丁醇体系中温度对脂肪酶活性及二级结构影响的研究

彭煦，董亚琴，石贤爱，郭养浩，孟春*（福州大学生物科学与工程学院，福州，福建，350002）E-mail: mengchun@摘要：在-20—80°C的范围内，研究了丁醇体系中温度对脂肪酶催化扁桃酸乙酯手性拆分反应的影响。

结果表明，在有机介质中，-20°C下酶仍可表现出一定的催化活性。

酶活性随着温度升高而增加，0°C时酶的对映体选择率E达到最高，当温度升到60°C时酶催化反应速度达到最大。

脂肪酶的红外光谱和紫外颗粒扫描光谱表明，有机相比水相更利于脂肪酶结构稳定性的维持和酶活性与耐热性的提高。

关键词：脂肪酶，扁桃酸乙酯手性拆分，红外光谱，紫外扫描中图分类号：TQ426.97 文献标识码：A引言目前能对蛋白高级结构进行检测的方法主要包括二维核磁共振、X衍射、红外光谱（IR）等几种方法。

其中二维核磁共振、X衍射虽然较为精确，但对检测的环境要求较高，无法应用在环境中蛋白结构变化特性的研究。

迄今为止能精确检测蛋白结构变化的方法还较少，IR技术在蛋白二级结构及结构变化分析中，逐渐发展成为一种强有力的工具，特别是在研究液相中蛋白结构变化动力学方面，具有独特优势［1-4］。

IR，特别是傅里叶变换红外光谱（FTIR），已经成为目前最为常用的分析多肽和蛋白质二级结构的方法，它能灵敏地反映出肽链结构的变化。

蛋白质的IR光谱图谱有三组特征吸收谱带：酰胺I、酰胺II 和酰胺III，其波长分别对应于1700～1600 cm-1、1530～1550 cm-1和1260～1300 cm-1范围。

酰胺I区域显示一个宽带峰（最大峰吸收约为1648 cm-1），该峰对蛋白质的二级结构变化相当敏感，通过对该峰值变化的信息分析研究蛋白结构变化，已成为目前蛋白结构变化研究的主要手段。

该波段由至少5个主要波段信息组成，分别位于1615、1638、1655、1670以及1687cm-1位置。

1638和1687cm-1的二个峰带是β-折叠（β-sheet）中酰胺的主要特征，1655 cm-1来自于α-螺旋或无规卷曲结构，1670 cm-1组成归属于β-折角，而1615 cm-1的一个弱峰归属于由于蛋白质絮凝引起的分子间的β-折叠[5－7]。

有机相中脂肪酶表现出不同于水相的催化反应特性，特别是在酶的稳定性维持、催化脂溶性底物反应方面，有着水相体系无法比拟的优点。

但是在有机相中，温度对酶结构影响的报道还较少，本工作以纯化的脂肪酶为催化剂，研究了扁桃酸乙酯在正丁醇体系中的酯交换反应。

考察反应温度对脂肪酶催化活性和对映体选择性的影响。

并分别采用IR和紫外光谱，初步研究了有机相中酶二级结构随温度的变化规律。

2 实验部分2.1 脂肪酶的来源、制备及反应体系脂肪酶（component B of the lipase from Candida antartica）购自丹麦诺维信公司，为了进一步的研究，采用制备HPLC（离子交换柱）对脂肪酶纯化，采用SDS凝胶电泳分析，蛋白只有一条带。

丁醇中酯交换反应体系在10mL带塞三角瓶中进行酯交换反应，装入预定量的反应底物和5mL正丁醇，加酶开始反应，在不同温度水浴摇床，200rpm转速震荡。

2.3 分析测定采用日本岛津公司生产GC-14C气相色谱仪，SE-30毛细管柱(25 m0.25 mm0.25m ，大连化学物理研究所)，升温程序(在140℃运行3.5ｍｉｎ，再以45℃/min升温至260℃保温6 min)。

进样器温度270℃检测器为FID，温度290℃。

e.e值：Cycolsilb112-6632手性毛细管柱(30 m　0.25 mm0.25m ，Agilent公司），柱温150℃，进样器温度270℃，检测器为FID，温度270℃。

对映体选择率E：E=ln[(1-C)(1-e.e.s)]/ln[(1-C)(1+e.e.s)], 式中C为转换率，e.e.s为底物的对映过量值。

E 值越大，酶的对映体选择性越好，E值为1，表示酶无对映体选择性。

称取冻干的脂肪酶适量，放在丁醇中，在相应的温度下放置1小时，然后涂在相应温度放置的载物板上，用SPECTRUM2000 红外光谱仪和Varian CARY500紫外/可见/近红外分光光度计进行不同波段扫描。

3 结果与讨论3.1 不同温度对酯交换反应的影响脂肪酶在丁醇体系中催化扁桃酸乙酯反应，发生了不对称酯交换反应，生成了R-扁桃酸丁酯和乙醇。

在-20、-10、0、20、30、45、60、80°C温度下，在丁醇体系中研究了温度对酶催化扁桃酸乙酯转酯化反应的影响。

实验结果表明（表1），在-20°C到80°C温度范围内，脂肪酶均表现出催化活性，随着温度的升高，酶催化的反应速度加快，当到达60°C达到最高。

与有机相中酶的稳定性相比，脂肪酶在水中易失活。

脂肪酶在水中45°C维持1h，冻干后加入丁醇体系，催化扁桃酸乙酯的拆分反应，效果较差。

这表明水相中45°C已经造成酶的严重失活。

表1 温度对转化效果的影响Table 1 Effect of reaction temperature on conversionTemperature(°C)Conversion rate ofethyl mandelate (12h)(%)e.e.p(%)E-20 2.120.3 1.5 -10 6.322.1 1.6 -5 10.260.2 4.0 0 16.492.224.7 20 22.686.113.4 30 30.682.310.3 45 41.576.17.4 60 53.566.2 4.9 80 46.250.1 6.2 45* 2.015.10.9*酶在H2O中45°C处理1h后再冻干3.2 不同温度下脂肪酶的红外光谱图1不同温度条件下脂肪酶的红外图谱Fig 1. IR spectrum of lipase in different temperatures为了进一步研究酶在有机相中稳性的原因，本研究采用IR技术，对不同温度下有机相中酶二级结构进行了对比分析研究（图1）。

从红外图谱(400～4000 cm-1) 中可以看出，在-20，60°C条件下，脂肪酶蛋白的酰胺I区和酰胺II区结构没有明显的变化，亲脂性环境中温度对蛋白二级结构的没有发生明显的影响。

蛋白质红外光谱的特征谱带主要为1660 cm-1(酰胺I)、1541 cm-1 (酰胺II)和1250～1300 cm-1 (酰胺III)。

由于丁醇在1250～1300 cm-1 有较强的谱带，因此酰胺III在此体系中无法用于蛋白结构的分析。

从图1可以看出，样品的红外光谱特征谱主要位于1660 cm-1(酰胺I)、1540cm-1 ( 酰胺II) 。

这表明该脂肪酶主要由β-转角和α-螺旋或无规卷曲组成。

随着温度的升高，有机相中酶的各个特征峰未表现出明显的移动。

图2脂肪酶在酰胺I和II的谱带分析Fig 2. IR spectrum of amide I and II of lipase进一步对比蛋白质的酰胺I和酰胺II 谱带的相对强度变化可以看出，相对于在水中45°C处理过的酶，有机相中酰胺I的峰强度有很明显的增强(即透过率下降)，峰型较尖。

这说明α-螺旋或无规卷曲及β-转角在二级结构中的总比例有较大的提高。

酰胺II谱带能灵敏地反应出分子间或分子内的氢键缔合作用[8 ]。

有机相中温度从-20上升至60°C，酰胺II峰高无明显的变化，但水45°C处理的酶，峰的相对强度增加，同时在1613cm-1附近出现了一弱峰，表明β-折叠的形成与酶的失活有一定的相关性。

在一般固体结构中，当温度下降时，由于原子间的间距有所减小，从而导致相互作用力上升，振动频率应随温度下降而蓝移，而β折叠结构中的振动模强度在温度下降时减小。

温度的升高会导致蛋白β聚合，其标志就是在1615与1683 cm-1附近出现较强的吸收带。

因为β聚合中发生的β折叠片结构出现很强的氢键相互作用，使蛋白出现不可逆聚合，某种程度上挤压了α螺旋结构，导致了酶的结构发生了改变，影响了酶的催化活性。

结果表明，有机相中酶的结构具有较好的稳定性。

3.3 不同温度下脂肪酶的紫外反射光谱本工作进一步用紫外光谱对丁醇中脂肪酶随温度的变化进行了分析（图3）。

270～280 nm 主要为色氨酸(Trp) 和酪氨酸(Tyr) 的吸收峰，225nm 附近为肽键的吸收峰。

紫外分析结果表明，经过45°C水处理后的酶，脂肪酶的紫外吸收光谱有明显的改变，一个显著的特征是在260～280nm范围，吸收峰向长波方向移动(即红移)，其肽键吸收峰也发生红移。

多肽链结构发生了变化，特别是Tyr 和Trp 残基的Cα原子的构型(configuration)或构象(conformation) 发生了较大的变化。

Tyr 和Trp残基的吸收峰红移说明其Cα原子的构型从非平面型转变为平面型。

主要是由于维持空间结构所必需的一些非共价键受到影响，减弱了空间障碍效应[10]。

而有机相中，两种温度下的酶的主要峰位置未发生明显的红移现象，这表明，酶在有机相中的温度稳定性高于水相。

图3不同温度条件下脂肪酶的紫外图谱Fig 3. UV reflection spectrum of lipase in different temperatures4 讨论丁醇体系中，温度对脂肪酶催化的扁桃酸乙酯拆分反应有明显的影响。

有机相中酶的稳定性较好。

红外扫描和紫外反射光谱分析表明，丁醇中酶在如此广的温度范围内具有催化活性，其稳定性可能要归功于有机溶剂中酶的“刚性”结构，酶的几个不可逆失活过程（如：脱氨基、肽链水解、胱氨酸分解等）都需要水，而这些不可逆失活过程在低水介质中大大降低，因此酶的稳定性大大增加。

致谢：本文光谱测定工作得到了福州大学福建省光催化技术工程研究中心戴文新博士的大力支持。

参考文献：[1] Subirade M, Salesse C, Marion D, Pezolet M. Interaction of a nonspecific wheat lipid transfer protein with phospholipid monolayers imaged by fluorescence microscopy and studied by infrared spectroscopy [J]. Biophys J, 1995, 69(3): 974-988.[2] Lefèvre T, Subirade M. Biochim Biophys Acta 2001;1549:37. Lefèvre, T., and M. Subirade. Conformational rearrangement of b-lactoglobulin upon interaction with anionic membrane [J]. Biochim. Biophys. Acta, 2001, 1549: 37-50.[3] Lefèvre T, Subirade M. Biopolymers 2000;54:578. Lefèvre, T. & Subirade, M. Molecular differences in the formation and structure of fine-stranded and particulate β-lactoglobulin gels [J]. Biopolymers, 2000, 54 , 578-586.[4] Fabian H, Schultz C, Nauman D, Landt O, Hahn U, Saengen W, et al. Secondary structure and temperature-induced unfolding and refolding of ribonuclease Tl in aqueous solution [J]. J Mol Biol 1993, 232: 967-981.[5] From N B, Bowler B E. Urea Denaturation of Staphylococcal Nuclease Monitored by Fourier Transform Infrared Spectroscopy [J]. Biochemistry, 1998, 37: 1623-1631[6] Bandekar J. Amide modes and protein conformation [J]. Biochim Biophys Acta, 1992, 1120（2）:123-143.[7] Kauppinen J K, Moffatt D J, Mantsch H H. Fourier self-deconvolution: a method for resolving intrinsically overlapped bands [J]. Appl Spectrosc, 1981, 35: 271-276.[8] Yadav, G D, Sivakumar, P. Enzyme-catalysed optical resolution of mandelic acid via RS(∓)-methyl mandelate in non-aqueous media [J]. Biochem. Eng. J, 2004, 19: 101–107[9] Xiao MT, Huang Y, Meng C, Shi XJ. Chiral separation of mandelic acid ester enantionmer by capillary electrophoresis [J]. Instrumental Analysis. 2003, 22, 47 – 49Xu Peng，Yaqin Dong，Xian’ai Shi，Xian’ai Shi，Chun MengCollege of Biological Science and Biotechnology, Fuzhou University, Fujian, China. PC:350002Abstract: In this paper we performed resolution of racemic ethyl mandelate using lipase as a biocatalyst in butanol media in a temperature range from -20°C to 80°C. Lipase showed catalytic activity at -20°C. At 60°C the reaction reached the highest conversion rate and at 0°C the reaction gave the best enantioselectivity. The structural changes of solid lipase based on Infrared spectrometer (IR) spectroscopy and UV reflection spectra showed that stable structure of lipase is the main reason that lipase could keep higher catalytic activity in very low and high temperature in non-aqueous media than in aqueous media.Key words: lipase, resolution of racemic ethyl mandelate, Infrared spectrometer, UV reflection spectra。