海洋细菌QY202产κ-卡拉胶酶的分离纯化和性质研究
海洋细菌Vibrio natriegens琼胶酶的分离纯化及降解产物分析
海洋细菌Vibrio natriegens琼胶酶的分离纯化及降解产物分析林福娣;韩军萍;肖美添;黄雅燕【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2018(046)005【摘要】The study aimed to investigate the enzymatic properties of agarase which extracted and separated from a marine bacterium Vibrio natriegens HJPHYXJ-1. The SDS-PAGE grade agarase was derived from fermentation broth, which characterized by refrigerated centrifugations, (NH4)2SO4salting out, DEAE-Sepharose fast flow anion exchange chromatography and Sephacryl S-100 purification. The results showed a yield of 4.4% and the molecular weight of 33.8 kDa while the purification factor was 14.36. More characterizations of agarase indicated that the optimal conditions for agarase were 45 ℃, pH 8.5 and agar concentration of 0.5%. Kmand Vmaxof agarase were 12.24 mg/mL and 0.051mm ol/(L·min), respectively. Agarase was highly specific for agar and its hydrolysates were neoagaro-oligosaccharides with degree of polymerization 2~12 after 5 h degradation.%从海洋细菌Vibrio natriegens HJPHYXJ-1发酵液中提取、分离纯化琼胶酶,研究其酶学性质并对降解产物进行分析.发酵液经离心、(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶过滤等纯化步骤得到SDS-PAGE电泳级纯酶.酶纯化倍数为14.36,回收率为4.4%,分子量约为33.8 kDa.琼胶酶的最适反应条件:温度为45 ℃,反应pH为8.5,底物浓度为0.5%;琼胶酶的动力学参数Km和Vmax分别为12.24 mg/mL和0.051 mmol/(L·min),对琼胶底物具有高效专一性,经高效液相色谱法(HPLC)分析,当降解反应5 h时,酶解产物主要为分子聚合度2~12之间的新琼寡糖.【总页数】4页(P77-80)【作者】林福娣;韩军萍;肖美添;黄雅燕【作者单位】华侨大学化工学院,福建厦门 361021;华侨大学化工学院,福建厦门361021;华侨大学化工学院,福建厦门 361021;华侨大学化工学院,福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.海洋细菌Vibrio agarivorans-1产琼胶酶培养基优化及其酶学性质 [J], 修爽;贾馨媛;祖国仁2.海洋细菌Agarivorans albus NBRC102603琼胶酶的分离纯化 [J], 朱启忠;朱慧文;孙艳娜;周晓龙;郝梅;郭振博3.海洋细菌Agarivorans sp.HZ105的琼胶降解酶系 [J], 林伯坤;陆国永;宋燕;谢锐权;陈鸿霖;胡忠4.海洋细菌Vibrio fluvialis的分离鉴定、产琼胶酶条件优化及酶的分离纯化 [J], 李驰; 李春生; 杨贤庆; 戚勃; 赵永强; 王悦齐5.Vibrio sp.FG1琼胶酶的分离纯化及酶学性质研究 [J], 张力雄;刘明明;方再光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
卡拉胶降解酶的分离纯化
卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。
卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。
与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。
对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1]卡拉胶可分为八种类型。
κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。
另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。
卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。
我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。
有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。
而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降卡拉胶降解酶的分离纯化解的底物命名的。
许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有[5]。
根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。
1995年，Philippe Potin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。
κ-卡拉胶寡糖酶法制备及其免疫防御调节机制的研究
κ-卡拉胶寡糖酶法制备及其免疫防御调节机制的研究卡拉胶(Carrageenans或Carrageenins)是从可食用红藻(角叉菜、杉藻等)中提取的一类线性硫酸海藻多糖,具有较好的凝胶性、增稠稳定性等,被广泛应用于食品工业中,同时卡拉胶多糖具有较好的抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等功能活性。
然而,高分子卡拉胶多糖粘度大,在生物机体内难以被吸收,限制了其功能活性的应用,而降解后得到的半乳寡糖硫酸酯容易吸收、毒性低,活性基团大量暴露。
因此,高效制备卡拉胶寡糖是推进红藻寡糖精深加工及应用的重要途径。
本论文以κ-卡拉胶为目的碳源,从角叉菜海藻中筛选可有效酶解κ-卡拉胶的新型细菌,对其进行分子水平鉴定,并建立该菌株的发酵动力学模型;采用固定化微生物技术,以磁性Fe304-Chitosan为载体,制备菌体高浓度富集的固定菌微球,用于高效连续制备K-卡拉胶酶及κ-卡拉胶寡糖,并分析固定化结合机理;采用切向超滤膜技术对K-卡拉胶寡糖进行初步分级,进一步使用中低压制备色谱联合蒸发光散射检测器快速分离纯化得到K-卡拉胶寡糖单体,采用ESI-MS、CID-MS/MS及NMR等检测技术分析各寡糖结构序列;以LPS构造巨噬细胞(RAW264.7)炎症模型为研究对象,评价对比K-卡拉胶寡糖各单体的免疫防御功效。
基于系统生物学分析方法,建立K-卡拉胶寡糖干预巨噬细胞免疫调节的蛋白互作网络图,从蛋白质组学水平阐明其作用机理。
首先,从角叉菜海藻中分离获得一株可有效降解κ-卡拉胶的菌株,经16S rDNA鉴定为海旋菌属,并命名为Thalassospira sp.Fjfst-332(TF-332)。
通过 Box-Behnken 响应面优化,菌株 TF-332发酵产κ-卡拉胶酶的最佳发酵参数为:温度25℃、pH 7.0、接种量3 mL、装液量30mL、转速125r/min;发酵培养基配方:2g/Lκ-卡拉胶、1g/L 酵母膏、20g/LNaCl、1g/LFOS、2g/LNaNO3、0.5g/L MgSO4·7H2O、1g/LK2HPO4和 0.1 g/LCaC12,在此最优工艺参数下,检测得到最高酶活为267 U/mL。
产卡拉胶酶海洋菌株的筛选和 酶学性质的初步研究
基初始pH为8.5，当pH小于8或pH大于9时，菌株
YK-5产酶能力明显下降，说明该菌产酶对pH的要
求较高。
䚢≧߇ 6N-
Q)
图2 培养基初始pH对菌株YK-5产酶的影响
2.3.3 培养温度对于菌株产酶的影响 在pH 8.0培
过氧化氢酶
阳性 石蕊牛奶实验 还原
荚膜染色
阴性
鞭毛染色
阳性
2.3 菌株YK-5的产酶特征 2.3.1 培养时间对菌株生长及产酶的影响 将菌株 YK-5接种于发酵培养基中，按照1.4所述方法培 养60 h，定时取样测菌体浓度(测定培养液OD600)及
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生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
experiments of subculture and the results showed that the strain YK-5 had genetic stability. Key words: Carrageenase; Flavobacterium sp.; screening; enzymatic properties
海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定
海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定随着人们对海洋资源的深入开发和研究，发现海洋中存在着许多珍贵的生物资源，其中包括很多重要酶类。
酶是一种生物催化剂，对于化学反应速度的加速、生物物质的合成和降解、代谢调控等方面都起着至关重要的作用。
因此，海洋中的酶类资源具有广阔的研究和应用前景，是现代生物技术和药物研究领域中不可缺少的重要资源。
然而，海洋中的生物资源非常复杂，要从中提取和纯化出目标酶类，需要经过一系列复杂的操作和检测步骤。
下面将介绍海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定。
一、酶类的来源与分类酶类来源于自然界中的各种生物，包括动物、植物和微生物等。
根据其作用特性和结构特征，可以将酶类分为多种类型，如水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、异构酶等。
在海洋生物中，也存在着各种类型的酶类，如蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等。
二、酶类的纯化方法酶类的纯化是指将海洋生物中的目标酶类从其他杂质分离出来，得到较为纯净的酶制剂的过程。
酶类的纯化方法一般分为物理方法和化学方法两种。
1.物理方法物理纯化方法主要包括离心、摇床、超滤等。
其中，离心法是通过不同的离心速度将混合物中的细胞碎片、代谢产物等不同大小和密度的物质分离开来，从而得到目标酶类。
摇床法是利用水平振荡将混合物分成不同重量的层次，从而将目标酶类分离出来。
超滤法则是利用不同的孔径大小过滤膜将不同分子量的物质分离出来。
2.化学方法化学纯化方法主要包括沉淀分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。
其中，沉淀分离法是利用加入一些沉淀剂，将想要分离的酶类沉淀下来。
离子交换法则是利用具有活性的离子交换树脂将混合物中的酶分离。
凝胶过滤法是利用具有孔隙的聚合物凝胶将不同分子大小的物质分离开来。
亲和层析则是利用与目标酶类有特异性结合的亲和剂纯化出目标酶制剂。
三、酶类的鉴定方法酶类的鉴定是指对酶制剂的纯度、活性、稳定性等指标进行测试分析，以确定是否满足制药或其他生物技术应用的要求。
常用的酶类鉴定方法主要包括以下几种：1.测定酶的活性：通过测定酶对某种底物的反应速度来确定酶的活性水平。
海洋细菌Sphingomonas_sp._Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究
钱洗谦，乔乐克，张洪锋，等. 海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究[J]. 食品工业科技，2023，44（18）：139−146. doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058QIAN Xiqian, QIAO Leke, ZHANG Hongfeng, et al. Optimization of Fermentation Conditions, Enzymatic Properties and Degradation Products of Agarase Produced by Marine Bacterium Sphingomonas sp. Q2[J]. Science and Technology of Food Industry, 2023, 44(18):139−146. (in Chinese with English abstract). doi: 10.13386/j.issn1002-0306.2022090058· 生物工程 ·海洋细菌Sphingomonas sp. Q2产琼胶酶发酵条件优化、酶学性质及降解产物研究钱洗谦1，乔乐克2，张洪锋3，江晓路4，王 鹏1，张京良2,4, *（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003；2.青岛海洋生物医药研究院，山东青岛 266100；3.青岛海莱美生物科技有限公司，山东青岛 266400；4.中国海洋大学医药学院，山东青岛 266003）摘 要：本研究旨在对从江蓠中筛选获得的Sphingomonas sp. Q2菌株产琼胶酶能力条件进行优化并对其酶学性质及降解产物进行研究。
通过响应面法对发酵条件进行优化，采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶层析等方法对发酵所得酶液进行纯化并对纯化后的酶液进行酶学性质研究。
一种Kappa-卡拉胶酶的克隆、表达及其酶学性质研究
一种Kappa-卡拉胶酶的克隆、表达及其酶学性质研究李佳佳1，倪辉1,2，蔡慧农1,2，朱艳冰1,2，肖安风1,2（1.集美大学食品与生物工程学院，福建厦门 361021）（2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建省海洋功能食品工程技术研究中心，厦门市海洋功能食品重点实验室，福建厦门 361021)摘要：将来源于Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5菌株的κ-卡拉胶酶基因克隆到载体pET-28a 上，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
克隆得到的κ-卡拉胶酶基因序列全长1194 bp ，编码一个由398个氨基酸残基组成的蛋白酶，该蛋白酶的分子量为48 ku ，结构域分析表明该κ-卡拉酶符合GH16家族的特点。
对重组κ-卡拉胶酶的酶学性质进行考察：重组κ-卡拉胶酶只能够专一性的降解κ-卡拉胶；该酶的最适温度和pH 分别是55 ℃和pH 9.0，重组酶在40 ℃保温1 h 可保持95.0%的活性，在45 ℃保温1 h 残余酶活与对照比较仍保留60.0%，在pH 8.0~10.0的缓冲液中处理30 min ，仍能保持80%以上的酶活力，低浓度的Na +和K +以及1 mmol/L 的Sn 2+、Fe 3+、EDTA 、DTT 、Tween-20、Tween-80和Triton X-100、β-mercaptoethanol 、SDS 、Urea 对重组酶活具有显著的促进作用；而高浓度的Na +和K +以及1 mmol/L 的Cd 2+、Ba 2+、Mg 2+、Fe 2+、Ca 2+对重组酶活性有不同程度的抑制作用。
关键词：食鹿角菜假交替单胞菌；κ-卡拉胶酶；克隆表达；酶学性质文章篇号：1673-9078(2016)10-72-77 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.10.012Cloning, Expression, and Enzymatic Properties of κ-Carrageenase fromPseudoalteromonas carrageenovoraLI Jia-jia 1, NI Hui 1,2, CAI Hui-nong 1,2, ZHU Y an-bing 1,2, XIAO An-feng 1,2(1.College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China) (2.Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering, Fujian Provincial Engineering Technology Research Centerof Marine Functional Food, Xiamen Key Laboratory of Marine Functioanl Food,Xiamen 361021, China)Abstract: A κ-carrageenase gene from the bacterium Pseudoalteromonas carrageenovora ASY5 was cloned into a pET-28a expression vector and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The length of the obtained κ-carrageenase gene sequence after cloning was 1194 base pairs (bp), and this gene encoded a protease (molecular weight: 48 ku) composed of 398 amino acid (AA) residues. Based on domain analysis, this κ-carrageenase belonged to the GH16 glycohydrolase family. The enzymatic properties of the recombinant κ-carrageenase were studied, and this enzyme specifically degraded κ-carrageenan. The results also indicated that the optimal temperature and pH for the enzyme were 55 ℃ and pH 9.0, respectively. The recombinant κ-carrageenase retained more than 95.0% and 60.0% of the maximum enzymatic activity after 1 h of incubation at 40 ℃ and below 45 ℃, respectively, and retained more than 80.0% of the maximum enzymatic activity after 30 min of incubation at a pH range of 8.0~10.0. The activity of the recombinant enzyme was significantly promoted at low concentrations of Na + and K +, and 1 mmol/L Sn 2+, Fe 3+, ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), dithiothreitol (DTT), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, β-mercaptoethanol, sodium dodecyl sulfate (SDS), and urea. The enzymatic activity was inhibited to various degrees by high concentrations of Na + and K + and 1 mmol/L Cd 2+, Ba 2+, Mg 2+, Fe 2+, and Ca 2+.Key words: Pseudoalteromonas carrageenovora ; κ-carrageenase; cloning and expression; enzymatic properties卡拉胶(Carrageenan)是从海洋红藻细胞壁中提取出来的亲水性的线性硫酸多糖，由α-1,3-D-半乳糖和72收稿日期：2015-11-20基金项目：国家自然科学基金项目（31401632）；福建省重大专项专题项目（2015NZ0001-1）；厦门市科技计划项目（3502Z20120005）；厦门南方海洋研究中心项目（13GZP004NF10）作者简介：李佳佳(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术 通讯作者：肖安风（1973-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术β-1,4-D-半乳糖交替连接而成。
以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法[发明专利]
![以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/5ed995eab52acfc788ebc90c.png)
专利名称：以海洋细菌为来源获取的κ-卡拉胶酶基因及重组酶制备方法
专利类型：发明专利
发明人：姚子昂,吴海歌,赵博闻,崔红利
申请号：CN201610503827.3
申请日：20160630
公开号：CN105950640A
公开日：
20160921
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及分子生物学和基因工程领域，具体来讲涉及一种以海洋细菌为来源编码获取Κ‑卡拉胶酶基因的及重组酶制备方法。
本发明包括如下步骤：一、PCR法获得海洋细菌中κ‑卡拉胶酶基因的全长序列；二、以海洋细菌为来源基因κ‑卡拉胶酶基因的重组表达质粒和重组菌株的构建；
三、利用重组表达菌株表达重组κ‑卡拉胶酶；四、重组酶的活性检测。
本发明通过一种新的、高效、准确的途径，以海洋细菌为来源获得的κ‑卡拉胶酶基因应用于大肠杆菌工程菌株的构建，并实现具有活性重组酶的异源表达，为实现工业化生产卡拉胶酶提供基础；通过本发明中的以海洋细菌为来源获得的κ‑卡拉胶酶基因，与已知κ‑卡拉胶酶序列相似性最高为44％。
申请人：大连大学
地址：116622 辽宁省大连市金州新区学府大街10号
国籍：CN
代理机构：大连八方知识产权代理有限公司
代理人：朱秀芬
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产κ-卡拉胶裂解酶菌株的筛选与鉴定
产！-卡拉胶裂解酶菌株的筛选与鉴定吴家#,静，迟乃玉，王晓辉"(大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连116622)摘要：利用单一碳源的方法，从13种来自辽宁省大连市不同坐标的海泥样品中，筛选得到4株具有k-卡拉胶酶活性的菌株。
利用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法)检测4株菌具有k-卡拉胶酶活性&根据酶活性比较进行复筛，得到一株高产k-卡拉胶酶的菌株命名为LG-2,其最高酶活为34U/mL,根据形态学观察、生理生化鉴定和16S rDNA系统发育树分析，初步确定菌株为红球菌属，为性菌。
并对LG-2号菌株生长曲线及产酶活性曲线进行检测，为工业化生产奠定基础#关键词：卡拉胶酶；筛选；鉴定；红球菌中图分类号:Q93-331文章编号:1673-1689(2020)12-0035-07DOI：10.3969/j.issn.1673-1689.2020.12.006Screening,Isolation and Identification of K-CarrageenanLyase-Producing BacteriaWU Jiawei,ZHANG Wenjing,CHI Naiyu,WANG Xiaohui(School of Life Science and Technology,Dalian University,Dalian116622,China)Abstract:Using K-carrageenase as the sole carbon source,4strains with K-carrageenase activity were screened from13samples of sea mud with different coordinates in Dalian,Liaoning Province. The DNS method(3,5-dinitrosalicylic acid method)was then used to detect the K-carrageenase activity produced by4strains.According to the K-carrageenase activity comparison,a high-yielding strain was named LG-2,with a maximum enzyme activity of34U/mL.Based on morphological observation,physiological and biochemical identification,and16S rDNA phylogenetic tree analysis, the strain was initially identified as Rhodococcus and Gram-positive bacteria.The growth curve and enzyme activity curve of LG-2strain were determined,laying the foundation for industrial production.Keywords:carrageenase,screening,identification,rhodococcus卡拉胶(Carrageenan),又被称为石花菜胶、鹿角菜胶、角叉菜胶等,是一种亲水性较高的大分子多糖，它由半乳糖硫酸酯钾、钠、镁和3,6-脱水-D-半乳糖物组成叫目前卡拉胶被大，如葡萄酒囚、饮料叭果冻⑷、酸奶⑸等,主要、和的°卡拉胶被收稿日期：2020-02-22基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31500039)；辽宁省博士启动基金指导计划项目(20170520167)；大连市青年科技之星项目(2017RQ155)；大连大学博士专项基金项目(2017QL020)；辽宁省自然科学基金项目(20180550728)o"通信作者：王晓辉(1981—),女，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事微生物与酶工程研究。
一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用[发明专利]
![一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/f2d9d7626529647d262852bf.png)
专利名称：一种酶解制备低分子量κ-卡拉胶钾的方法及应用专利类型：发明专利
发明人：牟海津,陈梦,韩振莲
申请号：CN201910017153.X
申请日：20190108
公开号：CN109706201A
公开日：
20190503
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种酶解制备低分子量κ‑卡拉胶钾的方法，包括如下步骤：(1)在40‑50℃水浴锅中，将κ‑卡拉胶粉末配成质量浓度为0.5‑1.5％的κ‑卡拉胶水溶液，搅拌均匀，加入κ‑卡拉胶酶，搅拌酶解6‑8h；(2)酶解液进行醇沉，得到低分子量κ‑卡拉胶寡糖；(3)将得到的κ‑卡拉胶寡糖配制成质量浓度4‑10％的溶液，与质量浓度0.1％‑2％的氯化钾水溶液混合，对混合液进行醇洗除盐，得到低分子量的κ‑卡拉胶钾。
本发明方法步骤简单，条件温和，制备得到的低分子量κ‑卡拉胶钾的分子量稳定在较小范围内，且钾离子结合率高，可作为食品添加剂添加到食品中作为保健品，也可以制备成药物作为预防或治疗高血压的药品。
申请人：中国海洋大学
地址：266000 山东省青岛市崂山区松岭路238号
国籍：CN
代理机构：北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)
代理人：李冉
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卡拉胶酶的来源、性质、结构与应用研究进展
卡拉胶酶的来源、性质、结构与应用研究进展郭子龙;唐天城;徐寅啸;朱本伟;姚忠;宁利敏【期刊名称】《生物加工过程》【年(卷),期】2022(20)5【摘要】卡拉胶作为构成红藻植物细胞壁的主要成分,是一种由D-半乳糖通过交替的α-1,3和β-1,4糖苷键连接而成的线性硫酸多糖。
由于具有良好的成胶能力和化学稳定性,卡拉胶作为增稠剂和胶凝剂等添加剂在食品和化妆品行业中得到了广泛的应用。
卡拉胶酶属于糖苷水解酶,可以将卡拉胶降解成一系列偶数聚合度的寡糖。
卡拉胶寡糖由于具有抗炎、抗凝和抗肿瘤等多种功能,引起了相关研究者的持续关注。
因此,通过筛选、表征或者改造等手段获得具有优良特性的卡拉胶酶成为目前红藻多糖资源开发领域的研究热点。
特别是,数十种不同来源的卡拉胶酶已经被分离、鉴定和表征,大大丰富了红藻多糖水解酶的研究领域。
根据酶的底物专一性,可将其分为三类:λ-、ι-和κ-卡拉胶酶。
本文综述了卡拉胶酶的来源、分类及生化特性的最新进展。
此外,还详细介绍了不同家族卡拉胶酶的结构特点和催化机制,并讨论了卡拉胶酶在制备功能性寡糖方面的应用前景。
【总页数】14页(P476-489)【作者】郭子龙;唐天城;徐寅啸;朱本伟;姚忠;宁利敏【作者单位】南京工业大学食品与轻工学院;南京中医药大学医学院·整合医学院【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.南极低温降解卡拉胶菌株的筛选、鉴定、产酶条件及酶学性质的初步研究2.微生物菊粉酶基因结构、酶学性质与应用研究进展3.解纤维素热酸菌来源的耐热磷酸酶的酶学性质与应用4.解纤维素热酸菌来源的耐热磷酸酶的酶学性质与应用5.假交替单胞菌JMUZ2重组κ-卡拉胶酶的异源表达和酶学性质因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
卡拉胶降解酶的分离纯化
卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。
卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。
与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。
对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1]卡拉胶可分为八种类型。
κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。
另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。
卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。
我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。
有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。
而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降卡拉胶降解酶的分离纯化解的底物命名的。
许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有[5]。
根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。
1995年，Philippe Potin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。
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将４０ Ｕ纯酶加入到２０ ｍＬ ５ ｇ／Ｌ的『卡拉胶溶 液中，４０℃充分反应４８ ｈ，酶解混合物经旋转蒸发浓 缩后，上清液上Ｐ６凝胶过滤柱进行分离纯化，流动相 为０．２ ｍｏｌ／Ｌ ＮＨ。ＨＣ０３［１ ３ｌ。分离纯化后的组分利用 荧光交联聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＦＡＣＥ）［１４］和质谱技术 （ＥＳＩ—ＭＳ）［１３］进行分析鉴定。
··通讯作者：Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｗ９６６＠ＯＵＣ．ｅｄｕ．ｍ
万方数据
中国海洋大学学报
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
化，接种子含ｒ卡拉胶的选择性培养基中，于２５℃ １１０ ｒ／ｒａｉｎ振荡培养２４ ｈ，测定上清液的酶活力，选取 活力最高的作为实验菌株。 １．５菌株鉴定
按文献方法嘲对细菌进行初步分类，并以细菌基
７和反向引物５＇－ＴＡ渊ＡＣ－ 因组ＤＮＡ为模板，使用正向引物５＇－ＡＧＡＧＴＴＴ—
率为４３．９％，分子量大小为３３．２ ｋＤａ。酶的最适反应温度为４０℃，最适反应ｐＨ为８．ｏ，在ｏ～４０℃，ｐＨ＝７．Ｏ～８．０之间
酶活力较稳定。酶对底物ｒ卡拉胶的米氏常数Ｋ。值为１．６ ｍｇ／ｍＬ。Ｎａ＋、Ｋ＋对酶活有促进作用，而Ｈｅ＋、ＣＣ＋强烈抑
制酶的活性。酶解『卡拉胶的主产物为硫酸新胪卡拉二糖和硫酸新ｒ卡拉四糖。
２．１．１菌株的筛选 经过初筛、复筛，共分离筛选获 得了２９株具有ｒ卡拉胶酶降解活性的菌株，选择酶活
万方数据
３期
段高飞，等：海洋细菌ＱＹ２０２产ｒ卡拉胶酶的分离纯化和性质研究
力最高的菌株ＱＹ２０２作为研究对象，其２４ ｈ发酵液上 ２．２酶的分离纯化
清的酶活力可达１８．７ Ｕ／ｍＬ。
发酵液上清经硫酸铵沉淀、脱盐后上ＤＥＡＥ阴离
度到达１１．７ ｇ／Ｌ时，目的蛋白开始被洗脱下来，收集 活性组分。如图ｌ所示，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳显示目的蛋 白为单一条带，大小为３３．２ ｋＤａ。经过分离纯化，目的 蛋白被纯化了２３．１倍，回收率为４３．９％（见表１）。
Ｔａｂｌｅ １
表１ ｒ卡拉胶酶的纯化 Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＱＹ２０２
取０．１ ｍＬ酶液加入到０．９ ｍＬ ２．０ ｇ／Ｌ旷卡拉胶 底物（Ｏ．０５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ８．０磷酸盐缓冲液配制）中，４０℃ 反应１５ ｍｉｎ，用ＤＮＳ法测定还原糖的产生量［１１｛。用 １００℃灭活５ ｍｉｎ的酶液作对照。１个酶活力单位（Ｕ） 定义为：在该条件下，每分钟产生１ ｔｔｍｏｌ还原糖（以ｎ 半乳糖计）所需要的酶量。 １．９蛋白含量测定
属嘲。 １．６酶的分离纯化
发酵液上清中缓慢加入硫酸铵至饱和度８０％，加 完后继续搅拌１ ｈ，沉降过夜，以上操作均在冰上进行。 １２ ０００ ｒ／ｒｎｉｎ ４℃离心１５ ｍｉｎ，沉淀以２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ７．０ ＰＢ｝容解，使用同样缓冲液用Ｇ２５脱盐柱进行脱盐 处理，然后上ＤＥＡＥ弱阴离子交换柱，以含有ＮａＣｌ的 ＰＢ缓冲液进行线性梯度洗脱。流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，检测 波长为２８０ ｎｍ，分部收集洗脱组分，测定酶活力。 １．７ ＳＤ孓ＰＡＧＥ电泳
２结果
２．１菌株筛选与鉴定
（泳道Ｍ：蛋白质分子量标准；泳道１：纯化的舻卡拉胶酶 Ｌａｎｅ Ｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄｓ， Ｌａｎｅ １：Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｒｃａｒｒａｇｅｅｎａｓｅ） 图１ Ｆ卡拉胶酶的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析
Ｆｉｇ．１ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｊｃ－ｃｍ＇ｒａｇｅｅｒｍｓｅ
５０℃放置ｌ ｈ，酶活力则完全丧失（见图３）。
２．３．３ ｐＨ对酶活的影响
如图４所示，该酶在ｐＨ
ＡＬ质谱仪。
１．２样品 采集自青岛太平角海域的红藻角叉菜（Ｃ矗ｏｎｄｒｕｓ
ｃｒｉｓｐｕｓ）。 １．３培养基
选择性培养基组成如下（ｇ／Ｌ）：ＮａＣｌ弧０，ＭｇＳ０４·
７Ｈ２０ ３．０，ＣａＣｌ２ ０．２，ＫＣｌ ０．１，ＦｅＳ０４ ０．０２，Ｃａｓｅｉｎ ３．０，Ｎａ２ＨＰ０４·１２Ｈ２０ １．５，ＮａＨ２Ｐ０４ １．０，液体培养 基中『卡拉胶含量为１．０ ｇ／Ｌ，固体培养基中『卡拉胶 含量为３０．０ ｇ／Ｌ，１００ ｋＰａ灭菌１５ ｍｉｎ。 １．４菌株的筛选 １．４．１富集培养 将采集的角叉菜加入到含２．５∥Ｌ
第４０卷第３期 ２０１０年３月
中国海洋大学学报
ＰＥＲｌ０ＤＩＣＡＬ ｏＦ ＯＣＥＡＮ ＵＮｌＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＡ
４０（３）：０９５～１００ Ｍａｒ．，２０１０
海洋细菌ＱＹ２０ ２产Ｋ一卡拉胶酶的分离纯化和性质研究。
段高飞，苏 贝，韩 峰，于文功”
（中国海洋大学医药学院，山东青岛２６６００３）
卡拉胶为国产食品级，其它生化试剂均为国产分析纯。 Ｇ２５脱盐柱、ＤＥＡＥ阴离子交换柱和快速蛋白分离纯 化系统均为ＧＥ公司产品，Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ６ Ｆｉｎｅ凝胶与垂
直电泳系统购自美国Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司，英国ＳＹＮＧＥＮＥ 公司ＧｅｎｅＧｅｎｉｕｓ全自动凝胶成像分析系统，ＤＵ ６４０ 蛋白核酸分析仪和美国ｗａｔｅｒ公司的ＱＴＯＦ ＧＬ０＆
关键词：『卡拉胶酶；交替假单胞菌；分离纯化；性质研究
中图法分类号： Ｑ９３
文献标志码： Ａ
文章编号： １６７２—５１７４（２０１０）０３一０９５一０６
卡拉胶是由１，３一ｐｎ吡喃半乳糖和１，４一旷Ｄ吡喃 半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖， 主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和 沙菜属等的细胞壁中＝１］。根据其二糖单元上所含的硫 酸基团的数量和内醚环的有无，可将卡拉胶分为ｒ、ｃ一、 卜、ｒ、Ｕ＿、矿、｝和ｆＤ－卡拉胶等类型，工业生产和使用的 主要为ｒ卡拉胶、ｃ－卡拉胶和卜卡拉胶３种。ｒ卡拉胶 由ｌ，３连接的４一。硫酸－８＿Ｄ半乳糖和ｌ，４连接的３， ６一内醚一ａ—Ｄ－半乳糖交替连接而成。『卡拉胶酶（ＥＣ ３．２．１．８３）主要来源于海洋细菌［２｛］，通过断裂『卡拉 胶的Ｂ＿１，４糖苷键降解旷卡拉胶。『卡拉胶酶的用途 广泛，如红藻细胞壁结构分析、红藻原生质体制备和矿 卡拉胶寡糖制备等。ｒ卡拉胶寡糖及其衍生物具有很 多很好的生物活性，如抗病毒［４］、抗肿瘤［５］、免疫调 节睁７］等。因此获得高效降解卡拉胶的菌株和高活性 的ｒ卡拉胶酶具有重要的科研和应用价值。本文从青 岛太平角海域附近采集的角叉菜表面筛选得到１株高 产ｒ卡拉胶酶的菌株，并对其所产『卡拉胶酶进行了 分离纯化和酶学性质研究。
２．３酶学性质研究
２．３．１酶的底物特异性 该酶能够特异性地降解ｒ
卡拉胶，而对ｃ一卡拉胶、入一卡拉胶、琼胶和褐藻胶几乎没
有降解作用，说明该酶是１个专一的ｒ卡拉胶酶。
Ｔａｂｌｅ ２
表２酶的底物特异性 Ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ
底物 Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｆｉｇ．２
图２酶的最适反应温度 Ｏｐｔｉｍａｌ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ０ｆ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ
２．３．２温度对酶活的影响 如图２所示，该酶在４０℃ 反应酶活力最高，超过４０℃反应，酶活力急剧下降；随 着温度的升高，酶的稳定性降低，在４０℃放置１ ｈ，酶
万方数据
活力仍可保存约６０％，超过４０℃酶稳定性急剧降低，
２．１．２菌株的鉴定 该菌株革兰氏染色阴性，杆状，
子交换层析柱，以ＮａＣｌ浓度线性梯度洗脱，当ＮａＣｌ浓
可运动；１６Ｓ ｒＤＮＡ序列全长１ ５００ ｂｐ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登录 号ＧＱ２０２２８０），序列比对发现其与交替假单胞菌属同 源性高达９９％，鉴定该菌株属于交替假单胞菌属，命名 为Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＱＹ２０２。
１材料与方法
１．１试剂与仪器 测酶活用『卡拉胶、酸水解干酪素、７一氨基一１，３一萘
酚一二硫酸、硼氰化钠均为Ｓｉｇｎｍ－Ａｌｄｒｉｅｈ产品，丙烯酰 胺、甲叉双丙酰胺为Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｅｈ公司产品，
ＴＥＭＥＤ、ＡＰＳ等购自上海生工生物技术服务有限公
司，蛋白分子量标准为ＭＢＩ公司产品，培养细菌用旷
使用不连续垂直电泳系统，对分离纯化的ｒ卡拉 胶酶进行分析。参照Ｌａｅｍｍｌｉ方法［１０］进行，分离胶浓 度为１２．ｏ％，浓缩胶浓度为５．ｏ％，电泳采用ｐＨ＝８．３ 的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲体系。电泳后考马斯亮兰Ｒ２５０进行 染色，用凝胶成像仪进行分析。蛋白质分子量标准如 下：ｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４．４ ｋＤａ），ｐ－ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（１８．４ ｋＤａ），ｒｅ凋ｔｓｅ ｂｓｐ９８１（２５．０ ｋＤａ），ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｍｓｅ（３５．０ ｋ跣）， ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４５．０ ｋＤａ），ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｎｌｍ ａｌｂｕｍｉｎ（６６．２ ｋＤａ）， ｐｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ（１１６．０ ｋＤａ）。 １．８酶活力测定与定义
相对酶活力 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ／％
ｒ卡拉胶舻ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ
ｉ００士０．４１
ｃ－卡拉胶ｒｅａｒｒａｇｅｅｎａｎ
３．９士０．２２
卜卡拉胶ｋ－ｃａｒｒａｇｅｅｎａｎ
０．９５：０．１２
琼胶Ａｇａｒｏｓｅ
２．２士０．１９
褐藻胶Ａｌｇｉｎａｔｅ
０．２士０．０３
１
穴喜 藿趸 蒌喜
盘
温厦ｎ唧哪ｎⅡ叫℃
的Ｆ卡拉胶的灭菌海水中，２５℃静置培养１周。
１．４．２初筛
梯度稀释富集培养液，涂布平板筛选
产生『卡拉胶酶的菌株。根据菌落周围水解圈的大小 初步判断菌株降解Ｋ－卡拉胶的能力。