食品污染微生物基因组DNA提取的简易方法
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２ 结果与分析
２．１ 食品污染微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取 抽提的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 如图 １ 所示，可以看到明显的
条带，大小再 ２ ３ ｋ ｂ 左右，与常规方法抽提的细菌基因 组的大小一致。从图 １ 中还可以看到，基因组 Ｄ Ｎ Ａ 后 有弥散，这可能是由于我们没有加入蛋白酶 Ｋ 进行消 化，基因组 Ｄ Ｎ Ａ 仅仅作为 Ｐ Ｃ Ｒ 模板时，即使存在一些 蛋白混杂也不影响 Ｐ Ｃ Ｒ 结果。另外，实验中为了减少 抽提的时间，我们没有用 Ｒ Ｎ Ａ ａ ｓ ｅ 酶消化 Ｒ Ｎ Ａ ，所以 样品中还存在少量 Ｒ Ｎ Ａ 。在 Ｄ Ｎ Ａ 抽提时，如果一次抽 提的 Ｄ Ｎ Ａ 量不足，最后定容的蒸馏水可以减少为 １ ０μｌ ， 或者把 ４ ～５ 次抽提的 Ｄ Ｎ Ａ 集中到一起，再用等体积异 丙醇沉淀，干燥后加水重溶。 ２．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增
Ｄ Ｎ Ａ 抽提参考分子克隆进行改进［ ４ ］ ，样品处理完 毕，弃去上清，向沉淀中加入１ｍｌ 抽提液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ （ｐＨ８．０），５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０），３％ ＳＤＳ），振荡 振匀，转移到 １０ｍｌ 玻璃匀浆器中，冰浴条件下充分匀 浆，匀浆液 １２０００ｒ／ｍｉｎ， ４℃离心 ５ｍｉｎ，收集上清到新 的离心管中，用等体积酚、酚 ／ 氯仿、氯仿各抽提一
410 2006, Vol. 27, No. 12
食品科学
※工艺技术
食品污染微生物基因组 ＤＮＡ 提取的简易方法
魏兆军，廖爱美，贾 如，姜绍通 （合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 ２３０００９）
摘 要：本文报道了直接抽提食品污染微生物的基因组 ＤＮＡ 的方法。污染的食品溶于 ＰＢＳ 缓冲液后，直接用含 ＳＤＳ 的裂解液裂解微生物细胞。抽提出的微生物基因组 ＤＮＡ 在 ２３ｋｂ 处有清晰条带，利用 Ｐ１ 和 Ｐ２ 扩增出 １６ＳｒＤＮＡ 基因约 １８０ｂｐ 的目的条带，克隆后随机测定一个阳性克隆的序列，分析表明我们测定的与细菌的 ＫＶＤ－１９２１－１５ 菌 株非常接近。 关键词：基因组 Ｄ Ｎ Ａ ；微生物；抽提；方法
次，加入等体积异丙醇，－ ２０℃沉淀 １ｈ，１２０００ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ４℃离心 ２ ０ ｍ ｉ ｎ，弃去上清，加入 ７ ０ ％ 乙醇洗涤，室温 干燥后，加入 ２ ０μｌ 蒸馏水重溶 Ｄ Ｎ Ａ ，０ ． ８ ％ 琼脂糖凝 胶电泳检测提取结果。 １．３ 基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 分析
将基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作为模板，然后用细菌通用引物 Ｐ １ （ ５ ’－ Ｃ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ － ３ ’） 和 Ｐ ２ （ ５ ’－ ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’）进行 ＰＣＲ 扩增， ＰＣＲ 扩增 条件如下：９ ４ ℃，预变性 ５ ｍ ｉ ｎ ；９ ４ ℃，３ ０ ｓ ，５ ２ ℃， ３０ｓ，７２ ℃，１ｍｉｎ ，共 ３０ 个循环；７２℃，延伸 １０ｍｉｎ。 ＰＣＲ 产物 １ ． ５ ％ 琼脂糖凝胶电泳检测。 １．４ ＰＣＲ 产物序列测定及 Ｂｌａｓｔ 分析
出版社， １９８３． ５６－６１． ［８］ 雷彩霞． 凯氏定氮法测定粗蛋白应注意的几个问题［Ｊ］． 西部粮油科
技， ２００３， （２）： ６２－６４． ［９］ 朱自强． ຫໍສະໝຸດ Baidu临界流体技术的原理和应用［Ｍ］． 北京： 化学工业出版社，
２０００． ５４１－５４５． ［１０］ Ｇｒｅｏｒｇｅ Ａ Ｓ， Ｈａｏ Ｃ， Ｓｔｅｖｅｎ Ｊ Ｓ． Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ＣＯ２ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
微生物引起的食品变质主要取决于食品的营养特点 和所处的环境条件与其污染的微生物的适应性；食品原 料主要来源于动、植物的组织和某些器官，正常情况 下就带有许多微生物，这些微生物即可利用食品的营养成 分，大量生长繁殖，破坏食品的营养结构和感官状态， 同时有的还产生有害物质，引起食品的变质。引起食 品变质的微生物主要是细菌、霉菌和酵母菌类［ １ ］。食品 中污染微生物种类的鉴定的传统方法是把污染微生物通 过选择性培养基分离培养后，再进行纯菌的分类鉴定。 该技术不仅费时、费力，只能检测可培养微生物，而 对大量未知的不可培养微生物无能为力。检测结果非常 容易受操作方法的影响，常常低估了菌群的数量和多样 性。随着分子生物学的发展和研究手段的更新，可以 从 Ｄ Ｎ Ａ 水平上对污染中的微生物进行多方面的研究， 如检测现有方法不可培养的细菌，跟踪食品中微生物污 染程度、食品污染中中微生物的遗传多样性及其变化 等。直接抽提不可培养微生物的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 的方法在 土壤微生物中已有报道［２］，在食品方面目前吴坤等［３］报道 了小麦表面微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取方法。本文采用直接 对食品污染中的微生物细胞进行裂解的方法，对总 ＤＮＡ 进行提取，并且采用 ＰＣＲ 方法，扩增了微生物 １６Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ ，为进一步研究食品污染微生物的代谢活性及功 能奠定了基础。
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ： Ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｆｏｏｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ． Ｆｉｒｓｔｌｙ， ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｆｏｏｄ ｗａｓ ｗａｓｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＢＳ． Ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｗｈｉｃｈ
β－ｃａｒｏｔｅｎｅ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ， １９９３， ５８（４）： ８１７－ ８２０． ［１１］ Ｃｈｅｎ Ｃ Ｃ． Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｇｉｎｇｅｒ ｏｉｌ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ｒｏｓｃｏｅ） ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， １９８８， ３６： ３２２－３２８． ［１２］ 胡鑫， 刘成柏， 林相友， 等． 酶解核桃仁制备低分子肽［Ｊ］． 吉林大学 学报， ２００３， ４１（４）： ５２６－５３０． ［１３］ 应恺， 沈祥坤， 芮汉明． 有限酶解花生蛋白的研究［Ｊ］． 食品工业科技， ２００４， ２５（１１）： ７２－７６． ［１４］ 熊华， 郑焱． 微胶囊西藏酥油粉的中间试验工艺研究［Ｊ］． 中国油脂， ２００３， ２８（３）： ３４－３５．
选定酶解后的核桃粕蛋白与糊精比为 １ ： ３ 作为壁 材，采用微胶囊技术生产核桃风味酥油粉，既可方便 地即冲即饮，又能够保留其独特的风味，大大延长了 保质期，也方便了藏族地区人民的平时饮用。
参考文献：
［１］ 杨虎清． 核桃的营养价值及其加工技术［Ｊ］． 粮油加工与食品机械， ２００２， ２（５）： ４７－４９．
１６（５）： ５６－５９． ［５］ 黄伟坤， 等． 食品检验与分析［Ｍ］． 北京： 中国轻工业出版社， １９９３．
５６－６０． ［６］ 陈宗洪， 戴闽光． 胶体化学［Ｍ］． 北京： 高等教育出版社， ２００２． ９８－
１０２． ［７］ 无锡轻工大学与天津轻工业学院． 食品分析［Ｍ］． 北京： 中国轻工业
［２］ 岳红， 胡小玲， 管萍． 核桃、松籽营养价值的分析及保健饮品的研
制［Ｊ］． 食品科技， １９９９， ８（２）： ３７－３９． ［３］ 孔凡真． 营养保健品核桃［Ｊ］． 营养与保健， ２００６， ２５（６）： ４１－４２． ［４］ 沈忱． 酶水解脱脂花生粉制取持水剂的研究［Ｊ］． 中国粮油学报， ２００１，
用 ＰＣＲ 产物回收试剂盒（Ａｘｙｇｅｎ）回收目的条带，根 据 Ｔ Ａ 克隆的原理，纯化后的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物直接与 ｐ Ｍ Ｄ １ ８ － Ｔ 载体（ＴａＫａＲａ）连接，体系为 ＰＣＲ．２．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ３．５μｌ、ｐＭＤ１８－Ｔ １μｌ，１６ ℃连接 １ｈ 以上。取连接混 合物 ２μｌ加到２０５μｌ 制备的ＸＬ－１感受态细胞中进行转化； Ｌ Ｂ 培养板培养 １ ２ ｈ 以上，挑取单菌落培养。然后进行 质粒 Ｄ Ｎ Ａ 抽提及 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定，筛选出阳性克隆。取阳性 克隆的菌液直接送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生物技术公司测序。获得 序列后用 Ｍｕｌｔａｌｉｎ 和 ＤＮＡＳｔａｒ 软件进行序列分析，去除 载体序列，再利用 ＮＣＢＩ 数据库在线 Ｂｌａｓｔ 检索，分析 该序列。
Ａ Ｅａｓｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ Ｆｏｏｄ
ＷＥＩ Ｚｈａｏ－ｊｕｎ，ＬＩＡＯ Ａｉ－ｍｅｉ，ＪＩＡ Ｒｕ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｔｏｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｅｆｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｆｅｉ ２３０００９， Ｃｈｉｎａ）
※工艺技术
食品科学
2006, Vol. 27, No. 12 411
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＤＳ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２３ｋｂ． Ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ ａｎｄ Ｐ２， ｔｈｅ １８０ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １６ＳｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅｄ． Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ． Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＫＶＤ－１９２１－１５ ｓｔａｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；ｍｉｃｒｏｂｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｏｄ 中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００６）１２－０４１０－０４
收稿日期：２００６－０９－１９ 基金项目：合肥工业大学创新团队基金资助项目 作者简介：魏兆军（ １ ９ ７ ０ － ） ，男，副教授，博士，主要从事食品生物技术研究。
佳反应条件为 Ａ ２ Ｂ ２ Ｃ ３ Ｄ １ ，即组合酶的水解核桃蛋白的最 适条件是：温度 ５５ ℃，ｐＨ５．５ ，时间 ４ｈ ，固液比 １：５， 酶与底物比值为 ０ ． ３ ％ 。最佳水解条件下，蛋白质水解 度为 １ ５ ． ３ ％ 。当水解度 ＤＨ ＜ １ ０ ％ 时，酶解液几乎无苦 味；Ｄ Ｈ ≥ １ ０ ％ 时，酶解液开始呈现轻微苦味；而当 水解度 Ｄ Ｈ ＝ １ ８ 时，已经可以感觉到较为明显的强苦味 了。蛋白质酶法水解过程中，通过控制水解度可在一 定程度上减弱水解物的苦味。水解物其他功能特性与水 解度相关，如要提高溶解性与水解度成为正比，但提 高溶解性过程酶解液会产生苦味，可以采取其他相应的 脱苦处理［ １ ３ ］ 。本实验中采用风味蛋白酶，可有效消除 水解液苦涩味，并保证风味。
１ 材料与方法
１．１ 食品污染样本的采集 污染食品采自垃圾堆的蛋糕和面包，在垃圾堆堆放
约 １ 周时间，样品采集后－ ７ ０ ℃保存备用。抽提 Ｄ Ｎ Ａ 前把样品捣碎，称取 ２ｇ 样本加入 １ ０ ｍ ｌ 塑料离心管中， 加入 ５ｍｌ ＰＢＳ，涡旋振荡器振匀，４０００ｒ／ｍｉｎ 室温离心 ５ ｍｉ ｎ，弃去上清，向沉淀中再加入 ５ｍｌ ＰＢＳ ，重复上 述步骤数次。 １．２ 食品污染微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取
２．１ 食品污染微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取 抽提的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 如图 １ 所示，可以看到明显的
条带，大小再 ２ ３ ｋ ｂ 左右，与常规方法抽提的细菌基因 组的大小一致。从图 １ 中还可以看到，基因组 Ｄ Ｎ Ａ 后 有弥散，这可能是由于我们没有加入蛋白酶 Ｋ 进行消 化，基因组 Ｄ Ｎ Ａ 仅仅作为 Ｐ Ｃ Ｒ 模板时，即使存在一些 蛋白混杂也不影响 Ｐ Ｃ Ｒ 结果。另外，实验中为了减少 抽提的时间，我们没有用 Ｒ Ｎ Ａ ａ ｓ ｅ 酶消化 Ｒ Ｎ Ａ ，所以 样品中还存在少量 Ｒ Ｎ Ａ 。在 Ｄ Ｎ Ａ 抽提时，如果一次抽 提的 Ｄ Ｎ Ａ 量不足，最后定容的蒸馏水可以减少为 １ ０μｌ ， 或者把 ４ ～５ 次抽提的 Ｄ Ｎ Ａ 集中到一起，再用等体积异 丙醇沉淀，干燥后加水重溶。 ２．２ １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增
Ｄ Ｎ Ａ 抽提参考分子克隆进行改进［ ４ ］ ，样品处理完 毕，弃去上清，向沉淀中加入１ｍｌ 抽提液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ （ｐＨ８．０），５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ （ｐＨ８．０），３％ ＳＤＳ），振荡 振匀，转移到 １０ｍｌ 玻璃匀浆器中，冰浴条件下充分匀 浆，匀浆液 １２０００ｒ／ｍｉｎ， ４℃离心 ５ｍｉｎ，收集上清到新 的离心管中，用等体积酚、酚 ／ 氯仿、氯仿各抽提一
410 2006, Vol. 27, No. 12
食品科学
※工艺技术
食品污染微生物基因组 ＤＮＡ 提取的简易方法
魏兆军，廖爱美，贾 如，姜绍通 （合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 ２３０００９）
摘 要：本文报道了直接抽提食品污染微生物的基因组 ＤＮＡ 的方法。污染的食品溶于 ＰＢＳ 缓冲液后，直接用含 ＳＤＳ 的裂解液裂解微生物细胞。抽提出的微生物基因组 ＤＮＡ 在 ２３ｋｂ 处有清晰条带，利用 Ｐ１ 和 Ｐ２ 扩增出 １６ＳｒＤＮＡ 基因约 １８０ｂｐ 的目的条带，克隆后随机测定一个阳性克隆的序列，分析表明我们测定的与细菌的 ＫＶＤ－１９２１－１５ 菌 株非常接近。 关键词：基因组 Ｄ Ｎ Ａ ；微生物；抽提；方法
次，加入等体积异丙醇，－ ２０℃沉淀 １ｈ，１２０００ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ４℃离心 ２ ０ ｍ ｉ ｎ，弃去上清，加入 ７ ０ ％ 乙醇洗涤，室温 干燥后，加入 ２ ０μｌ 蒸馏水重溶 Ｄ Ｎ Ａ ，０ ． ８ ％ 琼脂糖凝 胶电泳检测提取结果。 １．３ 基于 １６Ｓ ｒＤＮＡ 的 ＰＣＲ 分析
将基因组 Ｄ Ｎ Ａ 作为模板，然后用细菌通用引物 Ｐ １ （ ５ ’－ Ｃ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ － ３ ’） 和 Ｐ ２ （ ５ ’－ ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ－３’）进行 ＰＣＲ 扩增， ＰＣＲ 扩增 条件如下：９ ４ ℃，预变性 ５ ｍ ｉ ｎ ；９ ４ ℃，３ ０ ｓ ，５ ２ ℃， ３０ｓ，７２ ℃，１ｍｉｎ ，共 ３０ 个循环；７２℃，延伸 １０ｍｉｎ。 ＰＣＲ 产物 １ ． ５ ％ 琼脂糖凝胶电泳检测。 １．４ ＰＣＲ 产物序列测定及 Ｂｌａｓｔ 分析
出版社， １９８３． ５６－６１． ［８］ 雷彩霞． 凯氏定氮法测定粗蛋白应注意的几个问题［Ｊ］． 西部粮油科
技， ２００３， （２）： ６２－６４． ［９］ 朱自强． ຫໍສະໝຸດ Baidu临界流体技术的原理和应用［Ｍ］． 北京： 化学工业出版社，
２０００． ５４１－５４５． ［１０］ Ｇｒｅｏｒｇｅ Ａ Ｓ， Ｈａｏ Ｃ， Ｓｔｅｖｅｎ Ｊ Ｓ． Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ ＣＯ２ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
微生物引起的食品变质主要取决于食品的营养特点 和所处的环境条件与其污染的微生物的适应性；食品原 料主要来源于动、植物的组织和某些器官，正常情况 下就带有许多微生物，这些微生物即可利用食品的营养成 分，大量生长繁殖，破坏食品的营养结构和感官状态， 同时有的还产生有害物质，引起食品的变质。引起食 品变质的微生物主要是细菌、霉菌和酵母菌类［ １ ］。食品 中污染微生物种类的鉴定的传统方法是把污染微生物通 过选择性培养基分离培养后，再进行纯菌的分类鉴定。 该技术不仅费时、费力，只能检测可培养微生物，而 对大量未知的不可培养微生物无能为力。检测结果非常 容易受操作方法的影响，常常低估了菌群的数量和多样 性。随着分子生物学的发展和研究手段的更新，可以 从 Ｄ Ｎ Ａ 水平上对污染中的微生物进行多方面的研究， 如检测现有方法不可培养的细菌，跟踪食品中微生物污 染程度、食品污染中中微生物的遗传多样性及其变化 等。直接抽提不可培养微生物的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 的方法在 土壤微生物中已有报道［２］，在食品方面目前吴坤等［３］报道 了小麦表面微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取方法。本文采用直接 对食品污染中的微生物细胞进行裂解的方法，对总 ＤＮＡ 进行提取，并且采用 ＰＣＲ 方法，扩增了微生物 １６Ｓ ｒ Ｄ Ｎ Ａ ，为进一步研究食品污染微生物的代谢活性及功 能奠定了基础。
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ： Ｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｆｏｏｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ． Ｆｉｒｓｔｌｙ， ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ ｆｏｏｄ ｗａｓ ｗａｓｈｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＢＳ． Ａｆｔｅｒ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｌｉｑｕｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｗｈｉｃｈ
β－ｃａｒｏｔｅｎｅ ｆｒｏｍ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏｅｓ［Ｊ］． Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ， １９９３， ５８（４）： ８１７－ ８２０． ［１１］ Ｃｈｅｎ Ｃ Ｃ． Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖｏｌａｔｉｌｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｇｉｎｇｅｒ ｏｉｌ（Ｚｉｎｇｉｂｅｒ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ ｒｏｓｃｏｅ） ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｌｉｑｕｉｄ ｃａｒｂｏｎ ｄｉｏｘｉｄｅ ［Ｊ］． Ｊ Ａｇｒｉ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ， １９８８， ３６： ３２２－３２８． ［１２］ 胡鑫， 刘成柏， 林相友， 等． 酶解核桃仁制备低分子肽［Ｊ］． 吉林大学 学报， ２００３， ４１（４）： ５２６－５３０． ［１３］ 应恺， 沈祥坤， 芮汉明． 有限酶解花生蛋白的研究［Ｊ］． 食品工业科技， ２００４， ２５（１１）： ７２－７６． ［１４］ 熊华， 郑焱． 微胶囊西藏酥油粉的中间试验工艺研究［Ｊ］． 中国油脂， ２００３， ２８（３）： ３４－３５．
选定酶解后的核桃粕蛋白与糊精比为 １ ： ３ 作为壁 材，采用微胶囊技术生产核桃风味酥油粉，既可方便 地即冲即饮，又能够保留其独特的风味，大大延长了 保质期，也方便了藏族地区人民的平时饮用。
参考文献：
［１］ 杨虎清． 核桃的营养价值及其加工技术［Ｊ］． 粮油加工与食品机械， ２００２， ２（５）： ４７－４９．
１６（５）： ５６－５９． ［５］ 黄伟坤， 等． 食品检验与分析［Ｍ］． 北京： 中国轻工业出版社， １９９３．
５６－６０． ［６］ 陈宗洪， 戴闽光． 胶体化学［Ｍ］． 北京： 高等教育出版社， ２００２． ９８－
１０２． ［７］ 无锡轻工大学与天津轻工业学院． 食品分析［Ｍ］． 北京： 中国轻工业
［２］ 岳红， 胡小玲， 管萍． 核桃、松籽营养价值的分析及保健饮品的研
制［Ｊ］． 食品科技， １９９９， ８（２）： ３７－３９． ［３］ 孔凡真． 营养保健品核桃［Ｊ］． 营养与保健， ２００６， ２５（６）： ４１－４２． ［４］ 沈忱． 酶水解脱脂花生粉制取持水剂的研究［Ｊ］． 中国粮油学报， ２００１，
用 ＰＣＲ 产物回收试剂盒（Ａｘｙｇｅｎ）回收目的条带，根 据 Ｔ Ａ 克隆的原理，纯化后的 Ｐ Ｃ Ｒ 产物直接与 ｐ Ｍ Ｄ １ ８ － Ｔ 载体（ＴａＫａＲａ）连接，体系为 ＰＣＲ．２．５μｌ、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｘ ３．５μｌ、ｐＭＤ１８－Ｔ １μｌ，１６ ℃连接 １ｈ 以上。取连接混 合物 ２μｌ加到２０５μｌ 制备的ＸＬ－１感受态细胞中进行转化； Ｌ Ｂ 培养板培养 １ ２ ｈ 以上，挑取单菌落培养。然后进行 质粒 Ｄ Ｎ Ａ 抽提及 Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定，筛选出阳性克隆。取阳性 克隆的菌液直接送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 生物技术公司测序。获得 序列后用 Ｍｕｌｔａｌｉｎ 和 ＤＮＡＳｔａｒ 软件进行序列分析，去除 载体序列，再利用 ＮＣＢＩ 数据库在线 Ｂｌａｓｔ 检索，分析 该序列。
Ａ Ｅａｓｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍｉｃｒｏｂｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｖｅ Ｆｏｏｄ
ＷＥＩ Ｚｈａｏ－ｊｕｎ，ＬＩＡＯ Ａｉ－ｍｅｉ，ＪＩＡ Ｒｕ，ＪＩＡＮＧ Ｓｈａｏ－ｔｏｎｇ （Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｈｅｆｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｆｅｉ ２３０００９， Ｃｈｉｎａ）
※工艺技术
食品科学
2006, Vol. 27, No. 12 411
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＳＤＳ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ２３ｋｂ． Ｕｓｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐ１ ａｎｄ Ｐ２， ｔｈｅ １８０ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ １６ＳｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅｄ． Ｔｈｅｎ， ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ． Ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＫＶＤ－１９２１－１５ ｓｔａｉｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ；ｍｉｃｒｏｂｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ｍｅｔｈｏｄ 中图分类号：Ｑ７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００６）１２－０４１０－０４
收稿日期：２００６－０９－１９ 基金项目：合肥工业大学创新团队基金资助项目 作者简介：魏兆军（ １ ９ ７ ０ － ） ，男，副教授，博士，主要从事食品生物技术研究。
佳反应条件为 Ａ ２ Ｂ ２ Ｃ ３ Ｄ １ ，即组合酶的水解核桃蛋白的最 适条件是：温度 ５５ ℃，ｐＨ５．５ ，时间 ４ｈ ，固液比 １：５， 酶与底物比值为 ０ ． ３ ％ 。最佳水解条件下，蛋白质水解 度为 １ ５ ． ３ ％ 。当水解度 ＤＨ ＜ １ ０ ％ 时，酶解液几乎无苦 味；Ｄ Ｈ ≥ １ ０ ％ 时，酶解液开始呈现轻微苦味；而当 水解度 Ｄ Ｈ ＝ １ ８ 时，已经可以感觉到较为明显的强苦味 了。蛋白质酶法水解过程中，通过控制水解度可在一 定程度上减弱水解物的苦味。水解物其他功能特性与水 解度相关，如要提高溶解性与水解度成为正比，但提 高溶解性过程酶解液会产生苦味，可以采取其他相应的 脱苦处理［ １ ３ ］ 。本实验中采用风味蛋白酶，可有效消除 水解液苦涩味，并保证风味。
１ 材料与方法
１．１ 食品污染样本的采集 污染食品采自垃圾堆的蛋糕和面包，在垃圾堆堆放
约 １ 周时间，样品采集后－ ７ ０ ℃保存备用。抽提 Ｄ Ｎ Ａ 前把样品捣碎，称取 ２ｇ 样本加入 １ ０ ｍ ｌ 塑料离心管中， 加入 ５ｍｌ ＰＢＳ，涡旋振荡器振匀，４０００ｒ／ｍｉｎ 室温离心 ５ ｍｉ ｎ，弃去上清，向沉淀中再加入 ５ｍｌ ＰＢＳ ，重复上 述步骤数次。 １．２ 食品污染微生物总 Ｄ Ｎ Ａ 的提取