；用Annexin-V-FITC/PI试剂盒，罗丹明123（Rh23）检测磷脂酰丝氨酸外翻（phosphatidylserjine,PS）和线粒体跨膜电位（Mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）这些细胞凋亡早期的特有变化，以及用Hoechst33258荧光染料观察细胞凋亡形态，两细胞株间比较确定统计学差异。

结果：L-Asp对HL-60有明显的生长抑制作用；HL-60细胞24h和48h的IC50分别为5U/ml和2.1U/ml；Jurkat细胞24h和48h的IC50分别是4.5U/ml和1.7U/ml,两细胞各时间点的IC50值比较用t检验p值均小于0.05，差异无统计学意义；经本研究凋亡指标检测证实L-Asp能诱导HL-60细胞凋亡。

结论：L-Asp对HL-60细胞有明显的生长抑制和凋亡作用，且此作用与其对Jurkat细胞的凋亡诱导和生长抑制作用相同；L-Asp具有临床治疗AML的潜能。

关键词：L-Asp；HL-60；急性髄系白血病；凋亡
L-Asp induce acute myelocytic leukemia cell line HL-60 to
apoptosis
Graduate Student:Yunjun Liu
Advisor:Prof.:Xiaoming Li
Abstract:Since 1967 when the enzyme-Lasparaginase (L-Asp),was demonstrated to have efficience of antineoplasms,it has been used to treat various kinds of neoplastic disease widely.Especially,L-Asp can improve the patients’ complete remission and DFS obverously.L-Asp is a critical component of the combination chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia (ALL) and non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) and it is very usefull for therapying childhood patients with ALL or NHL disease.Since before investators have a consensus that the mechanism of L-Asp antineoplasms is that the enzyme hydrolyzing asparagines to aspartic acid and ammonia and thus cause the rapid depletion of asparaginase in plasma.because normal cells have surficient Asparaginase synthetase and activity ,which can catalysis aspartic acid synthese asparagine and then ensure the commom cells’ protein synthiesis.However, compared normal cells the intra-cellular of tumor cells,specially ALL cell and NHL cell have little Asparaginase synthetase content and activity,so tumor cells can’t synthese enough asparagine to consume,but must depend on ecto-cellular asparagine provation.When the ecto-cellular asparagine is
exhaust,neoplasmas cell’s protein and DNA synthesis are all inhibited seriously,finally lead neoplasms cells to abnormal and death,which is the commensensus about the mechanism of L-Asp antineoplasms.But in clinic treatment the therapeutic effects of L-Asp were disparity in different kinds of disease and different patients with the same disease,even if the plasma asparagine were all depletion. These suggest the sensitive to L-Asp is decided by intro-cellular different action for ammonia exhaust and demonstrate asparagine’s depletion can’t used as standar to estmate effectivess of L-Asp.In the past,L-Asp is used for therapying ALL and NHL,usually it is not used for acute myelocytic leukemia (AML).Althrough in recently,abroad and in investagations through MTT method demonstrate the cytotoxicity of L-Asp which is used to treat ALL patients and AML patients who belong M4,M5 subtypeis by French-American-British subtype of acute myeloid leukemia(FAB) is equated.Further more this phenomenon can also predict the beginning chemostherapy effcet of L-Asp.The M5 subtype AML is malignant and have poor prognosis and high death rate,which imply L-Asp have a promising curate prospect.Abroafd scholars heal AML patients with L-Asp cabineting another chemotherapy components or bone marrow transplation and got inspiring cure effect.All the investigations demonstrate L-Asp has potential clinic value for AML,but its mechanisnm is not all clarity .There is the first report about L-Asp
inducing AML cell line HL-60 to apoptosis in domestic,so present investigation is essential to further explore L-Asp potential clinic values .Present investigation contains follow content Objective:To do the treatment base for further researching L-Asp potential therapy value and its antineoplasms mechanism and then explore useful drugs to heal AML.Method:As well known ,the curative effect of L-Asp healing ALL is affirmative.So present investigation use ALL cell line-Jurkat as positive control to detect their inhibition concentration 50(IC50)after L-Asp dealing by CCK-8,then compare their IC50 deciding wether have statistic difference.And then use Annexin-V-FITC/PI, Rh23 to detect cell prophase apoptosis and observe apoptosis shap by Hochst33258 Fluorescent Dyes.After that comparing their difference to estmate statistic value.Result:L-Asp can inhibit HL-60 groth obveriously,the IC50 of HL-60 is 5U/ml and 2.1U/ml respectively after 24h and 48h L-Asp treating and the Jrkat’s 4.5U/ml and 1.7U/ml.Thers is no stastic difference between HL-60 cell IC50 and Jurkat’s through Student-t testing method.Present investigation demonstrate L-Asp has the effect of inducing HL-60 cell line apoptosis.Conclusion:L-Asp has apparent effect of growth inhibition and apoptosis to HL-60 cell line,further more the effect equate to the effect of Jurkat which was inhibited and to be induced apoptosis by L-Asp.L-Asp has potential clinical value to AML.
Kye Words:L-Asp ;HL-60;acute myelomic leukemia;apoptosis
前言
左旋门冬酰胺酶自其被发现至今已有40多年历史，它已被广泛应用于临床治疗各种肿瘤疾病，并且使患者完全缓解率和长期无病生产率得到了很大提高。

L-Asp主要用于治疗急性淋巴系细胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）,其疗效对儿童患者更显著。

L-Asp 一般不用于治疗AML，但最近国外有病案及相关临床研究报道L-Asp 能治疗AML和一些特殊肿瘤，并取得了良好治疗效果。

日本东京[3]有医院报道用L-Asp联合长春新碱，泼尼松即“LVP”方案治疗一位确诊为AML伴有NHL的老年妇女，该患者肿瘤细胞中AsnS活性不能测出，经过18个月维持治疗，该患者AML和NHL均达到CR。

日本静冈红十字医院[4]治疗6名患有急性白血病的天主教徒，一名患ALL给予泼尼松治疗，其余5名患AML其中一名FAB分类为M3型给予维甲酸治疗，3名AML患者给予LVP方案治疗，一名AML 患者给予阿糖胞苷，6名患者骨髓均受抑制，由于宗教信仰患者拒绝输血，结果4名患者得到CR,2名患者死于贫血性心血管病，达CR 者未出现致命性出血和长期血小板严重缺乏症等并发症。

表明L-Asp 具有抗AML作用或协同效应。

为了开发L-Asp治疗AML的潜在效能，近来有研究报道用MTT法体外分析AML儿童患者白血病细胞对L-Asp的耐药性[5]，以普通急性淋巴细胞白血病（cALL）患儿肿瘤细胞做阳性对照。

结果发现在相同致死剂量的L-Asp作用下，按
FAB分类M3型最不敏感，其次为M2型。

M1，M4和M5型较敏感，其中M1型在药物浓度为0.016-10.00U/ml范围内细胞致死量与cALL 相同，提示L-asp对M1,M4,M5型AML患者具有潜在临床应用价值。

也有临床病案报道L-Asp治疗前髄系/NK细胞性（myeloid/NK cell precursor acute leukemia）白血病[6], 此类白血病患者用AML和（或）ALL常规化疗方案均不能诱导缓解，但是单用L-Asp治疗即可达CR。

之后给予人白细胞抗原（HLA）部分匹配型外周血造血干细胞移植和移植后的放疗等移植物抗宿主病（GVHD）的抑制治疗。

患者骨髓重建很快恢复，GVHD反应也非常微弱，提示L-Asp联合造血干细胞移植治疗前髄系/NK细胞性白血病是非常有效的治疗方案。

为了研究AML患者体外耐药与临床治疗关联性，用MTT法分析发现AML的FAB M4，M5型对L-Asp较敏感并指出AML患者对L-Asp的耐药性可用于预测初步化疗方案的疗效反应[7]。

自然杀伤细胞瘤（Natural killer-cell tumour,NK细胞瘤）是一种高度侵袭性肿瘤，由于肿瘤细胞广泛耐药，对许多化疗药物如阿糖胞苷，甲氨蝶呤等治疗无效，而对L-Asp治疗有明显疗效反应。

相关研究表明L-Asp对NK细胞瘤样本和细胞株均有凋亡诱导作用，并且其凋亡诱导效应强于阿霉素[8],其凋亡机制很可能是：激活了依赖CD95分子家族性受体介导的细胞萎缩凋亡信号通路。

以上研究均证明L-Asp对AML及多种恶性肿瘤有较高的临床治疗价值，其抗肿瘤机制还未完全阐明。

国内外学者为此而针对L-Asp抗肿瘤机制的实验研究正在进行中，也做出了相关报道。

L-Asp诱导AML细胞株HL-60细胞凋亡的研究国内尚无报到，要进
一步了解L-Asp的治疗潜能开展本课题研究是有必要的。

众所周知，L-Asp治疗ALL的疗效是肯定的，本研究以ALL细胞株Jurkat作为阳性对照，按照MTT法原理用细胞计数Kit-8试剂盒（CCK-8）测定经L-Asp处理后两种细胞株的细胞生长抑制情况和半数抑制浓度（IC50），再做对比确定差异的统计学意义；用Annexin-V-FITC/PI
试剂盒，罗丹明123（Rh23）检测磷脂酰丝氨酸外翻（phosph atidylser- jine,PS）和细胞凋亡线粒体跨膜电位（Mitochondrial transmembrane- potential,ΔΨm）这些细胞凋亡早期的特有变化指标，以及用荧光染料Hoechst33258观察细胞凋亡形态，两细胞株间比较确定统计学差异。

为进一步了解L-Asp临床治疗潜能和其作用机制以及开发更有效的药物治疗AML打下实验基础。

材料与方法
1 实验材料与仪器
1.1 实验细胞株
HL-60细胞株属于急性髓细胞白血病（AML）FAB分型中M3型即急性早幼粒细胞白血病细胞系，Jurkat细胞株中文名称为人外周血白血病T细胞，属于急性T细胞白血病细胞系。

细胞株均购于泸州医学院附属医院临床医学实验中心。

2 主要实验试剂
2.1 实验研究对象
左旋门冬酰胺酶购于中国常州千红生化制药股份有限公司。

2.2测试细胞生长抑制和凋亡以及用于培养细胞的试剂
Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于凯基生物，罗丹明123（Rh123）购于sigma，细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8试剂盒）购于碧云天生物技术研究所，Hoechst33258荧光染料购于sigma，RPMI1640培养基购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司，进口胎牛血清购于赛默飞世尔生物化学制品有限公司，血清采自南美洲，抗生素（青霉素-链霉素）,二甲基亚砜购于Amresco。

3 主要实验仪器
流式细胞仪（PARTEC，德国），标准规格分光光度计（Thermo，美国），37℃电热恒温培养箱（Thermo，美国），玻璃培养瓶，离心机(B320型医用低速离心机，中国)，倒置显微镜（Leica，德国），荧
光显微镜（OLYMPUS BX51，日本）,微量移液器(BioHit)及抢头，高温消毒后离心管，一次性塑料吸管（世泰Citotest），超净工作台，96孔细胞培养板（Cosmo,Biosciences,inc，美国）,6孔细胞培养板（NEST Biotech CO,Ltd，美国）,电冰箱（SΛΜSUNG，韩国），医用载玻片，血细胞计数板（QIUJING），系列医用注射器。

4 实验方法
4.1 悬浮细胞培养
本实验所选用的细胞株HL-60和Jurkat均为悬浮细胞，悬浮细胞复苏与培养和一般贴壁细胞不同，现分述如下：
4.1.1 复苏悬浮细胞
首先选择复苏悬浮细胞的物品有：50平方厘米的标准培养瓶一个，加有10％胎牛血清的RPMI培养基100ml,一次性塑料吸管数只，高温灭菌后离心管数只，无粉无菌手套2至4双，装有75％酒精喷瓶一个，37℃水浴箱、镊子、离心机、记号笔、废液缸各一个。

准备好物品后按以下步骤操作：
A. 擦拭超净工作台，将备用物品合理排放至工作台中，用紫外线消毒至少30分钟，注意不能用紫外线照射培养基，以免引起培养基中蛋白质分解变性，失去其对细胞的营养供应和促生长作用。

B. 从液氮中取出冻存的悬浮细胞快速放入37℃水浴箱中迅速解冻，注意取冻存管时戴手套避免冻伤，水浴箱中解冻时要晃动冻存管让冻存液快速溶解，避免细胞中晶体形成而损伤细胞以及防止细胞被污染。

C. 将细胞悬液移入干净的离心管后加入8至10ml的培养基，用吸管轻轻吹打细胞悬液但不要吹入空气，直至将细胞表面的冻存液尽量洗净。

D. 将装有洗过细胞悬液的离心管旋紧管盖放入离心机，配平后以1000rpm离心5分钟，取出离心管用酒精消毒管盖部分。

E. 将离心管移入工作台旋开盖子倒掉上面的废液至废液缸，留存离心后贴壁于管底的悬浮细胞。

F. 加入新鲜培养基5ml于离心管，用吸管轻轻吹打管底细胞使其脱壁，并将其混匀。

G. 将细胞悬液移入培养瓶，酒精消毒培养瓶特别是瓶口部位后，旋松瓶盖放入供5％二氧化碳，37℃的孵箱中培养。

4.1.2 悬浮细胞培养传代
悬浮细胞不贴壁生长，在培养过程中每次换液不需加胰蛋白酶消化，但每次换液需要离心。

戴手套准备好培养基、无菌离心管、无菌吸管后，用75％酒精消毒瓶口部分再放入无菌工作台，手部用酒精消毒后将细胞悬液移入离心管，盖好培养瓶盖。

离心操作步骤如“悬浮细胞复苏”步骤中的D-G步，2天换一次液，注意不要污染和损伤细胞。

待细胞浓度达到1×106/ml后常规传代培养，接种浓度以5×104/ml为宜。

4.1.3 悬浮细胞生长状况的判断
悬浮细胞生长状况的判断比贴壁细胞要困难得多，贴壁细胞可根据是否贴壁来判断，贴壁的细胞是存活的细胞形态特别，如纤维细
胞呈梭形，表皮细胞呈菱形等，未贴壁细胞代表细胞死亡或存活不良细胞呈圆形。

而悬浮细胞只能靠细胞形态变化来判断细胞的生长状况，生长良好的HL-60细胞、Jurkat细胞呈圆形，细胞膜光滑，胞质在100倍镜下比较光亮，在200-400倍镜下呈透明状，胞核清晰可见，Jurkat细胞生长良好时细胞有时成团生长如葡萄串。

生长不良的细胞胞膜皱缩，细胞形态不规则，胞内含较多颗粒物，胞质不透明，细胞碎片多见。

4.2 用血细胞计数板计数悬浮细胞
4.2.1 计数前的物品准备及计数操作步骤
首先计数需要的物品有：D-PBSA、生长培养基、微量移液器、枪头、血细胞计数板、显微镜。

准备好物品后按下列步骤进行计数悬浮细胞：
A. 充分的混匀细胞悬液使细胞尽量分散不聚集。

B. 转移1ml的细胞悬液至小瓶中，在本方法中所需要的细胞最低浓度大致为1×106个/ml。

因而细胞悬液需要被离心（1000rpm,5min）,然后重悬于一个便于计数的更小的体积之中。

C. 准备血细胞计数板：用70％的乙醇清洗计数板表面，注意不要划伤半银的表面。

然后清洗盖玻片，在边缘稍微沾一些水，然后将盖玻片压到计数板的凹槽和半银的计数区域上。

当出现干扰图像（“牛顿环”，或在计数板与盖玻片之间出现类似水上面的油滴那样的五颜六色的彩虹环）时，说明盖玻片已被正确放置，计数小室的深度也已被确定。

D. 充分混合细胞样品，用力吹打以分散所有的细胞团块，然后有移液器枪头吸取20μl的样品。

E. 立即将细胞悬液移到血细胞计数板小室的边缘从移液器中压出细胞悬液，利用毛吸作用使之充满计数板和盖玻片间的空隙。

小室内的液体既不能多也不能少，以液体刚好流到计数板凹槽的边缘为准，否则由于表面张力的改变，小室是容积将发生改变。

F. 涸干多余的液体（但不要带出盖玻片下的细胞悬液）把计数板平放在显微镜载物台上。

G. 选择一个10×物镜，利用网格线对焦。

如果由于对比弱而使聚焦困难，可以调节可变光阑，减少进入光线，或者通过偏置聚光器而使光线略微倾斜。

H. 移动计数板，使镜下的视野恰好是网格区域中心的一个大方格，而且是你所能看到的以3条平行线为界的最大范围，即1mm²。

在一个标准的10×物镜下，这个范围几乎充满了整个视野。

由于目镜的原因，大方格的4个角有可能略位于视野之外。

I. 利用更细的划分区域（同样以3条平行线分界）和单线网格线来计算这一1mm²范围内的细胞数。

对于常规的传代培养来讲，细胞数在100-300/mm²即可；计数的细胞越多，计算的结果就越准确。

若要进行精确定量的实验，所数的细胞数应在500-1000个。

如果视野内的细胞过少（<100个/mm²），需要额外计算中心大方格周围的一个或多个大方格（每个方格1mm²）;如果视野内的细胞过多（>1000个/mm²）只计算大方格（1mm²）对角线上的5个小方格（每个小方
格以3条平行线为边界分隔）。

J. 如果计数板有2个小室，可以将第2个小室移入视野进行第二次计数。

或者冲洗计数板，重新加上细胞样品进行再次计数。

4.2.2 细胞计数后的数据分析
计算两次计数后的平均值，利用下面公式推算细胞样品的浓度：c=n/v；这里c是细胞浓度（细胞/ml），n是数过的细胞数，v是被计数的细胞的体积（ml）。

改进的Neubauer计数板小室的深度是0.1mm,如果只计算中心1mm²的细胞，则v是0.1mm³,或1×104/ml。

上面的公式就变成了：c=n/10﹣4或c=n×104；如果细胞细胞的浓度高，我们只需计算中心1mm²大方格中对角线上的5个小方格（即一个大方格全部体积的1/5），上面公式变为：c=n×5×104；如果细胞浓度低，则要数10个1mm²的大方格，即每块板每个小室中的5个方格，公式又变为：c=n×104/10或c=n×10³。

这种方法容易出现误差的地方在于取样及转移细胞到小室的过程。

因而在取样前应确保细胞悬液已充分混匀，在转移样品到小室之前要避免细胞悬液在在移液器的枪头内过长时间停留，否则细胞容易沉积或粘附在枪头壁上。

另外应该保证获得的样品为单细胞悬液，因为细胞团块的存在会造成计数不准确。

较大的细胞团块在进入小室时会比较困难，甚至根本进不去。

如果在准备样品过程中难于消除细胞团块，可将细胞溶解在0.1％龙胆紫的0.1mol/L枸橼酸中，在37℃放置1小时，然后计算细胞核。

4.3 凋亡细胞的Annexin V-FITC和PI检测
4.3.1 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测悬浮细胞步骤
A. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g (约1000-2000rpm)离心5 分钟，弃掉上清液，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。

注意：PBS 重悬不能省略，PBS 重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC 的结合。

B. 取5-10 万重悬的细胞，2000g离心5分钟，弃上清，加入195μlAnnexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。

C. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

D. 室温(20-25℃) 避光孵育10分钟。

可以使用铝箔进行避光。

E. 2000g离心5分钟，弃上清，加入190μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。

F. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置。

G. 立即上机检测。

4.4 细胞增殖抑制实验
4.4.1 标准曲线的制作
A. 按照试剂盒的说明，取处于指数增殖期的细胞，按照不同的细胞密度接种于96孔板中，细胞数目分别为1000、2500、5000、10000、25000、50000、和100000，体积为100μl。

B. 细胞在96孔板中培养24h后按照试剂盒的说明，每孔加入10μl的CCK-8，继续在37℃、5％CO2培养箱中培养2h。

C. 然后通过紫外可变波长检测仪进行450nm和650nm的双波长检测，同时设置空白对照。

每个细胞密度设置6复孔，并重复三次，
根据检测结果绘制细胞增殖标准曲线。

D. 为防止培养过程中板周孔培养基的损失造成的误差，96孔板周围孔加入培养基或PBS，但不进行实验。

4.4.2 不同时间点细胞生长抑制曲线制作
A. 取处于指数增殖期的细胞按照5×104／ml浓度接种到96孔板中，每孔100μl，接种4块板，分别为药物处理0h、24h、48h 和72h组。

B. 通过倍比稀释配置10×L-Asp药物浓度，细胞接种到96孔板上后24h后开始加药处理，选择2U／ml为药物处理浓度。

C. 到检测时间点后按照试剂盒的说明，每孔加入10μl的CCK-8，继续在37℃、5％CO2培养箱中培养2h。

D. 然后通过紫外可变波长检测仪进行450nm和650nm的双波长检测，同时设置空白对照。

每个细胞密度设置3复管，并重复三次，绘制细胞增殖标准曲线。

E. 同样为防止培养过程中培养基的损失，96孔板周围36孔加入培养基，但不进行实验。

4.4.3 细胞生长半数抑制浓度（IC50）的测定
A. 取处于指数增殖期的细胞按照5×104／ml接种于96孔培养板，每孔接种100μl。

设置空白对照和阴性对照，每个剂量和对照均设3复孔。

空白对照为只加入培养基，但不含细胞，其它同实验组；阴性对照为含有培养基和细胞，但不进行药物处理，其它同实验组。

B. 细胞在96孔板中培养24h后每孔加入1／10体积的10×
L-Asp处理。

空白对照和阴性对照孔中加入等体积的培养基。

C. 加药处理24h和48h后重复上述方法的检测。

实验组和阴性对照组数据均用空白对照组调零。

D. 细胞增殖抑制率计算公式：细胞增殖抑制率=(1－实验组OD值／阴性对照组OD值)×100％，以横坐标为时间，纵坐标为抑制率，绘制细胞生长抑制曲线，计算IC50值。

IC50值为实验组细胞生长抑制率达到50％时所需要的药物浓度。

4.5 Hoechst33258荧光染料染色凋亡细胞核观察细胞凋亡形态的操作步骤如下：
A. 对处于指数增殖期的细胞进行加药处理24h。

B．用PBS或合适的缓冲液制备10～50µM Hoechst33258染料。

C. 细胞离心，PBS洗一遍，然后用少量PBS重悬，移液枪打匀，用无菌吸管吸取2-3滴细胞悬液滴于载玻片上。

D. 待其微干后迅速滴加40％甲醛固定10min，然后用蒸馏水稍洗后用滤纸沾去多余液体，滴加Hoechst33258染色液染色。

D. 闭光10min，用带有352nm激发波长，461nm发射波长的滤光片的荧光显微镜观察细胞并摄片。

4.6 凋亡细胞的线粒体跨膜电位(Mitoehondrial transmembrane potential，ΔΨm)检测操作步骤如下：
A. 取处于指数增殖期的细胞种植于六孔板中，细胞种植密度为105／ml，每孔2ml。

B. 根据设计好的时间使用2U／ml的L-Asp处理，药物处理
时间为48h。

C. 到处理时间后每孔加入罗丹明123(Rhl23)，使Rhl23的终浓度为1.25μg／ml。

D. Rhl23处理30min后从六孔板中移出部分细胞，使用冰冷的PBS洗细胞两次，然后用PBS重悬细胞，细胞密度为105／ml。

E. 向细胞悬液中加入5μl的PI(Sigma)，使其终浓度为1μg ／ml。

F. 暗室孵育细胞5分钟后FCM检测。

置于250C下测定，激发波长488～505nm，发射波长530nm，连续记录从0 min～30 min内荧光强度的变化。

5 统计学处理
用SPSS13.0软件进行统计学处理，结果以均数±标准差（X±S）表示，细胞增殖抑制率根据各组测得的数据，建立回归方程，由回归方程求得相应的IC50值，对两种细胞生长抑制率的情况进行统计学分析。

两细胞株间IC50值比较采用Student-T检验进行分析。

采用流式细胞仪专用软件CELL Quest对待测细胞进行细胞凋亡率分析，用流式细胞仪对待测细胞凋亡线粒体跨膜电位检测进行分析。

率的比较采用卡方检验进行分析。

结果
1 L-Asp抑制HL-60和Jurkat细胞增殖测定结果
1.1 标准曲线制作
两种细胞株经过CCK-8试剂盒检测在450nm波长吸光度与细胞数目的关系（如图1-1所示），两细胞株数目和测得的OD均成直线相关其中HL-60细胞株的直线相关系数R等于0.871（p=0.011）,Jurkat 细胞株的R值为0.97（P=0.01）。

表明CCK-8试剂盒适合用于检测细胞在药物干预后的生长状况。

图1-1：450nm波长测定OD值与细胞数目关系
Figure1-1:correlation between cell numbers and OD vaule of 450nm weivelength
1.2 不同时间点经L-Asp处理后的细胞生长抑制曲线
经过2U/ml浓度的L-Asp处理后的HL-60和Jurkat细胞与未经药物干预的对照组细胞间增殖比较（如图1-2，1-3所示），L-Asp对两细胞株增殖均有明显抑制作用，而且抑制程度相近。

72小时候由于
培养基中营养耗竭，对照组细胞生长也受到抑制。

图1-2：L-Asp处理后的HL-60细胞在不同时间点的生长情况
Figure1-2:groth of HL-60 cell in different time after L-Asp treating
图1-3：L-Asp处理后的Jurkat细胞在不同时间点的生长情况
Figure1-2:groth of Jurkat cell in different time after L-Asp treating
1.3 IC50值的测定
使用CCK-8试剂盒测定24h,48h时间点经2U/ml浓度的L-Asp处理后的HL-60和Jurkat的半数抑制浓度（IC50）都在1U/ml-5U/ml 之间。

细胞生长抑制率与药物浓度间不相关，药物浓度在1U/ml-5U/ml
区间对细胞增殖抑制较明显，该区间以上浓度对细胞抑制作用增加不明显，以下浓度对细胞增殖抑制作用弱。

细胞生长抑制率与药物浓度关系如图1-4和1-5：
图1-4：经L-Asp处理24小时后细胞生长抑制曲线
Figure1-4:cell groth inhibition curve after 24 hours of L-Asp intervating
图1-4：经L-Asp处理48小时后细胞生长抑制曲线
Figure1-4:cell groth inhibition curve after 48 hours of L-Asp intervating
2 凋亡检测
2.1 Hoechst22358荧光染料染色结果
HL-60和Jurkat细胞经过L-Asp（2U/ml）处理48小时后的细胞形态改变如图2-1和2-2：
图2-1：HL-60细胞经L-Asp处理48小时后的凋亡图
Figure2-1：apoptosis picture of HL-60 treated by L-Asp after 48 hours
图2-2：HL-60细胞经L-Asp处理48小时后的凋亡图
Figure2-2：apoptosis picture of jurkattreated by L-Asp after 48 hours
2.2流式细胞仪检测细胞凋亡
2.2.1 Annexinn V-FITC/PI检测HL-60和Jurkat细胞凋亡
加L-Asp（2U/ml）入培养板24小时后回收细胞用Annexinn V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒加试剂后，上流式细胞仪检测，检测结果如图2-3和图2-4：
图2-3：流式细胞仪检测HL-60细胞图2-4：流式细胞仪检测Jurkat细胞凋亡结果凋亡结果
Figure2-3：The FCM apoptosis result Figure2-4：The FCM apoptosis result of HL-60 of Jurkat
2.2.2 流式细胞仪检测凋亡细胞线粒体跨膜电位(ΔΨm)
HL-60细胞和Jurkat细胞经过L-Asp（2U/ml）处理48hours 罗丹明123（Rh23）检测结果如图2-5和2-6所示：
图2-5：FCM检测HL-60的ΔΨm结果图2-6：FCM检测Jurkat的ΔΨm结果Figure2-5:result of HL-60 ΔΨm Figure2-5:result of Jurkat ΔΨm detected by FCM detected by FCM。