SephadexG10凝胶色谱柱
凝胶色谱柱
装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。
凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。
最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。
将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。
柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。
最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。
3、柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。
由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。
也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。
4、上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。
凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。
为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。
样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。
当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。
用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。
当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。
重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
g-10葡聚糖凝胶色谱柱使用
G-10葡聚糖凝胶色谱柱是一种常用的分离和纯化生物大分子
的柱子，特别适用于分离寡聚糖和多糖混合物。
该柱子采用葡聚糖作为固定相，具有一定的孔隙大小和分子筛效果。
G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于分离多糖、寡糖和其他大分
子化合物。
在使用之前，需要将柱子进行激活和平衡，具体步骤如下：
1. 将G-10葡聚糖凝胶色谱柱放入柱子支撑架上，并连接到色
谱系统上。
2. 将适当的缓冲液（如适应于样品的缓冲液）通过柱子进行激活，以去除可能存在的杂质和污染物。
3. 进行柱子平衡：将适当的缓冲液通过柱子流经，直到柱子和系统达到平衡状态。
4. 加载样品：将待分离的样品按照柱子载样方法加载到柱子上。
5. 进行色谱分离：根据需要，控制缓冲液的流速和浓度梯度，使待分离的目标化合物在柱子上进行分离。
6. 收集分离物：根据其他方法（如按时间段收集、检测波长等）进行分离物收集和检测。
值得注意的是，G-10葡聚糖凝胶色谱柱通常用于相对较小的
生物大分子分离，如寡聚糖和多糖，对于更大分子的分离可能需要使用其他类型的色谱柱。
此外，在操作过程中需要根据具体样品的特性和需要进行柱子条件的调整。
交联聚苯乙烯凝胶 色谱柱
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱是一种常用于分离和纯化生物大分子的色谱柱。
它通常由交联的聚合物制成，具有高度的孔隙度和表面积，能够提供良好的分离效果。
这种色谱柱在生物化学、生物医药等领域得到广泛应用。
首先，让我们从结构和特点方面来看。
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱具有均匀的孔隙结构，这使得大分子能够在色谱柱中得到良好的分离。
此外，由于其高度的孔隙度和表面积，交联聚苯乙烯凝胶色谱柱具有较高的样品吸附能力和分离效率，能够有效地分离生物大分子。
其次，我们可以从应用领域来看。
交联聚苯乙烯凝胶色谱柱在生物制药领域被广泛应用于蛋白质、多肽、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在生物化学研究中，它也常被用于分离和纯化生物大分子样品，如蛋白质复合物、细胞器等。
此外，我们还可以从操作和维护方面来看。
在使用交联聚苯乙烯凝胶色谱柱时，需要注意选择合适的流动相和操作条件，以确保分离效果和样品纯度。
另外，定期进行色谱柱的清洗和保养也是非
常重要的，可以延长色谱柱的使用寿命并保证分离效果。
总的来说，交联聚苯乙烯凝胶色谱柱是一种在生物大分子分离和纯化中应用广泛的色谱柱，具有良好的分离效果和操作性能，适用于生物化学、生物医药等领域的研究和生产实践中。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用一、凝胶色谱柱的使用原理凝胶色谱柱的分离基于分子在柱中的扩散速率差异。
凝胶柱独特的孔隙结构可以使得较小的分子扩散速度更快，从而在柱中落后于分子较大的组分。
分离效果主要依赖于分子与凝胶孔隙的相互作用力，如尺寸排阻作用、电荷作用或亲疏水作用。
根据分子的大小、形状和性质，可以选择不同类型的凝胶色谱柱。
二、凝胶色谱柱的类型1. 托尔伯特柱（Tskgel）：是一种常见的高效凝胶色谱柱，适用于生物大分子的分离和纯化。
根据分子的大小选择不同的托尔伯特柱，包括S、M和G三个系列，具有不同的孔径和分离范围。
2. 超滤柱（Sephacryl）：适用于分子量小于2×10^7道尔顿的生物大分子的分离和纯化。
超滤柱具有较大的孔径，可以快速分离高分子量的物质。
3. 离子交换柱（DEAE Sepharose、CM Sepharose）：用于根据分子电荷选择或分离带有不同电荷的生物大分子。
正离子交换柱（DEAE Sepharose）适用于弱酸的分子，而负离子交换柱（CM Sepharose）适用于弱碱的分子。
4. 亲和层析柱（Protein A、G、L Sepharose）：利用生物大分子与固定在凝胶上的特定结合剂之间的亲和作用进行分离。
常用的亲和层析柱包括Protein A、G和L Sepharose，用于分离抗体或蛋白质。
三、凝胶色谱柱的优缺点1.分离效果好：凝胶柱的孔隙结构可以有效分离不同大小和性质的分子，保证高分离效率和纯度。
2.操作简便：凝胶柱操作相对简单，无需复杂的设备和耗时的准备工作。
3.适用广泛：凝胶柱适用于各种生物大分子的分离和纯化，如蛋白质、抗体、核酸等。
1.分离速度较慢：由于分子在凝胶柱中的扩散速率较慢，分离过程相对缓慢，需要较长的操作时间。
2.不能分离具有相似大小和性质的分子：如果要分离具有相似大小和性质的分子，凝胶柱的分离效果会较差。
四、凝胶色谱柱的实验操作步骤1.准备工作：如准备所需样品、试剂和凝胶柱。
凝胶色谱柱的使用
凝胶色谱柱的使用凝胶色谱柱（Gel chromatography column），又称为凝胶过滤色谱柱，是一种常用于蛋白质和多肽分离纯化的柱层析技术。
它是根据溶质在凝胶颗粒孔隙和凝胶颗粒表面之间的扩散速率不同来实现分离的。
凝胶色谱柱由内核和包覆层构成。
内核是由纤维素、琼脂糖、琼脂和聚丙烯酰胺等材料制成的颗粒，颗粒大小一般在10-300微米之间。
内核是柱层析的主要分离介质，具有一定的孔隙结构，可以根据溶质的分子量来选择孔径大小。
包覆层是一层较细的凝胶层，在内核表面涂覆各种高分子材料，通过改变包覆层的化学性质，可以调控分离过程中的选择性和分离效果。
1.样品制备：准备待分离的样品溶液，通常需要用缓冲液进行稀释和调整pH值。
如果样品中含有高浓度的盐类或有机溶剂等，需要进行脱盐或柱外固相萃取处理。
2.样品加载：将样品溶液加载到凝胶色谱柱上，可以通过重力流动或使用泵进行加样。
3.柱洗脱：用缓冲液进行柱洗脱，一般要满足样品的最佳分离条件。
可以使用单一缓冲液或梯度洗脱，根据需要选择合适的洗脱方式。
4.收集分离物：根据需要，收集分离物进行后续分析或纯化。
1.蛋白质纯化：凝胶色谱柱可以根据蛋白质的分子量进行分离，常用于蛋白质的粗提和富集。
2.多肽纯化：凝胶色谱柱可以根据多肽的大小和亲水性进行分离，常用于多肽的富集和纯化。
3.药物研发：凝胶色谱柱可以用于药物分子的纯化和分析，有助于药物研发过程中的药物筛选和性质表征。
4.生物分析：凝胶色谱柱可以用于生物样品中复杂成分的富集和纯化，有助于生物样品的分析和研究。
1.分离效果好：凝胶色谱柱可以通过调控柱层析介质的孔隙大小和分离效果，达到较好的分离效果。
2.操作简单：凝胶色谱柱的操作相对简单，不需要复杂的设备和操作流程。
3.适用范围广：凝胶色谱柱适用于不同分子量和化学性质的样品，可以满足不同的纯化需求。
1.分离速度慢：由于样品分子需要通过凝胶层的扩散来实现分离，凝胶色谱柱的分离速度较慢。
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
凝胶色谱柱
凝胶色谱柱1. 引言凝胶色谱是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法之一。
凝胶色谱柱是凝胶色谱的核心部分，被广泛应用于生物分析和制药工业。
2. 凝胶色谱柱的原理凝胶色谱柱是一种由多孔材料制成的柱子，多孔材料通常是由高分子聚合物构成的凝胶（如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶）。
凝胶色谱柱通过孔隙大小的选择性分离溶液中的生物分子。
凝胶色谱柱的分离原理是根据生物分子在凝胶中的分子大小差异进行分离。
当溶液经过凝胶色谱柱时，大分子无法进入较小的孔隙，因此较大的分子会比较快地通过柱子，而较小的分子会被凝胶柱内的孔隙所捕获，使其在柱中停留更长的时间。
3. 凝胶色谱柱的类型凝胶色谱柱可以根据不同的凝胶材料和孔隙大小进行分类。
目前常用的凝胶色谱柱主要包括以下几种类型：•分子筛色谱柱：适用于分离分子量较小的生物大分子，如小型蛋白质和核酸。
•聚丙烯酰胺凝胶柱：适用于分离中等分子量的生物大分子，如中型蛋白质和寡核苷酸。
•琼脂糖凝胶柱：适用于分离大分子量的生物大分子，如大型蛋白质和多聚核苷酸。
•离子交换色谱柱：根据样品的电荷性质进行分离，适用于带电的生物大分子。
4. 凝胶色谱柱的应用凝胶色谱柱广泛应用于生物科学研究和制药工业。
以下是凝胶色谱柱常见的应用领域：•蛋白质纯化：凝胶色谱柱可用于分离和纯化复杂的蛋白质混合物。
•核酸分析：凝胶色谱柱可用于分离和纯化DNA、RNA和寡核苷酸。
•生物药物制造：凝胶色谱柱可用于生物药物的分离、纯化和检测。
•病原体检测：凝胶色谱柱可用于分离和检测病原体，如病毒和细菌。
5. 凝胶色谱柱的操作注意事项使用凝胶色谱柱时需要注意以下几点：•预处理：在使用凝胶色谱柱之前，需要进行柱子的预处理，如洗涤和平衡，以保证柱子的稳定性和分离效果。
•样品加载量：要根据样品的性质和要求确定加载量，过高的加载量可能会影响柱子的分离效果。
•柱温控制：柱子的温度会影响分离的速度和效果，需要根据实验要求进行温度控制。
•溶液选择：柱子的分离效果受溶液 pH 值和离子强度的影响，选择适当的溶液条件可以优化分离效果。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用sephacryls-300。
对于分子量在3~5kda的蛋白质，脱盐时应选用sephadexg50或g25；而对于小分子量多肽物质（1~5kda），脱盐则应选用sephadexg10或sephadexg15。
②凝胶介质的处置和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。
一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。
溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。
为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。
凝胶过滤器层析柱的短与直径的比例应属50~100:1。
装柱时柱体必须横向，先在柱内重新加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）烘烤光滑，缓慢并已连续地一次性转化成柱内。
装柱过程中，必须防止柱内缓冲液流干，特别注意维持柱体凝胶光滑无气泡和裂缝。
出厂后，需用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的光滑性。
例如柱体光滑，可知蓝色区带光滑稳定地通过凝胶，不取任何条纹。
必须维持凝胶和缓冲液温度一致，以增加气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。
样品体积不应超过柱床体积的1~5%，如超过5%，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20mg/ml。
样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。
上样前样品应经0.2μm?孔径滤膜过滤或10，000g离心5min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。
④洗脱洗脱液应当维持一定的离子强度以消解凝胶中所含的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的融合促进作用。
sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应属0.02mol/l；sephacryl凝胶应属0.05mol/l。
常用的凝胶色谱柱
常用的凝胶色谱柱常用的凝胶色谱柱有以下几种：1. Sephadex系列：Sephadex是一种基于芦荟胶的凝胶，常用于分离蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
根据颗粒大小的不同，常见的Sepharose型号包括Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75等。
2. Sepharose系列：Sepharose是一种基于琼脂糖的凝胶，常用于亲和色谱和凝胶过滤等分离纯化方法中。
常见的Sepharose型号包括Sepharose 4 Fast Flow、Sepharose CL-4B、Sepharose FF等。
3. Superdex系列：Superdex是一种基于聚丙烯的凝胶，常用于蛋白质和核酸的分子量测定和分离纯化。
常见的Superdex型号包括Superdex 75、Superdex 200、Superdex 30等。
4. Bio-Gel P系列：Bio-Gel是一种基于聚加醇的凝胶，它具有微细的孔隙结构，可用于蛋白质、核酸和多糖等生物大分子的分离和纯化。
常见的Bio-Gel P型号包括Bio-Gel P-100、Bio-Gel P-30等。
5. Polyacrylamide凝胶：Polyacrylamide是一种常用的凝胶材料，可用于分离许多不同大小和电荷的生物大分子。
常见的凝胶类型包括聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）、非变性聚丙烯酰胺凝胶（Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，Non-denaturing PAGE）和变性聚丙烯酰胺凝胶（Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis，Denaturing PAGE）等。
这些常用的凝胶色谱柱在生物科学研究和生物制药工业中广泛应用，在分离和纯化生物大分子方面具有重要作用。
sephadex g-10葡聚糖凝胶 孔径
1. 概述Sephadex G-10 是一种常用的葡聚糖凝胶，具有广泛的应用范围。
在生物化学、分子生物学等领域中，它被广泛用于分离和纯化生物大分子，例如蛋白质、核酸等。
而Sepahdex G-10的孔径大小则是影响其分离和纯化效果的重要因素之一。
2. Sephadex G-10的基本介绍2.1 Sephadex G-10是一种由交联葡聚糖制成的凝胶，属于凝胶过滤层析介质的一种。
它以其较大的孔径而闻名，这使得它在许多生物大分子的分离过程中具有重要的应用价值。
2.2 Sephadex G-10的结构具有高度规则的孔隙结构，能够可靠地分离分子，并且不易受到外界因素的影响。
2.3 在分子生物学和生物化学的实验中，Sephadex G-10经常被作为一种理想的分离介质，用于分离蛋白质、核酸等大分子物质。
3. Sephadex G-10的孔径大小3.1 Sephadex G-10的孔径大小通常为10微米左右。
这种中等大小的孔径使得它能够有效地分离分子，但也相对于有一定的分辨能力，不会因为孔径过大而导致分离效果不理想。
3.2 对于一些较大的生物大分子，例如大分子蛋白质、核酸等，Sephadex G-10的孔径大小能够保证其能够顺利地通过凝胶中的孔隙，实现有效的分离和纯化。
4. Sephadex G-10的孔径大小对分离效果的影响4.1 由于Sephadex G-10的孔径大小适中，它能够较好地区分不同大小的分子。
对于较小的分子而言，它们能够更容易地穿过Sephadex G-10的孔隙，实现快速的分离。
4.2 对于较大的生物大分子，Sephadex G-10的孔径大小也能够保证其能够通过凝胶的孔隙，实现高效的分离。
这就体现了SephadexG-10的孔径大小对于分离效果的积极影响。
5. 结语Sephadex G-10作为一种常用的葡聚糖凝胶，在分离和纯化生物大分子的过程中具有重要的应用价值。
其孔径大小的适宜性，使得它能够有效地区分不同大小的分子，实现高效的分离和纯化。
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：1 预处理称取Sephadex G-2550－100目约5g;加入蒸馏水100ml;置室温下3h进行溶胀..2 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15..柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧;用洗净的玻璃丝约200目尼龙布垫底或购买类似规格的商品柱..然后将柱垂直安装好;先加入1/3柱体积蒸馏水;接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入;使它们在柱内自然沉降..同时大开下口慢速流出蒸馏水..装柱后的凝胶必须均匀;不能有气泡或明显条纹..否则;必须到出重装;装好后;用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离..3 加样加样前;首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出;直到柱内液面与凝胶表面相齐或留一极薄液层为止..然后;由柱的上端加水解液2ml;注意不要让溶液把凝胶冲松浮起;加完样品后;打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐;再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次;待全部进入层析柱后;即可进行洗脱..4 洗脱与收集洗脱时;用蒸馏水作洗脱剂;并且要连续不断地进行;使凝胶柱上端保持一定的液层;防止凝胶柱表面的液体流干..本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min..洗脱液的收集采用分管连续顺序收集;每管收集3ml;共收集10管..据经验;4或5号管核苷酸浓度最大;可作为层析鉴定的样品液..但因层析柱长度的差异;管号会有变化;必要时可用紫外检测A260nm;找出浓度最大的管号..5 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后;必须反冲疏松一次;平衡后再使用..若使用数次;就需要再生处理..用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡;然后用蒸馏水洗至中性备用..若实验完毕;将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干;再用95%乙醇洗两次;在60℃烘箱中烘干;回收保存..实验五. 葡聚糖凝胶层析实验目的1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理..2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术..实验原理凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤;是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术;这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法..层析的固定相载体是凝胶颗粒;目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose..葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1;2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物..凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制;交联度越大;网孔结构越紧密；交联度越小;网孔结构就越疏松;网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围..可分离的分子量范围从几百到几十万不等..葡聚糖凝胶层析;是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱;各个组分由于分子量不相同;在凝胶柱上受到的阻滞作用不同;而在层析柱中以不同的速度移动..分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻;不能进入凝胶颗粒内部;阻滞作用小;随着溶剂在凝胶颗粒之间流动;因此流程短;而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内;阻滞作用大;流程延长;而最后从层析柱中流出..若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间;则在两者之间从柱中流出;由此就可以达到分离目的..本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体;来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝..蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106; 而溴酚蓝分子量为670;二者分子量相差较大;前者完全排阻;而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内;二者通过层析柱的时间不同而分开..实验材料1.实验器材层析柱1×20cm附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶带下口的三角瓶;250m1；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂1 Tris—醋酸缓冲液pH7.0:取0.0lmol/L Tris溶液含0.1mol/L KCl900ml;用浓醋酸调pH至7.0;加蒸馏水至1000m1..2 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克;溶于5毫升乙醇中;充分搅拌使其溶解;然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液pH7.0至溶液呈深蓝色..3 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—2000 10毫克;溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液pH7.0中即成..4 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升;蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液..5葡聚糖凝胶G-25 Sephadex-G-25实验操作1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒;使用时需经溶胀处理;称取4克葡聚糖凝胶G—25;加50毫升蒸馏水;搅拌均匀;在室温溶胀6小时;或沸水浴溶胀 2小时;一般采用后一种方法..再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒;用蒸馏水反复洗涤几次;再以缓冲溶液pH7.0的Tris—醋酸溶液洗涤2—3次;使pH和离子强度达到平衡;最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡;凝胶可保存在缓冲液内..2.装柱：将层析柱洗净;垂直固定在铁支架上;选择有薄膜端作为层析柱下口;将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧..层析柱中加入洗脱液;打开下口螺旋夹;让溶液流出;排除残留气泡;最后保留约2厘米高度的洗脱液;拧紧螺旋夹..将凝胶轻轻搅动均匀;用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中;待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时;打开下口螺旋夹;继续装柱至柱床高度达到8厘米;关闭出口..装柱过程中严禁产生气泡;尽可能一次装完;避免出现分层..再用洗脱液平衡l至2个柱床体积;凝胶面上始终保持有一定的洗脱液..平衡后;拧紧下端螺旋夹..3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出;直至床面与液面刚好平齐为止;关闭下端出口..取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升;小心地加于凝胶表面上;切勿搅动层析柱床表面..打开下端出口;使样品溶液进入凝胶内;并开始收集流出液..当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时;关闭下端出口..用少量洗脱液清洗层析柱加样区;共洗涤三次;每次清洗液应完全进入凝胶柱内后;再进行下一次洗涤..最后在凝胶表面上加入洗脱液;保持高度为3—4cm..4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统;调节洗脱液流速为每分钟1毫升;进行洗脱..仔细观察样品在层析柱内的分离现象;收集洗脱液;每收集3毫升即换一支收集管试管预先编号;收集约20管左右;样品即可完全被洗脱下来..将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度..5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后;继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后;将柱下口放在小烧杯中;慢慢打开;再将上口慢慢松开;使凝胶全部回收至小烧杯中;备用..2 Sephadex LH20 的原理..Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主;兼具反相分配的作用在反相溶剂中..因为凝胶过滤作用;所以大分子的化合物保留弱;先被洗脱下来;小分子的化合物保留强;最后出柱..如果使用反相溶剂洗脱; Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用;所以极性大的化合物保留弱;先被洗脱下来;极性小的化合物保留强;后出柱..如果使用正相溶剂洗脱;这主要靠凝胶过滤作用来分离..3 Sephadex LH20 洗脱溶剂..看完第2点后;就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种..用得最多的是反相溶剂洗脱;以甲醇－－水系统最为常见;先用水;逐渐增加甲醇比例;最后用100％甲醇冲柱..正相系统以氯仿－－甲醇最为常见;先用50％氯仿－－甲醇;逐渐增加甲醇比例;最后用100％甲醇冲柱..4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择..如果样品极性大;这选用反相溶剂洗脱甲醇－－水;样品用最少体积的甲醇－－水尽可能甲醇少一些溶解;过滤后;湿法上样一定要滤喔要是把Sephadex LH20 堵啦;就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去;很心痛呀..如果样品极性小;这选用正相溶剂洗脱氯仿－－甲醇;样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解;过滤后;湿法上样..5 Sephadex LH-20的步骤..1 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要..首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中..极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统..我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统;用了很多年;效果较好..2 饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀;直立柱身;让其自然沉降;此时要防止气泡留在其中..至少半小时打开开关;流出几个柱体种的洗脱剂;目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中..3 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品;常压过滤..4 湿法上柱..这也是要有技巧的步骤..5 洗脱：控制流速;一般1drop/s以下;可参见厂家的一些参数;必要时更改极性很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕..再生以备下次使用..6 分离的技巧;最后说说我的使用心得1 流速不可太快;切切不可新急;所谓欲速则不达..2柱子尽可能长; Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离;所不要吝惜填料;宁可将填料全装在一根大柱子中;不要将填料装成几根小柱..所谓集中优势兵力;打击敌人..3 馏分一定要接的细;可1／10;或1／20 个保留体积接成一馏分..4 洗脱体积一般为2-3个保留体积;对特殊保留强的化合物;可洗脱5个保留体积..5鞣质成分死吸附严重;如不在乎填料者;可用Sephadex LH20 分鞣质6Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳;方法很成型;有大量文献参考..7填料反复使用;每次用完;一般可用甲醇将柱子洗干净;然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来;待用..Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成;属于分子筛凝胶;尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化..例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等;Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备;既可用于初步纯化步骤;也可用于最终精制步骤;如非对映同分异构体的分离..1.装柱装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床..胶颗粒越均一粒径分布越窄;越容易获得稳定均一的柱床..但是对于Sephadex LH-20而言;25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言;不能说分布均一;也就是说其粒径分布较宽..然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床..这对于长柱最高至250cm而言也是同样的..在装柱前;层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗..Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀..在溶胀的过程中;要尽量避免过分搅拌;否则会破坏球形胶粒;且要避免使用磁力搅拌器..在室温下;将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时;溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统;请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量..使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%;上层溶剂占25%;这时;悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动..将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内;在保证胶粒不变形的前提下;应在尽可能高的压力下装柱;反压不要超过1.5ba..2.平衡上样前;用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止;如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质;并根据性质确定柱高调节器的位置;如使用相同的溶剂;在以后的层析中柱平衡可以省略..3.洗脱液为确保延长层析柱的使用寿命;所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质..4.样品样品体积应该占柱总体积的1-2%;同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤..5.洗脱洗脱流速应根据情况而定;最大线性流速约12cm/min反压1.5ba;建议流速为1-10cm/h..总体来说;较低的流速;具有较高的分辩率..。
凝胶色谱柱知识点总结
凝胶色谱柱知识点总结凝胶色谱柱的分类凝胶色谱柱主要有两种类型，即大小分离色谱和亲和色谱。
1. 大小分离色谱大小分离色谱是根据生物大分子在凝胶中的大小差异进行分离的，通常用来分离蛋白质、核酸和多肽等大分子生物大分子。
根据凝胶的孔径大小，可以将大分子生物大分子从小分子生物大分子中分离出来。
2. 亲和色谱亲和色谱是利用生物大分子与特定配体之间的亲和作用来进行分离和纯化的方法。
通常在凝胶上固定一定的亲和剂，通过生物分子与亲和剂之间的特定相互作用来实现生物分子的选择性吸附和洗脱。
凝胶色谱柱的原理凝胶色谱柱的分离原理是利用凝胶材料固定在色谱柱中，通过色谱柱中的孔隙结构来实现生物大分子的分离。
凝胶色谱柱根据其孔隙大小可分为两种类型，包括凝胶过滤柱和凝胶渗透柱。
1. 凝胶过滤柱凝胶过滤柱利用凝胶中的孔隙大小来分离生物大分子。
当生物大分子通过色谱柱时，较大的生物大分子会被凝胶阻挡，而较小的生物大分子可以通过凝胶的孔隙，从而实现生物大分子的分离。
2. 凝胶渗透柱凝胶渗透柱通过凝胶中的孔隙大小来实现生物分子的分离。
通常，生物大分子会根据其大小在凝胶柱中进行渗透，从而实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶色谱柱的应用凝胶色谱柱在生物分离和纯化中有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 蛋白质分离与纯化凝胶色谱柱可用于蛋白质的分离与纯化，对于分离蛋白质复合物、纯化功能蛋白等方面具有重要作用。
2. 核酸分离与纯化凝胶色谱柱可以用于核酸的分离与纯化，对于分离DNA、RNA等核酸样品具有重要作用。
3. 多肽分离与纯化凝胶色谱柱也可用于多肽的分离与纯化，对于分离多肽混合物、纯化特定多肽等方面具有重要作用。
4. 膜蛋白分离与纯化对于膜蛋白的分离与纯化，凝胶色谱柱也有着重要的应用价值。
凝胶色谱柱的优缺点凝胶色谱柱具有一些优点和缺点，以下分别进行介绍：1. 优点（1）分离效果好：凝胶色谱柱能够实现对生物大分子的高效分离与纯化，分离效果好；（2）操作简便：凝胶色谱柱的操作相对简单，不需要复杂的设备和技术，易于掌握；（3）适用范围广：凝胶色谱柱适用于多种生物大分子的分离与纯化，具有较广的应用范围。
制备色谱柱型号
制备色谱柱的型号多种多样，具体取决于不同的应用和需求。
以下是一些常见的制备色谱柱型号及其特点：
1. 正相色谱柱：通常采用硅胶或氧化铝作为填料，适用于分离极性物质和官能团较为活泼的化合物。
常
用的正相色谱柱有：① Baseline正相色谱柱，适用于一般的有机化合物分离；② C18十八烷基键合球形硅胶色谱柱，适用于一般的有机化合物和生物大分子的分离。
2. 反相色谱柱：通常采用C18、C8、C4等烷基键合硅胶作为填料，适用于分离极性较弱的物质和蛋白
质、多肽等生物大分子。
常用的反相色谱柱有：① C18反相色谱柱，适用于一般的有机化合物和生物大分子的分离；② C8反相色谱柱，适用于分离极性较弱的有机化合物；③ C4反相色谱柱，适用于分离极性更弱的有机化合物。
3. 离子交换色谱柱：通常采用阴离子或阳离子交换剂作为填料，适用于分离带有电荷的离子化合物。
常
用的离子交换色谱柱有：①阴离子交换色谱柱，适用于分离带有负电荷的离子化合物；②阳离子交换色谱柱，适用于分离带有正电荷的离子化合物。
4. 凝胶色谱柱：通常采用多孔性的凝胶作为填料，适用于分离分子量较大的化合物。
常用的凝胶色谱柱
有：① Sephadex G系列凝胶色谱柱，适用于一般的凝胶过滤分离；② Superdex系列凝胶色谱柱，适用于分离生物大分子和多聚物。
Sephadex G-10凝胶色谱法测定头孢羟氨苄的聚合物
Sephadex G-10凝胶色谱法测定头孢羟氨苄的聚合物摘要】目的：建立HPLC法测定头孢羟氨苄聚合物的方法。
方法：色谱柱为葡聚糖凝胶Pharmadex G-10柱（300mm×130mm），流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0），流动相B：0.5%葡萄糖溶液。
流速为0.5ml/min；检测波长为254nm，进样量为200μl。
结果：头孢羟氨苄进样浓度在2mg/ml～8mg/ml的范围内与头孢羟氨苄高分子聚合物的峰面积呈良好线性关系（r=0.9998）。
结论：该方法简便准确，灵敏度高，重现性好。
【关键词】头孢羟氨苄；聚合物；Pharmadex G-10ABSTRACT：OBJECTIVE To establish a HPLC method for determination of the polymers in Cefadroxil. METHODS The Chromatographic column was Sephadex G-10 (300mm×13mm),mobile phase A,0.05 mol.L-1phosphate buffer (pH7.0);mobile phase B,0.5%glucose,the flow rate was 0.5 ml.min-1,the detection wavelength was 254nm and the injection volume was 200uL. RESULTS The calibration curve was linear in the concentration range of 2～8mg.Ml-1(r=0.9998).CONCLUSION The method issimple,accurate,sensitive and reproducible.KEY WORDS：Cefadroxil；Polymers；SephadexG-10β-内酰胺类抗生素临床中最常用的基本药物，同时也是较容易发生不良反应的药物之一，多年来的研究已证明，抗生素所致的过敏反应并非由药物本身所致，而是与制剂中高分子聚合物及内源性聚合物有关。
Sephadex G10 凝胶色谱柱
Sephadex G10 凝胶色谱柱在药物质量控制中的应用（大连依利特公司应用实验室）1.前言目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。
由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。
因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。
在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。
中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。
但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。
针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。
2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。
评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。
以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
3．Sephadex G-10色谱柱的性能评价表2 在药典规定条件下蓝色葡聚糖2000评价色谱柱性能Sephadex G-10凝胶色谱柱能够分离分子量小于700的肽、蛋白及葡聚糖等高分子化合物。
葡聚糖凝胶色谱柱
葡聚糖凝胶色谱柱使用说明：一、凝胶的选择1.型号的选择凝胶型号不同，筛分范围也不同。
SephadexG型一般适用于分离蛋白质。
根据下图选择所需要的SephadexG型凝胶的型号2．凝胶用量的计算根据层析柱的体积和干凝胶的膨胀度，按下面公式可计算出所需干凝胶用量：干凝胶用量=πr2h膨胀度（床体积g)用此法计算出的干胶用量还需增加10%～20%，因为凝胶在处理过程中会有一部分损失。
3.凝胶的处理将所用的干胶慢慢倾入5～10倍的纯水中，参照表格凝胶所需时间来进行充分浸泡使胶溶胀。
用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液在室温下浸泡0.5h，以抽滤法去除碱液，用蒸馏水洗至中性。
也可以采用煮沸的方式，能加快凝胶溶胀的速度，但是必须置于弱酸或弱碱溶液中煮沸。
然后用对胶进行脱气处理。
二、凝胶柱的制备1.凝胶柱的选择对层析柱选择的合理与否，将直接影响分离结果。
当用同样直径的层析柱分离两种以上的物质时，长层析柱比短的分离效率高；当用同样长度的层析柱分离两种以上物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当用同样体积的层析柱分离两种以上物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高。
一般理想的层析柱的直径与长度之比是1:25～1:100。
2.装柱(1)将层析柱垂直固定在支架上，拧紧柱的下端出口。
（2）脱气后的填料表面若有杂质，用胶头滴管吸走。
检查溶胀后的填料应与柱体积相当，若溶胀时候加水多一些，可以吸走一些水。
将凝胶调成较稀薄的浆液用玻璃棒引流，灌入柱子内，注意连续灌入，一定不要有气泡或纹路，否则要重新灌。
将凝胶全部灌入柱子后，拧紧上出水口，让凝胶自然沉降，并打开下面的出水口。
当出现明显的填料与水的分层时，打开泵注入水，等柱床稳定后做个标记，过夜平衡，直到柱床体积不变时，柱子平衡好。
三、加样与洗脱1.加样（1）首先关闭下端出水口，打开上端出水口，吸走柱内凝胶上部分的水，注意贴近凝胶时一定用胶头滴管，不要把凝胶吸起来。
Sephadex G-10凝胶色谱条件分析头孢磺啶钠的高分子杂质
Sephadex G-10凝胶色谱条件分析头孢磺啶钠的高分子杂质代丽萍;谢娜;张丹
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2009(34)12
【摘要】目的建立Sephadex G-10凝胶色谱条件分析头孢磺啶钠高分子杂质的方法.方法色谱柱为葡聚糖凝胶G-10柱(300×10mm),流动相A:0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0),流动相B:超纯水,流速:0.5 ml/min,检测波长:254nm,进样量:20μl.结果头孢磺啶钠进样浓度在0.709～14.18g/L范围与头孢磺啶钠高分子杂质的峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999).结论该方法简便准确;灵敏度高;重现性好.
【总页数】3页(P764-766)
【作者】代丽萍;谢娜;张丹
【作者单位】四川大学华西药学院,成都,610041;成都英创科技发展有限责任公司,成都,610041;四川大学华西药学院,成都,610041
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1~+1
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凝胶色谱柱的基本介绍
目录1凝胶色谱2分类3分子筛效益4凝胶种类及性质5填料合成技术6实验技术凝胶色谱高温凝胶色谱仪凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，凝胶过滤色谱柱如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
分子排阻色谱法
附录Ⅴ H 分子排阻色谱法分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。
分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。
色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶（Sephadex ）和聚丙烯酰胺凝胶（Sepharose ）等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。
1.对仪器的一般要求分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一般分常压、中压和高压。
在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中，通常采用高效分子排阻色谱法（HPSEC ）。
应选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂。
使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的pH 值不宜超出填充剂的耐受力，一般pH 值在2～8范围。
流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过浓，一般不应超过30%，流速不宜过快，一般为0.5～1.0ml/min 。
2.系统适用性试验高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数（n ）、分离度、重复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时，其分离度的计算公式为：高单体与二聚体之间的谷二聚体的峰高 R 除另有规定外，分离度应大于2.0。
3.测定法（1）分子量测定法 一般适用于蛋白质和多肽的分子量测定。
按各品种项下规定的方法，选用与供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外，对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇（DTT ）和十二烷基硫酸钠（SDS ）处理，以打开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量（M W ）的对数值对相应的保留时间（t R ）制得标准曲线的线性回归方程lgM W =a ＋bt R ，供试品以保留时间由标准曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。
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Sephadex G10 凝胶色谱柱
在药物质量控制中的应用
（大连依利特公司应用实验室）
1.前言
目前国内外分离分析β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的主要方法是色谱法，应用的色谱分离模式包括反相、离子交换和凝集色谱等。
由于结构不同的高分子杂质通常具有相似的生物学特性（如均为过敏性杂质），因此在药品质量控制中一般只需控制药品中高分子杂质的总量而不必控制不同结构的杂质。
因此根据样品分子量差异进行分离的凝胶色谱法具有明显的优势。
在深入研究药物与葡聚糖凝胶相互作用及流动相对该作用影响的基础上，人们开发了葡聚糖凝胶Sephadex G-10为固定相的凝胶色谱模式，可以方便地用于各类β-内酰胺类抗生素中高分子杂质的分离分析。
中华人民共和国药典2000版规定了采用Sephadex G-10色谱柱测定头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢曲松四种药物中高分子杂质的含量。
但是采用传统的玻璃低压凝胶色谱柱柱效非常低，很难达到药典规定的色谱柱的指标，同时该类色谱柱还由操作不方便、分离时间长、分离度差等不足。
针对上述问题，大连依利特公司在药典规定的基础上于2000年开发成功高效Sephadex G-10凝胶色谱柱，能够满足药典规定的四种药物中高分子杂质质量控制的需要。
2年来用户使用得到很好的效果。
2．药典规定用Sephades G-10色谱柱的分析方法描述
中国药典2000版采用Sephadex G-10色谱柱分离表1所示的四种头孢化合物中的聚合物，定量方法均为自身对照外标法，药物对照品的分析采用相同的流动相条件（0.01％十二烷基硫酸钠溶液），但是样品的分析用流动相组成和盐的浓度不完全相同。
评价色谱柱柱效和拖尾因子均采用蓝色葡聚糖2000。
以下分别在上述条件下评价了依利特Sephadex G-10色谱柱的性能指标及其在药物分析中的应用谱图。
3．Sephadex G-10色谱柱的性能评价
表2 在药典规定条件下蓝色葡聚糖2000评价色谱柱性能
Sephadex G-10凝胶色谱柱能够分离分子量小于700的肽、蛋白及葡聚糖等高分子化合物。
药典规定评价色谱柱用分子量为2000的蓝色葡聚糖，此时，蓝色葡聚糖的洗脱体积即为色谱柱的排阻体积。
以下分别为在药典规定条件下蓝色葡聚糖的色谱图及相应的色谱柱参数。
表2的数据表明，在药典规定条件下，用蓝色葡聚糖2000测定的色谱柱的理论塔板数在1092到1342之间，拖尾因子在0.92到1.18之间，洗脱时间的重复性非常好。
完全满足药典对色谱柱性能指标的要求。
4．β-内酰胺类抗生素对照品分析
药典规定β-内酰胺类抗生素对照品分析的流动相条件为0.01％的十二烷基硫酸钠溶液，流动相流速为1ml/min，在上述条件下分别分析了头孢他啶、头孢噻肟和头孢哌酮，相应的谱图和色谱峰指标列于表3中。
表3 药品对照品的分析
5．头孢噻肟中高分子杂质的分析
6．头孢哌酮钠的分析
7．头孢他啶的分析。