第八章荧光分光光度法与检测技术。
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F = K′（I0 – I）
20
第二节 荧光定量分析
K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条 件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：
F = 2.303·φF·I0·ε·c·L
入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定 值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：
F = Kc
21
Fs F0 cs Fx F0 cx
cx
Fx Fs
F0 F0
cs
25
第二节 荧光定量分析
多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需
经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物 质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同 荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外可见分光光度法广泛。
15
第一节 基本原理
（三）仪器校准 灵敏度校准 波长校准 激发光谱和发射光谱校准
16
第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
17
第一节 基本原理
点滴积累
荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射 时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。
二、定量分析方法 标准曲线法
配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液， 分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲
线。 然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准
曲线上查找对应的浓度cx。
24
第二节 荧光定量分析
比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围
用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强 度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx）， 然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：
第二节 荧光定量分析
当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的 荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的 依据。
但只有当荧光物质的浓度很小时， 即ε·c·L ≤ 0.05，这种关系才成立。
22
第二节 荧光定量分析
课堂互动
请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度 比紫外-可见分光光度法要高？
23
第二节 荧光定量分析
最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
18
第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和 结构情况。
12
第一节 基本原理
（一）仪器类型
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
13
第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发Baidu Nhomakorabea色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
14
第一节 基本原理
光源 目前最常用的是氙灯 单色器（分光系统） 激发单色器 发射单色器 样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英 检测器 光电倍增管
26
第二节 荧光定量分析
点滴积累
当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在 稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。
荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。
27
第三节 应用与发展
7
第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征 具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数
荧光效率 F 吸收激发光的量子数
8
第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系
大的共轭π键结构
λex（激发） λem（激发）
φF
苯
205
278
0.11
萘
286
321
0.29
蒽
365
400
0.46
四苯
390
480
0.60
9
第一节 基本原理
分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18
取代基的影响
芴F=1.0
10
第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素
温度 溶剂 溶液酸碱性 荧光熄灭剂 散射光 激发光源
11
第一节 基本原理
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
2
第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
3
第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动 您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
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第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
第一节 荧光分光光度法的基本原理
某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。
荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
1
第一节 基本原理
5
第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光 波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质
所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。
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第二节 荧光定量分析
K′为常数，称荧光比率，其大小取决于一定条 件下的荧光效率，结合比尔定律可得到下式：
F = 2.303·φF·I0·ε·c·L
入射光强度I0在波长一定，光源稳定时为固定 值，因此可以将2.303·φF·I0·ε·L视为常数K，故：
F = Kc
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Fs F0 cs Fx F0 cx
cx
Fx Fs
F0 F0
cs
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第二节 荧光定量分析
多组分混合物测定 与吸光度一样，荧光强度也有加和性，因此混合物不需
经过分离，可用解联立方程的方法测定。可选择两物 质不同的激发波长处的荧光强度测定，也可选择不同 荧光波长处的荧光强度测定，这样选择范围比紫外可见分光光度法广泛。
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第一节 基本原理
（三）仪器校准 灵敏度校准 波长校准 激发光谱和发射光谱校准
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第一节 基本原理
课堂互动 请您比较荧光分光光度计与紫外-可见分光 光度计的主要区别
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第一节 基本原理
点滴积累
荧光和磷光在实验现象上的区别：激发光停止照射 时，荧光随之消失而磷光则将延续一段时间。
二、定量分析方法 标准曲线法
配制一系列浓度为c1、c2、c3……对照品溶液， 分别测其F1、F2、F3……值，用F~c作图绘制标准曲
线。 然后在同样条件下测定试样溶液的Fx，在标准
曲线上查找对应的浓度cx。
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第二节 荧光定量分析
比例法 若荧光分析标准曲线过原点，则可选择其线性范围
用比例法测定。即配制一对照品溶液（cs）测其荧光强 度（Fs），再测定试样溶液（cx）的荧光强度（Fx）， 然后进行比较。测定时同样要以空白（F0）校正：
第二节 荧光定量分析
当其他条件也一定时，荧光物质在稀溶液中的 荧光强度与浓度呈线性关系，这是荧光定量分析的 依据。
但只有当荧光物质的浓度很小时， 即ε·c·L ≤ 0.05，这种关系才成立。
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第二节 荧光定量分析
课堂互动
请您分析为什么荧光分光光度法的灵敏度 比紫外-可见分光光度法要高？
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第二节 荧光定量分析
最强荧光波长λem和最强激发波长λex是物质的定性 依据，也是定量测定时的最适宜波长。
强荧光物质的分子结构体征：一、具有长共轭结构， 如芳香环、稠环或杂环；二、刚性和共平面性。
影响荧光强度的主要因素是分子结构与外界条件。
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第二节 荧光定量分析
第二节 荧光定量分析
由于荧光物质的结构不同，其吸收光的波长不同， 发射出荧光的波长也不同，这就是荧光分光光度法对
（四）荧光分光光度计
荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出 的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发 射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏 振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和 结构情况。
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第一节 基本原理
（一）仪器类型
滤光片荧光计 滤光片-单色器荧光计 荧光分光光度计
能产生荧光的物质进行定性分析的依据。实验证明，
在稀溶液中，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这 是荧光分光光度法对荧光物质进行定量分析的依据。
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第二节 荧光定量分析
一、荧光强度与物质浓度的关系
当溶液中荧光物质的浓度为c，液层厚度为（吸收 池内径）L时，由于荧光强度F正比于被荧光物质吸
收光的强度：F∝（I0 – I），用线性方程表示为：
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第一节 基本原理
（二）荧光分光光度计的基本结构
1.光源 2. 4. 7. 9. 狭缝 3. 激发Baidu Nhomakorabea色器 5. 样品池 6. 表面吸光物质 8. 发射单色器 10. 检测器 11. 放大器 12. 指示器 13. 记录器
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第一节 基本原理
光源 目前最常用的是氙灯 单色器（分光系统） 激发单色器 发射单色器 样品池 测定荧光用的样品池必须用低荧光材料或石英 检测器 光电倍增管
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第二节 荧光定量分析
点滴积累
当其他条件（即φF、I0、ε、L）一定时，荧光物质在 稀溶液中的荧光强度F与浓度c成正比。
荧光分析的定量方法与紫外-可见分光光度法基本相同。
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第三节 应用与发展
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第一节 基本原理
三、荧光与分子结构
（一）荧光物质的特征 具有强的可见-紫外吸收，即具有K带强吸收 具有高的荧光效率
发射荧光的量子数
荧光效率 F 吸收激发光的量子数
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第一节 基本原理
（二）分子结构与荧光的关系
大的共轭π键结构
λex（激发） λem（激发）
φF
苯
205
278
0.11
萘
286
321
0.29
蒽
365
400
0.46
四苯
390
480
0.60
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第一节 基本原理
分子的刚性和共平面性
联苯φF =0.18
取代基的影响
芴F=1.0
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第一节 基本原理
（三）影响荧光强度的外界因素
温度 溶剂 溶液酸碱性 荧光熄灭剂 散射光 激发光源
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第一节 基本原理
一、荧光的产生过程 （一）单重态与三重态 A 单重基态 B 激发单重态 C 激发三重态
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第一节 基本原理
（二）荧光的产生 电子由激发单重态 →基态单重态的跃 迁
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第一节 基本原理
（二）磷光的产生 电子由激发三重态→基态单重态的跃迁
课堂互动 您能比较荧光和磷光的主要区别吗？
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第一节 基本原理
二、激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
第一节 荧光分光光度法的基本原理
某些物质吸收紫外-可见光后，可以发射其波长比 吸收光更长的光，并且随照射光的消失而消失，这 种发射光称为荧光（fluorescence）。
荧光分析法（fluorometry）是利用某些物质发射荧 光的特性进行定性、定量分析的光学分析方法，又 称荧光光谱法
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第一节 基本原理
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第一节 基本原理
任何荧光物质都具有两个特征光谱：
激发光谱和荧光光谱（发射光谱）
激发光谱是当荧光波长一定时，荧光强度随激发光 波长而变化的关系曲线（以激发光波长λex为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标的光谱）。
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第一节 基本原理
荧光光谱是当使激发光波长和强度不变，而让物质
所产生的荧光通过发射分光系统 ( II )分光，测定每 一发射波长荧光强度F，以发射光波长λem为横坐标 ，荧光的发光强度F为纵坐标作图所得的关系曲线。