DHPLC系统工作原理及其应用

・综述与专论・

生物技术通报

B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N

2006年增刊

D HP LC 系统工作原理及其应用

李莉　王翀　陈瑶生

(华南农业大学动物科学学院,五山　510642)

摘　要:　变性高效液相色谱(DHP LC )是一种高通量筛选DNA 序列变异的新技术,从该仪器设备的组成、工作原理、基本操作方法、主要技术特点等作一综述,并对其在基因组领域的应用如S NP 分析、双链DNA 片段分析、微卫星分析、mRNA 定量分析、引物纯度检测等方面及在医学、遗传学方面的应用作了较详细的综述。

关键词:　DHP LC 原理　应用

W orki n g Pr i n c i ples and Appli cati on of DHP LC Syste m

L i L i W ang Chong Chen Yaosheng

(College of A ni m al Science,South China A gricultural U niversity,Guangzhou 510642)

Ab s tra c t:　Denaturing H igh Perf or mance L iquid Chr omat ography (DHP LC )is a kind of high thr oughout ne w tech 2

nique t o detect the mutati on of the DNA sequence .The structure of the instru ment,working Princi p les,basic mani pulating method and main technical characteristic were revie wed .The app licati ons in the medicine,genetics and genome domain such as analysis of S NP,the frag ment of double strains,m icr osatellite,the quantitative mRNA,the pure detecti on of the p ri m e,et al were revie wed in detail .

Key wo rd s:　DHP LC Princi p le App licati on

基金项目:国家自然科学基金资助(30300249)

作者简介:李莉(19822),女,硕士研究生,专业方向:动物遗传育种与繁殖,电话:020*********

通讯作者:王翀(19682),女,博士,副教授,主要研究方向:分子遗传学,电话:020*********,E 2mail:betty@scau .edu .cn

变性高效液相色谱(denaturing high perf or mance liquid chr omat ography,DHP LC )是一种新的高通量筛选DNA 序列变异的新技术,这一技术最先由美国Stanf ord 大学Oefner 及Underhill 等于1995年报道,

美国Transgenom ic 公司采用该原理制造专利化仪器,专利产品为WAVE µ

DNA 片段分析系统

(WAVE µDNA frag ment analysis syste m )。1.1　仪器主要组成部分

硬件部分:变性高效液相色谱仪(WAVE

µ

3500HT ):WAVE µ

L 27100型四元梯度溶液注入系

统(含四元梯度泵),WAVE µ

L 27250型Peltier 可冷

却、加热自动进样器,WAVE µ

L 27300p lus 型高精度Peltier 柱箱,WAVE

µ

L 27400型紫外/可见光检测

器,WAVE µ

L 2700在线去气装置:四通道,样品池(可容纳4个96孔PCR 板,以便进行大规模分析筛

查),WAVE µ

Maker 数据工作站系统(硬件)等。

软件部分:M icr os oft W indows µ

NT 操作系统,HS MD 27000数据工作站控制接口软件,WAVE µ

Maker 核苷酸片段分析系统专用软件包。1.2　DHP LC 基本原理及其应用

用离子对反向高效液相色谱法:①在不变性的温度条件下,检测并分离分子量不同的双链DNA 分子或分析具有长度多态性的片段,类似RF LP 分析,也可进行定量RT 2PCR 及微卫星不稳定性测定

(MSI );②在充分变性温度条件下,可以区分单链DNA 或RNA 分子,适用于寡核苷酸探针合成纯度

分析和质量控制;③在部分变性的温度条件下,变异型和野生型的PCR 产物经过变性复性过程,不仅分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链,根据柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离,

2006年增刊李莉等:DHP LC系统工作原理及其应用

从而识别变异型。根据这一原理,可进行基因突变检测、单核苷酸多态性分析(S NPs)等方面的研究。

1.3　DHP LC基本操作方法

在进行DHP LC检测之前应设定仪器的参数:①设定ds DNA分离柱的温度,对于部分变性的温度,导入所要检测的DNA序列,WAVE系统中的WAVEµMaker软件可根据待分析片段的DNA序列很方便地预测出柱温。另外斯坦福大学T

m

计算网站(htt p://inserti on.stanf /melt.ht m l)提供的Melt软件也可辅助温度选择,解链曲线是确定柱温的最佳参考依据,但WAVEµMaker还可提供更有用的其它信息,最为重要的是分析单一片段中存在的多个解链域。因为一般软件预测的是整个序列的平均解链温度,这只是一系列合适温度条件的中点,最适检测温度还取决于期望检出变异所在区域的局部解链温度。对于ds DNA片段大小、微卫星及mR2 NA的定量分析,直接采用50℃的柱温,就是很理想的检测温度。对于RNA和O ligo的检测分析,80℃也是很合适的柱温,不需要另外找软件分析处理。

②设定流动相A液和B液的组成:A液含0.1mol/ L的TE AA、0.1mol/L的E DT A、0.1%的乙腈。B液含25%乙腈、0.1mol/L的TEAA、0.1mol/L的E D2 T A,至于运行时A液与B液的配合比例则视检测的目的不同而有所不同。③设定紫外检测器的波长为260n m。④设定自动加样器的取样样本号、进样量等。⑤根据研究的需要,设定将运行的程序名称并存盘。⑥设定实验结果储存的文件夹、文件名等。

1.4　DHP LC主要技术特点

DHP LC检测技术的主要特点是:①高通量(high thr oughout)检测,适合大规模的S NP筛查及微卫星分型的分析。②自动化程度高:减轻劳动强度,提高检测效率。③灵敏度及特异度均较高:与直接测序相当,检测未知的S NP可达95%以上,已有许多学者进行了DHP LC相关的方法学比较研究,均提示其敏感性和特异性可达96%～100%,明显高于常用的DGGE、CC M、CSGE、SSCP等变异检测技术[5,7,8,26,27,32],目前只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F2SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHP LC相媲美[12]。④所检测的DNA或RNA片段的长度变动范围广,较适合大片段DNA的筛查。⑤快速:每份样本的检测时间不超过10m in,对于高通量的洗脱柱,3m in便可检测一个样品。⑥相对价廉:平均每检测一份样本的费用约为10元人民币。将数份样品混合后组成样品池,成本可进一步降低。⑦检测结果以图表显示,直观易判断。

1.5　DHP LC应用

1.5.1　S NP检测　在部分变性温度情况下(柱温在53～78℃之间),DHP LC可进行基因突变的检测和未知S NPs筛查。基于异源双链的形成,一个杂合子个体的PCR产物一定含有野生型和突变型两种DNA,并且两者的比例为1∶1,将PCR产物进行变性复性过程,杂交会形成同源双链和异源双链。同样,当把野生型和突变型PCR产物混合后,进行变性复性过程,杂交后也会出现4种情况(图1),它们不仅形成同源双链,同时也错配形成异源双链,异源双链由于碱基对不匹配,在部分变性的温度条件下,就会在不匹配的碱基对处部分解链,由于单链DNA 带负电荷减少,结合力弱,因此,异源双链比同源双链先洗脱出来,根据柱子保留时间(retenti on ti m e)的差异将同源双链和异源双链分离(图2)。据此可检测反相柱(reverse2phase columns)中单个碱基置换、插入或缺失杂合二倍体的片段,可检测DNA片段大小在80～1000bp范围的单碱基突变,对于未知的S NP和单个核苷酸突变,系统检测的准确率大于96%,对于已知的S NP和单个核苷酸突变,系统检测的准确率大于99.9%。对于基因突变的检测及S NP的检测也是DHP LC的最主要用途。鉴于此,中外许多研究者利用DHP LC系统进行了基因突变的研究[16,24,25,27,31,34]、未知S NPs筛查[2,6,10,23,24,33]

。

图1　通过杂交形成同源和异源双链

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