盐酸表阿霉素与牛血清白蛋白相互作用的研究及药物在血清与尿样中含量的测定
光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的相互作用
光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的相互作用
光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的相互作用
摘要：采用荧光光谱、紫外光谱和圆二色光谱法并结合电化学方法,研究了大黄酸与牛血清白蛋白之间的相互作用.结果表明:大黄酸对牛血清白蛋白有较强的荧光猝灭作用且为静态猝灭,并计算得出不同温度下其结合常数(KA)与结合位点数(n)分别为:3.67×105,0.95(298 K)；
2.60×104,0.83(309 K).由热力学参数确定它们间的.作用力主要是静电引力,并依据F(o)rster能最转移理论求得其结合距离为
3.28 nm,同步荧光光谱及圆二色谱表明大黄酸对牛血清白蛋白的构象产生影响. 作者：梁慧赵芳李炳奇 Author： LIANG Hui ZHAO Fang LI Bing-qi 作者单位：石河子大学化学化工学院,新疆石河子,832000 期刊：光谱学与光谱分析 ISTICEISCIPKU Journal： Spectroscopy and Spectral Analysis 年，卷(期)： 2011, 31(9) 分类号： O657.3 关键词：大黄酸牛血清白蛋白荧光光谱圆二色谱电化学机标分类号：O64 O65 机标关键词：同步荧光光谱电化学方法方法研究大黄酸牛血清白蛋白相互作用 Bovine Serum Albumin Interaction 圆二色光谱法荧光猝灭作用紫外光谱转移理论圆二色谱静态猝灭静电引力结合位点结合常数参数确定不同温度作用力基金项目：国家自然科学基金。
中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用
Vol.25高等学校化学学报 No.11 2004年11月 CHEM ICAL JOU RNAL OF C HINESE UNIVERSITIES 2099～2103 中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用刘雪锋,夏咏梅,方 云,刘玲玲,邹 鲁(江南大学化学与材料工程学院,无锡214036)摘要 从天然中药材黄连中提取分离并精制得到盐酸小檗碱(BC),采用U V光谱和荧光光谱(FS)研究其与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用,解释了BC导致BSA的荧光发射光谱峰裂分的现象,其二重峰分别归属于色氨酸及酪氨酸残基.结果表明,静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC对BSA荧光猝灭的两大原因, BC与BSA的表观结合常数K A为8.66×104L/mol(30℃)和8.72×104L/mol(37℃),BC在BSA分子上的结合位点数为(3.1±0.2).BC与BSA分子中荧光性氨基酸残基之间的距离为3.75nm(30℃)和3.62nm (37℃),表明BC的部分片段能够插入BSA分子内部.热力学函数计算结果表明,该作用过程是一个熵增加、G ibbs自由能降低的自发超分子作用过程,并由此推断BC与BSA之间以疏水相互作用为主.关键词 荧光光谱法;中药有效成分;黄连;盐酸小檗碱;牛血清白蛋白中图分类号 O648.162 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2004)11-2099-05化学小分子与生物大分子的相互作用是当前生命科学领域经常遇到的主要化学问题之一.血清白蛋白是生命体血浆中含量最丰富的蛋白质,具有贮运内源代谢产物和外源药物小分子(离子)等重要生理功能.对各类物质与生物大分子的作用已有较多报道[1～6],目前比较关注中药有效成分与生物大分子的相互作用[7,8].小檗碱(黄连素)是我国名贵中药材黄连的主要有效成分,具有抗菌消炎等作用,在原小檗属植物中广泛分布,临床上通常使用盐酸小檗碱或盐酸黄连素(Berberine chloride,BC).BC与人血清白蛋白(HSA)的表观结合常数已有报道[9],但尚未见到有关荧光发射光谱峰裂分现象的阐释以及确定BC在蛋白质分子上的结合位点数和结合位置的研究报道.本文从天然中药材黄连中提取分离并精制得到BC,用UV光谱和荧光光谱(FS)研究其与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)的相互作用,解释了BC导致BSA的荧光发射光谱峰裂分现象及二重峰的归属;确定静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC对BSA荧光猝灭的两大原因;由Lang muir单分子吸附模型与质量作用定律推得相互作用的数学模型,求得BC对BSA的表观结合常数K A及结合位点数n;证实BC的部分片段能够插入BSA分子内部,并从热力学函数计算推得BC与BSA之间以疏水相互作用为主.1 实验部分1.1 试剂与仪器黄连(生药材,宁波双林中药饮片公司),牛血清白蛋白(99.0%,BSA Fraction V,Sino-American Biotechnolog y Co.),Tris(生化试剂,上海化学试剂公司),亚沸蒸馏水(电导率7.8×10-7S/cm,自制),高纯N2气(99.99%,无锡炼钢厂),其它所用试剂均为分析纯.RF5301PC型荧光光度仪(Shi-madzu公司),UV1100型紫外光谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司).1.2 BC的提取分离与鉴定取10g黄连粗粉,用250mL×4无水乙醇抽提,浓缩抽提液并加入浓盐酸得约2g黄色沉淀.用收稿日期:2003-09-16.基金项目:江苏省自然科学基金(批准号:BJ99036)资助.联系人简介:方 云(1957年出生),男,教授,博士生导师,主要从事胶体与界面化学及酶催化研究.E-mail:fangyunzhou@Scheme 1 Molecular structure of berberine chl oride沸水溶解,热滤,取滤液加盐酸调pH =2使其重结晶.将晶体用水洗至刚果红试剂不变色,干燥后得BC (结构见Scheme 1)约0.5g,m.p.183.5～184.0℃,反相HPLC 归一化纯度>98.0%,UV ,IR 及NM R 图谱均与Sadtler 标准图谱吻合.1.3 光谱实验方法以T ris-HCl 缓冲液(pH=7.4,含0.15m ol/L NaCl 以维持溶液离子强度)为溶剂配制1.0×10-5mol /L 的BSA 标准溶液备用.BC 用无水甲醇配成2.0×10-3mol /L 的标准溶液备用.在50mL 三角瓶中精确移入一定量的BC 甲醇标液,以高纯N 2气吹赶甲醇至干,再加入BSA 溶液10mL,超声分散5min 后,于30或37℃恒温3h.激发光栅及发射光栅狭缝宽均为3nm,激发波长295nm ,恒温(30或37℃)测定上述样品在300～500nm 的荧光发射光谱.以Tris -HCl 缓冲液为溶剂配制1.0×10-5mol /L 的BC 溶液,恒温(30或37℃)测定其在300～500nm 的U V 吸收光谱.2 结果与讨论2.1 BC 对BSA 内源性荧光和分子构象的影响BSA 分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能发射荧光,所以BSA 是内源性荧光物质.图1表Fig .1 Ef fect of berberine chloride on f luorescencespectra of BSA at 37℃ c (BSA): 1.0×10-5mol/L;105c (BC )/(m ol ・L -1)from peaksa to h :0,0.375,0.75, 1.0, 1.5, 2.25,3.0and 4.5.明BC 可猝灭BSA 的内源性荧光,证明BC 与BSA之间存在相互作用.由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基在蛋白质分子内部的空间距离为7～10nm ,彼此之间的共振能量转移会导致酪氨酸及苯丙氨酸残基的荧光猝灭[10],所以在大多数情况下,蛋白质的FS 图似乎只显示色氨酸残基的荧光,其峰值在343nm 附近[11].当BC 浓度在1.0×10-5mol/L 以下,BSA 在343nm 处的荧光发射只因猝灭而导致荧光强度降低,但峰形及峰位置无明显变化.当BC 浓度达1.0×10-5mol/L 以上时,BSA 的荧光发射强度继续随BC 浓度增大而逐渐降低,同时显现峰裂分,即原来343nm 处的单峰逐渐裂分为二重峰,其中一峰峰值蓝移,另一峰峰值红移.图1的峰裂分现象目前鲜有报道[9],且对二重峰的归属尚无解释.图2(A )的同步荧光结果表明,当BC 浓度增大时,BSA 中色氨酸残基产生荧光的强度降低且峰位置红移,因此图1中红移峰应归属于色氨酸残基.基于以下实验事实,可推断蓝移峰可能是由酪氨酸残基产生的:(1)HSA 中只含有W 214,而不含有W 135色氨酸残基,但BC-HSA 体系中也出现类似图1的峰裂分现象[9],故可排除蓝移峰是BSA 分子中W 135残基产生的可能性;(2)蓝移峰强度随BC 浓度增加而降低,排除此峰为BSA-Fig .2 Synchronous f luorescence spectra of BSA c (BSA): 1.0×10-5mol/L ;105c (BC)/(mol ・L -1)from a to c :0,0.75and 1.5.(A) =60nm ;(B) =15nm.2100 高等学校化学学报V ol.25BC 复合物产生的可能性;(3)苯丙氨酸的荧光峰值位于282nm 附近[10],排除此峰为苯丙氨酸残基产生的可能性;(4)图2(B)中酪氨酸的荧光峰在305nm 附近且荧光强度随BC 浓度增加而降低,最接近图1中蓝移峰的变化趋势.因此,图1中的蓝移峰最可能是BSA 中酪氨酸残基受BC 诱导而终止与色氨酸残基间的共振能量转移,分裂出自身的荧光发射峰,其最大发射波长蓝移则表明酪氨酸残基所处微环境的疏水性增强[5].蛋白质在343nm 处的荧光峰传统上被归属为色氨酸残基[10],但从其半高峰宽超常的峰形和BC 存在时的峰裂分现象看,该宽峰应对应于蛋白质分子中所有荧光性氨基酸残基.2.2 BC 对BSA 内源性荧光猝灭作用机理对于不出现荧光发射峰裂分现象的蛋白质荧光猝灭体系,一般采用指定波长处的相对荧光强度I 与猝灭剂浓度c Q 之间的变化关系式来描述或评价荧光猝灭过程;但对于存在峰裂分的体系,以荧光发射总量S (荧光发射峰面积)与猝灭剂浓度c Q 之间的变化关系来描述或评价荧光猝灭过程[12]更合理.BC 对BSA 荧光猝灭过程若是动态猝灭,其作用过程应遵循Stern-Volmer 方程[12]:S 0/S =1+K S V c D,t(1)式中,S 0是BSA 溶液的荧光发射总量,S 是加入BC 后BSA 溶液的荧光发射总量,c D,t 是BC 的总浓度(mol/L).K S V 是Stern-Volmer 猝灭常数(L/m ol),且由下式定义:K S V =k q × 0(2)式中,k q 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数(L ・mol -1・s -1), 0是生物大分子内源性荧光寿命,本文取 0=10-8s [13].将BC 对BSA 的荧光猝灭数据(37℃)按式(1)处理作图得图3,从图3中直线部分线性拟合得到K SV =3.46×104L/mol(R 2=0.9902).由式(2)得到猝灭常数k q =3.46×1012L ・mol -1・s -1,此值远大于各种猝灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常数(2×1010L ・m ol -1・s -1)[3],表明BC 对BSA 内源性荧光的猝灭过程不是由扩散控制的动态猝灭过程,而可能是静态猝灭过程[3],并在BC 与BSA 之间形成了基态复合物.图4中BC 的UV 吸收光谱与BSA 的FS 发射光谱有相当程度的重叠,据Fo rster 无辐射能量转移理论[13],BSA 与BC 之间存在着非辐射能量转移.因此,静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC 对BSA 荧光猝灭的两大原因.Fig .3 Stern -Vol mer curves of f luorescencequenching of BC to BSA at 37℃Fig .4 Overlap of BC absorption spectrum (a )with BSA fl uorescence spectrum (b )at 37℃a .c (BC)=1.0×10-5mol/L;b .n (BC )∶n (BSA)=1∶1.根据Forster 无辐射能量转移理论,当荧光给体与受体分子之间最大距离小于7～10nm ,且荧光给体的FS 发射光谱与受体的U V 吸收光谱存在相当程度的重叠时(图4),两者之间可发生能量转移,其效率E 与给体-受体之间的能量转移距离r 及E =50%时的临界距离R 0存在下列关系:E =R 60/(R 60+r 6)(3)E =1-S /S 0(4)R 60=8.8×10-25K 2N -4!p J (5)式(5)中,K 2为偶极空间取向因子,N 为介质折射指数,!p 为BSA 的荧光量子产率,J 为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分J =(∑I p ( )∀D ( ) 4 )/(∑I p ( ) )(6)式中,I p ( )是BSA 在波长 处的荧光强度,∀D ( )是BC 在波长 处的摩尔吸光系数.据图4结果按照式(6)得J =2.818×10-14cm 3・L ・mol -1(30℃)及2.819×10-14cm 3・L ・mol -1(37℃).在本文实验2101N o.11刘雪锋等:中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用 条件下,取K 2=2/3,N =1.336,!p =0.15[13],按式(5)计算得R 0=3.03nm ,按式(4)计算得E =0.2173(30℃)及0.2561(37℃),进而得到r =3.75nm(30℃)及3.62nm (37℃),表明BC 的部分片段能够插入BSA 分子内部.2.3 BC 与BSA 的表观结合常数K A 以及结合位点数n药物小分子D 与生物大分子P 之间的相互作用满足下式:D +P k +k -D-P Complex (7)设在一定药物浓度范围内每个大分子上存在n 个等同且独立的药物结合位点,且D 与P 之间相互作用关系符合Langm uir 单分子吸附模型[14,15],当相互作用达到平衡状态时,则有K A =c D,b /c D,f (nc P,t -c D,b )(8)式中,K A 为D 与P 之间的表观结合常数,c D,b ,c D,f 及c P,t 分别为被结合药物、游离药物以及生物大分子总浓度(mol /L ),n 为每个大分子上存在的小分子结合位点数.假定D -P 复合物不发荧光,则体系中各物种之间有下列定量关系式:c D,b /nc P,t =(S 0-S )/S 0(9)c D,t =c D,b +c D,f(10)将式(9)及式(10)代入式(8),可得S 0/S =K A c D,t S 0/(S 0-S )-nK A c P,t(11)Fig .5 The c D ,t S 0/(S 0-S )vs .S 0/S curves of BC and BSA system a .S 0/S =8.66×104c D,t S 0/(S 0-S )-2.838,R 2=0.9963;b .S 0/S =8.72×104c D,t S 0/(S 0-S )-2.552,R 2=0.9985. 按照式(11)对实验数据进行处理,结果见图5,线性拟合得到方程,再由方程斜率和截距可得表观结合常数K A 和结合位点数n (表1).表1数据表明,BC 与BSA 之间具有较强的相互作用,BSA 分子上具有(3.1±0.2)个BC 的结合位点,故BC 能够被BSA 贮运.Tabl e 1 The apparent association constant (K A )andvalue of binding site (n )in BC -BSA systemt /℃K A /(L ・mol -1)n 308.66×104 3.3378.72×104 2.92.4 BC 与BSA 之间相互作用的热力学参数以及作用力类型在温度变化范围不大时,若将BC 与BSA 之间的作用过程的焓变 H 作为一个不随温度改变的常数,则可由式(12)～(14)得到BC 与BSA 结合过程的热力学参数 G , H 和 S ,结果列于表2.G =-RT ln K A(12) H =RT 1T 2ln[(K A )2/(K A )1]T 2-T 1(13)S =( H - G )/T (14)Tablet 2 Thermodynamic parameters of the BC -BSA binding procedure t /℃ H /(kJ ・mol -1) G /(kJ ・mol -1) S /(J ・mol -1・K -1)300.77-28.6497.06370.77-29.3297.06 表2中 H 的数值与 G 的相比,可以按照 H ≈0处理.可见,药物BC 与BSA 之间是以非化学键形式相互作用的,药物分子BC 与BSA 分子的扦插以及BSA 分子构象的自发应激改变,使原本固定于BSA 的疏水空腔内部的部分水分子得以释放,所以该作用过程是一个熵增加、Gibbs 自由能降低的自发超分子作用过程.根据热力学参数与作用力的关系[16]可知,BC 与BSA 之间以疏水相互作用为主.从BC 的分子结构(Scheme 1)可知,BC 与BSA 之间也存在静电作用,但从作用过程热力学函数变化量 H 对 G 的贡献较小的实验事实判断,静电作用不是主要的,疏水作用是主要的,BC 与BSA 之2102 高等学校化学学报V ol.25间的结合是熵驱动自发过程.参 考 文 献[1] XU Hong (徐 宏),DE NG Hong (邓 洪),HU Hong -Yu (胡红雨)et al .Chem .J .Chinese Universities (高等学校化学学报)[J ],2003,24(1):25—27[2] ZHAO Guang -Chao (赵广超),ZHU Jun -J i e (朱俊杰),CHEN Hon g -Yuan (陈洪渊).Chem .J .Chinese Universities (高等学校化学学报)[J],2003,24(3):414—418[3] Jiang C.Q.,Gao M .X.,M eng X.Z..Spectroch 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YANG Pin(杨 频),GAO Fei(高 飞).The Principl es of Bioinorganic Chem istry (生物无机化学原理)[M ],Perking:Scien cePress,2002[14] GAO Hong-W en(郜洪文),CHE N Yun-Sh eng(陈运生).Chem.J.Chinese U niversities(高等学校化学学报)[J ],2002,23(5):825—827[15] Zhu S.J.,Han Z.Y.,M ai L.L.et al ..J.Pharm.an d Biom edical Analysis[J],2002,30:151—159[16] Ross D.P.,Sabraman i an S..Biochem istry[J],1981,20:3096—3102Interaction Between Bovine Serum Albumin and Berberine C hlorideExtracted from Chinese Herbs of Coptis Chinen sis Fran chLIU Xue-Feng ,XIA Yong-Mei,FANG Yun *,LIU Ling-Ling,ZOU Lu(School of Chemical &M ater ial Engineer ing ,Southern Yangtz e U niver sity ,W ux i 214036,China )Abstract The interaction betw een bovine serum albumin (BSA )and berberine chloride (BC )ex tracted and purified from cop tis chinensis f ranch w as studied by using UV and fluorescence spectroscopy.The phe-nomenon that fluorescence spectra of BSA splitted and shifted from a simple peak to double peaks in the presence of BC w as ex plained ,and the double peaks responding to tyrosine and tryptophan residues respec-tively w as prospected.Fluorescence quenching was thoug ht to be deduced by com bining static quenching w ith nonradiative energy transfer.T he values of the apparent association constant(K A )at 30℃and 37℃are 8.66×104L ・mol -1and 8.72×104L ・mol -1respectively ,and the binding sites of BC molecules onBSA (n )are (3.1±0.2).The stereo-distance(r )between BC and fluorescent amino acid residues of the BSA is 3.75nm at 30℃and 3.62nm at 37℃,w hich affirms that part of BC segments have inserted into the hydrophobic pockets of BSA.Binding BC to BSA is a spontaneous supram olecular interaction in w hich entropy increases and Gibbs free energy decreases ,and the main driving force of the above interaction is hydrophobic force.Keywords Fluorescence spectroscopy ;Active component of Chinese herbs;Cop tis chinensis f ranch ;Berberine chloride ;Bovine serum albumin (Ed .:K ,G ,X )2103N o.11刘雪锋等:中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用 。
光谱法研究金霉素和土霉素与牛血清白蛋白的相互作用
图 1 金霉素和土霉素的结构式
本实验用荧光光谱和紫外 - 可见吸收光谱法研 究在模拟人体生理条件下 , 金霉素和土霉素与牛血
收稿日期 : 2008- 09- 20 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 20562009); 江西省自然科学基金资助项 目 ( 0620041) ; 中科 院长春应化 所电分析 化学重点实验室项目 ( SKLEAC2004- 3); 长江学者及创新团队项目 ( IRT0540) 作者简介 : 倪永年 ( 1946- ), 男 , 教授 , 博士生导师 E- ma i:l ynn@ i ncu. edu. cn
[ 2- 3]
N aC l的溶液中 , 配制成 3 . 0
m o l L 的储备液。将其溶液保存于 4 ! 以
-1
下 , 使用时 根据所 需进行 稀释。 缓冲溶 液为 0 . 05 m o l/L T ris- H C l ( pH = 7 . 4), 先配制 0 . 2 mo l L 的 T ris溶液 , 准确称取 2 . 422 3 g 三羟基甲氧基氨基 甲烷 ( T ris , 上海蓝季科技发展有限公司 ), 溶于二次 水再转入 100 mL 的容量瓶中, 取出其中 25 mL 后再 加入 45 m L 0 . 1m ol /L 盐酸溶液于 100 mL 的容量瓶 中加二次水进行定容。实验所用的 试剂均为分析 纯 , 实验用水为二次水。 1 2 实验方法 在比色皿中加 3 mL T ris- H C l缓冲溶液 ( p H= 7 . 4) , 加入 8 L BSA ( BSA - 金属离子 ) 溶液 , 采用 标准加入法分别加入金霉素和土霉素溶液 , 选择激 发和发射的狭缝宽度都为 15 nm, 激发波长 280 nm, 在 300~ 500 nm 范 围 内扫 描 BSA 的 荧光 光 谱及 BSA 在金霉素和土霉素作用下的荧光光谱 , 测其相 对荧光强度。在紫外 - 可见分光光度计上测金霉素 和土霉素的吸收光谱。
光谱法研究盐酸非那吡啶与牛血清白蛋白的结合作用
第27卷,第9期 光谱学与光谱分析Vol 127,No 19,pp1830218332007年9月 Spectroscopy and Spectral Analysis September ,2007 光谱法研究盐酸非那吡啶与牛血清白蛋白的结合作用周 宏1,陈昌云1,谢安建21.南京晓庄学院化学系,江苏南京 2100172.安徽大学化学化工学院,安徽合肥 230039摘 要 运用光谱学方法研究了在生理p H 值条件下盐酸非那吡啶(P H E )与牛血清白蛋白之间的结合作用。
通过荧光光谱和紫外吸收光谱确定了盐酸非那吡啶对牛血清白蛋白的荧光猝灭机理。
依据Scatchard 方程测定了不同温度下该结合反应的结合常数和结合位点数。
根据热力学方程讨论了两者间的主要作用力类型。
结合同步荧光光谱分析了盐酸非那吡啶对牛血清白蛋白构象的影响。
盐酸非那吡啶对牛血清白蛋白的荧光猝灭机制主要为静态猝灭和非辐射能量转移。
在15,25,37℃时盐酸非那吡啶与牛血清白蛋白的结合常数K b 分别为2147×107,9115×106,4136×106L ・mol -1,它们之间平均结合位点数n 为1。
结合反应的热力学参数为ΔH =-7112kJ ・mol -1,ΔS =12418J ・mol -1・K -1。
热力学函数计算结果表明,该作用过程是一个熵增加,G ibbs 自由能降低的自发分子间作用过程。
依据F rster 能量转移理论确定P H E 与BSA 间的结合距离为1161nm 。
两者结合的主要作用力类型是静电作用力。
盐酸非那吡啶在体内能够被血清蛋白存储和转运,但结合时对蛋白构象有一定影响。
关键词 盐酸非那吡啶;牛血清白蛋白;荧光光谱法;紫外吸收光谱法;结合作用中图分类号:O64113 文献标识码:A 文章编号:100020593(2007)0921830204 收稿日期:2007201206,修订日期:2007203219 基金项目:国家自然科学基金项目(20671001)和江苏省高校自然科学研究指导性项目(03K J D150118)资助 作者简介:周 宏,1957年生,南京晓庄学院化学系副教授 e 2mail :zhouhong @njxzc 1edu 1cn引 言 药物小分子与生物大分子的结合作用是当前生命科学领域中主要研究课题之一。
光谱法研究穿琥宁与牛血清白蛋白的相互作用
光谱法研究穿琥宁与牛血清白蛋白的相互作用刘里;成飞翔【摘要】穿琥宁(PDS)是一种药物,被广泛用于治疗病毒性肺炎,病毒性上呼吸道感染等的消炎药,被誉为“中药抗生素”.在优化的实验条件下,运用荧光和紫外光谱法,在不同的温度下研究穿琥宁与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用及共存金属离子的影响.用Stern-Volmer,Lineweaver-Burk和双对数方程计算了速率常数(Kq),表观猝灭常数(Ksv),结合常数(KA),静态荧光猝灭缔合常数(KLB)和结合位点数(n).结果表明:穿琥宁能结合BSA.由于生成PDS-BSA复合物,穿琥宁对BSA的猝灭是静态猝灭机理.热力学参数表明是一个自发过程,其作用力类型主要为静电作用力.至少一个结合位点.BSA的亚螺旋域ⅡA和ⅢA是主要结合位置,离酪氨酸残基更近,无药物协同作用.穿琥宁对BSA构象产生影响.Pb2+、Mn2、Ni2+和Cu2+对PDS与BSA结合产生竞争作用,增强药效.Cr3+对穿琥宁与BSA结合产生促进作用,延长药效时间.该研究结果对揭示药物动力学问题及新的抗病毒类中草药的研发提供了理论依据.%Dehydroandrograpolide Succinate (PDS) is a drug,widely used to treat viral pneumonia,viral upper respiratory tract infection such as anti-inflammatory drugs,known as the "Chinese medicineantibiotics".Herein,under the optimal conditions,fluorescence and absorption spectroscopies were used to study the interaction of PDS with bovine serum albumin (BSA) and the effects of metal ions at different temperatures.The rate constant (Kq),apparent quenching constant (Ksv),binding constant (KA) and static fluorescence quenching association constant (KLB) and binding site number(n) were calculated using Stern-Volmer,Lineweaver-Burk and Double logarithm equations.The results showthat PDS is able to bind to BSA.The probable quenching mechanism of BSA by PDS was mainly static due to the formation of a PDS-BSA complex.The results of thermodynamic parameters indicate that electrostatic force plays the main role in the binding process and the binding process is spontaneous.The obtained data for binding sites of n approximately equal to 1 indicates that there is a single class of binding site for the BSA with PDS.The primary binding site for PDS is located at sub-domain ⅡA and Ⅲ A of BSA and near by tyrosine residue.There is almost no cooperative effect.The results obtain from synchronous fluorescence showed that the interaction between BSA and PDS causes the conformational changes of BSA.Pb2+,Mn2+,Ni2+and Cu2+ compete with the interaction of PDS with BSA,increasing medical effectiveness.Cr3+ promoted on interaction and prolonged drug effect time.The obtained results provided a theoretical basis for revealing the pharmacokinetics and further research on development of new anti virus herbs drugs.【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(054)002【总页数】6页(P351-356)【关键词】穿琥宁;相互作用;金属离子【作者】刘里;成飞翔【作者单位】曲靖师范学院化学与环境科学学院,曲靖655011;曲靖师范学院云贵高原化学功能材料与污染治理研究中心,曲靖655011【正文语种】中文【中图分类】R961;R285.5;O657.31随着药代动力学和临床药理学的蓬勃发展，人们对药物与蛋白质结合对药代动力学的影响，有了更好的认识.由于对药物与血清白蛋白的相互作用不仅能表明药物在体内运输和新陈代谢过程，而且也能揭示机理、药物毒性以及药代动力学.因此，研究药物与血清白蛋白的相互作用显得尤其重要[1-3].研究穿琥宁(简称PDS)，是爵床科植物穿心莲提取物—穿心莲内酯经酯化、脱水、成盐而制成的精制脱水穿心莲内酯琥珀酸半脂单钾盐，是用于治疗病毒性肺炎，病毒性上呼吸道感染等的消炎药，被誉为“中药抗生素”[2].国内外的研究都是对其进行疗效的分析[1]，至今还没有用光谱法研究PDS与BSA的结合特征的报道.本文优化了体系的实验条件，探讨了PDS与BSA的相互作用机理，测定了三个温度下的结合位点数，热力学常数，分析了PDS与BSA结合对蛋白质构象的影响，金属离子的影响，药物的协同作用，结合力类型以及结合位置等.这些研究对于阐明PDS在机体内的传输、代谢过程及药理作用具有有益的参考意义.上海虹益仪器仪表有限公司pHS-3C型精密酸度计;上海一恒科技有限公司HWS12型超级恒温水浴;日本日立公司F-4600型荧光光谱仪;美国瓦里安技术中国有限公司Cary 50型紫外-可见光谱仪.穿琥宁：江莱化学科技(上海)有限公司，含量：99%；牛血清白蛋白：上海楷样生物技术有限公司，含量： 99%.其它试剂都为分析纯，实验用水为超纯水.依次加入不同浓度的PDS溶液(0、0.52575、1.0515、1.5773、2.1030、2.6288、3.1545、3.6803、4.2060、4.7318、5.2575、5.7833)×10-4mol·L-1(编号依次为1～12)，BS A(1×10-7mol/L)，NaCl溶液(0.1 mol/L)，pH=7.4的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)溶液(0.015 mol/L)于10 mL比色管中，定容.在296 K、311 K、326 K温度下孵育180 min后，以280 nm为激发波长，扫描发射光谱.记录空白溶液的荧光强度为F0和样品溶液的荧光强度为F，ΔF=F0-F.测定浓度比为1∶1的BSA与PDS溶液的紫外吸收光谱.在PDS-BSA体系中加入金属离子(1×10-4mol/L-1)，测其荧光光谱.由于BSA分子中存在着酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)等能够发射荧光的芳香性氨基酸残基，所以它是一种典型的内源荧光物[3].其最大激发和发射波长(λex/λem)位于280 nm/340 nm处.从图1可知，当280 nm激发时，有2个发射峰在340 nm和439 nm.随着PDS浓度的增加，340 nm处峰高逐渐降低，λem=439 nm处，荧光强度增加，说明PDS对BSA的荧光有明显的猝灭作用.荧光猝灭机理通常可分为动态猝灭和静态猝灭[4].在静态猝灭中，生成了新物质，起主要作用的是新物质的稳定性，温度越高，稳定性越差，表观猝灭常数Ksv越小[5].在动态猝灭中，因为分子扩散起主导，Ksv会随着温度的升高而增大.PDS-BSA猝灭过程遵循Stern-Volmer方程[6]：F0/F=1+Kqτ0[PDS]=1+Ksv [PDS]，式中[PDS]为PDS浓度，Kq为速率常数，动态猝灭时，其最大值为2.0×1010L/(mol·s)；τ0为荧光寿命，10-8s数量级左右[4-6].在296 K、311 K、326 K时作Stern-Volmer方程(表1)，三个温度下的Kq值比2.0×1010大1个数量级，与动态猝灭机理相违背.Ksv随温度的升高反而降低，这一现象与静态猝灭机理吻合.静态猝灭过程，遵循Lineweaver-Burk双倒数方其中：KLB为静态荧光猝灭缔合常数.用(F0-F)-1对 [PDS] -1作不同温度下的Lineweaver-Burk曲线计算KLB值列于表2中. KLB在103数量级左右，表明PDS与BSA形成的复合物稳定性较好.随着温度的升高，KLB降低，表明高温时复合物稳定性变差.另一种推断猝灭机理的重要方法是紫外吸收光谱法[8].在实验条件下，测定了PDS 溶液和PDS与BSA等摩尔混合物的吸收光谱图(图7).曲线1表明PDS在255 nm处有一吸收峰，曲线2(BSA)和曲线3(PDS和BSA混合液)在278 nm处有一吸收峰，对比曲线4(曲线1与曲线2相加)和曲线3可发现两曲线明显不重合，表明推断PDS与BSA静态猝灭机理是合理的.PDS与BSA的结合常数KA以及结合位点数n双对数方程[7] lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[PDS][8].由lg[(F0-F)/F]对lg[PDS]作图，由直线截距可得结合常数KA，斜率可求n，计算结果见表3.3.5 作用力类型根据热力学公式ΔG=ΔH-TΔS=-RTln K 和ln(K2/K1)=(1/T1-1/T2) ΔH/R [8-10]计算296 K、311 K、329 K温度下PDS与BSA结合反应的吉布斯自由能变ΔG，焓变ΔH及熵变ΔS (表4).由表4可得，ΔG<0，ΔH<0且ΔS>0，表明BSA与PDS的结合是自发进行的放热反应，主要作用力为静电作用力.药物的协同作用常用Hill方程[8]进行分析：E=(F0-F)/F0，1/E对1/[PDS]作图，截距为1/Em， lg E(Em-E) =lgK+nHlg[PDS]，式中，nH为Hill系数;K为结合常数;E为饱和分数.由表2可知，各温度下的nH值约等于1，表明PDS与BSA结合时无药物协同作用，即PDS结合到BSA位点上后，对后继药物分子与蛋白质的结合无影响.同步荧光光谱法是分析药物小分子对影响蛋白质的构象的常用方法，在Δλ=15nm(显示Tyr特征)和Δλ=60 nm(显示Trp特征)[8]条件下绘制PDS-BSA体系的同步荧光光谱(图8).由图可知，随PDS浓度的增大，λem发生移动，Tyr和Trp的荧光强度逐渐降低.酪氨酸残基的猝灭程度大于色氨酸残基，表明PDS与BSA相结合的位点偏向于酪氨酸.3.8 结合位置的确定亚螺旋域IIA(含有Tyr和Trp)或IIIA(含有Tyr)是大多数药物在BSA上结合位置[11-13].比较激发波长为280、295 nm时PDS-BSA体系荧光程度的变化便可知道.由图9可知，λex=280 nm 和λex=295 nm 的PDS-BSA光谱曲线交叉，表明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中，结合位置在BSA的亚螺旋域ⅡA和ⅢA中.人体血液内往往同时存在几种甚至十几种金属元素，这些金属离子必然会影响到药物分子与蛋白质的相互作用[7]，因而研究金属离子对药物分子与生物体的相互作用的影响有着十分重要意义.本文研究了Pb2+、Mn2+、Cr3+、Ni2+和Cu2+五种金属离子存在下，对PDS与BSA的结合作用的影响，结果见表3，从表中可以看出Pb2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+的结合常数KA′和结合位点数n，比原先PDS-BSA体系的KA和n减小很多.其中Mn2+加入后KA′和n降低程度最大.说明这四种金属离子对PDS与BSA结合产生了竞争作用.可能是金属离子与BSA先结合，占据了BSA的结合位点，从而抑制了BSA与药物的结合作用 [8]，缩短了PDS在血液中的停留时间，增强了药效.Cr3+的加入与其它四种离子所产生的效果相反，增加了原本的KA和n值.表明Cr3+的加入增大了药物的作用强度，有效地提高了短期药效.应用紫外和荧光光谱法研究推断出PDS与BSA的相互作用是静态猝灭过程，两者通过静电作用力相互作用，因有1-2个结合位点，药物能被蛋白质转运和储存；几乎没有的药物协同作用，结合位置在BSA的亚螺旋域ⅡA和ⅢA中，靠近酪氨酸残基，PDS与BSA相互作用对BSA构象产生影响.Pb2+、Mn2+、Ni2+和Cu2+参与PDS与BSA相互作用，增强药效.Cr3+的参与，会延长药效时间，这些重要信息为抗病毒中草药的研发提供了理论依据.。
阿霉素与牛血清白蛋白结合作用的研究
维普资讯
２Ｏ Ｏ ２年第 ６ ｏ卷 第 １ Ｏ期 ，１６ ８７～１７ ８１
化 学 学 报
＾ Ａ ＣＴ ＣＨＩ ＣＡ Ｉ ＣＡ ＭＩ Ｓ Ｎｌ
Ｖｏ ．６ １ ｏ．
Ｎｏ １ ． ０． １ ６ ８ ７— １ ７１ ８
阿 霉 素 与 牛 血 清 白 蛋 白 结 合 作 用 的 研 究
ｈ ｕ ｂ ｒｏ ｉ ｄ ｎ ｉ ｎ ｗ ｒ ｍｅ ｓ ｒｄ ａ ｉ ｅ ｔｐ ｂ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｎ ｈ ｎ ｔ ｄ．Ｔ ｅ ｂ ｎ ｉｇ ｔ ｅ ｎ ｍ ｅ ｆｂ ｎ ｉ ｇ ｓ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ｔｄｆ ｒ ｎ Ｈ ｙ ｆ ｏ ｅｃ ｎ ｅ ｑ ｅ ｃ ｉｇ ｍｅ ｏ ｔ ｓ ｅ ｅ ｌ ｕ ｈ ｈ ｉｄ ｎ
黄 波 。 邹 国林 ， 。 杨 天鸣
（ 武 汉大学生命 科学学 院 ｎ （ 中南 民族 大学化学 系 摘要
武汉 ４（ ２ ３ ￣７ ） 武汉 ４ （ ４ ３ ￣７ ）
结 合荧光 光谱和 吸收光谱研究 了阿霉素 与牛血 清 白蛋 白问 的结合 作用 ， 定 了阿霉 素对牛 血清 白蛋 白的荧 确
光猝 灭过程 的猝 灭机理 ． 测定 了不同酸度 条件下该结 合反应 的结 合常 数 、 结合位 点 数 ， 据能 量转 移理论 确 定 了药 依 物 和蛋 白间的结 合距离 ． 通过 比较阿霉 素和去糖 基阿霉素 与牛血清 白蛋 白的相 互作用 ， 结合 阿霉素对蛋 白构象 的影 响， 讨论 了药物 与蛋 白的结合模 式 ． 关 键词 阿霉 素 ， 去糖基 阿霉 素 ， 牛血清 白蛋 白， 荧ｔ Ｔ ｅ ｉｄｎ ｒａ ｔ ｎ ｅｗｅ ｎ ｄｉｍｙ ｉ （ ｓｒ ｃ ｈ ｂｎ ｉｇ ｅｃｉ ｂ ｔ ｅ ａ ｒ ｃｎ ＡＤＲ） ａ ｄ ｏｉｅ ｅｕ ｏ ａ ｎ ｂ ｖｎ ｓｒｍ ａｂ ｍ ｎ （Ｂ Ａ） ｗ ｓ ｌｕ ｉ Ｓ ａ
光谱法研究尼美舒利与牛血清白蛋白的相互作用
光谱法研究尼美舒利与牛血清白蛋白的相互作用刘里;成飞翔【摘要】利用荧光、同步荧光和紫外可见光谱来研究牛尼美舒利(Nime)与血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果表明:Nime能猝灭BSA的荧光,遵循静态猝灭过程.通过分析同步荧光光谱可知,Nime改变了BSA的二级结构,使BSA腔内疏水环境的极性减弱.BSA的亚螺旋域ⅡA是主要结合位置,离酪氨酸残基更近,有微弱的药物负协同作用.BSA能运输Nime,是一个自发过程,其作用力类型主要为静电作用力.结合位置实验表明Nime与BSA的结合主要发生在亚螺旋域ⅡA.有微弱的药物负协同作用.对于Nime,有一个结合位点.焓为负值,熵为正值,表明在结合过程中静电作用力起了主要作用.另外,它是一个自发放热过程.我们的研究结果可能对尼美舒利的临床研究和疗效具有参考价值.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(039)002【总页数】6页(P50-55)【关键词】尼美舒利;荧光猝灭;相互作用【作者】刘里;成飞翔【作者单位】曲靖师范学院化学化工学院,云南曲靖655011;曲靖师范学院化学化工学院,云南曲靖655011【正文语种】中文【中图分类】O657.3尼美舒利（Nime）是一种非甾体抗炎药，因抗炎、解热镇痛作用比对乙酰氨基酚和布洛芬起效更快，而且几乎全部通过尿液排泄，即使多次服用也不会出现积累现象［1］，所以被一致认为一个具有良好发展前途的药物［2］.目前已在50多个国家使用，其市场规模超过10亿美元.但该药对中枢神经和肝脏造成损伤的案例时常出现，因此被禁止用于12岁以下儿童.牛血清白蛋白（简称BSA）因价格低廉，在分子结构和氨基酸序列上与人血清白蛋白极其相似，被广泛地用于与药物相互作用的研究［3］.至今还未见光谱法研究Nime与BSA的结合特征的报道.本文优化了体系的实验条件，探讨了Nime与BSA的相互作用机理，测定了3个温度下的结合位点数、热力学常数，分析了Nime与BSA结合对蛋白质构象的影响、体内常见共存物质的影响、药物的协同作用、作用力类型以及结合位置等.这些研究为临床上尼美舒利的用药安全提供理论依据.1.1 仪器与试剂上海虹益仪器仪表有限公司pHS-3C型精密酸度计，上海一恒科技有限公司HWS12型超级恒温水浴，日本日立公司F-4600型荧光光谱仪，美国瓦里安技术中国有限公司Cary 50型紫外-可见光谱仪.牛血清白蛋白（98%，上海楷样生物技术有限公司），尼美舒利（99%，百灵威科技有限公司），其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水.1.2 试验方法依次加入 Nime溶液（0、3.243、4.865、6.486、8.108、9.729、11.351、12.972、14.594、16.215、17.837、19.458、21.079 5）×10-5mol·L-（1编号依次为1～13），1.0×10-5mol·L-1的BSA 1.5 mL，0.5 mol·L-1NaCl溶液2.0 mL和0.1 mol·L-1pH=7.4的缓冲溶液1.5 mL，于10.0 mL比色管中，定容摇匀，分别在291.6 K、301.6 K、311.6 K温度下，孵育40 min后扫描荧光光谱和同步荧光光谱.记录不含Nime的空白溶液的荧光强度为F0和含有Nime溶液的荧光强度为F.按照上述方法扫描Nime-BSA体系的吸收光谱.2.1 反应条件的影响2.1.1 缓冲溶液缓冲溶液的选择不同，对Nime与BSA相互作用的影响不大（图1）.其中，Tris-HCl缓冲溶液效果对其相互作用最佳.2.1.2 pH值在Tris-HCl缓冲范围内，体系的F0/F随溶液pH值变化而改变（图2A）.pH=7.4时，达到最佳.由图2B可知，Tris-HCl用量为1.5 ml时，ΔF达到最大值.最终确定pH=7.4，0.015 mol·L-1Tris-HCl作为Nime与BSA相互作用的缓冲溶液.2.1.3 BSA的浓度固定其它实验条件，改变BSA的浓度，测定BSA溶液分别为：1.5×10-6mol·L-1至1.5×10-5mol·L-1时对体系的荧光强度的影响（图3）.7.5×10-6mol·L-1BSA 作为反应的浓度最佳.2.1.4 试剂加入顺序图4是不同的加入顺序对Nime与BSA相互作用的影响.加入顺序影响Nime与BSA结合，Nime→BSA→NaCl→Tris-HCl的加入顺序最佳.2.1.5 孵育时间考察225 min内孵育时间对体系的影响（图5）.实验表明，Nime与BSA的相互作用在299.6 K温度下需要25 min才能完成并稳定.2.2 荧光光谱由于BSA分子中存在着酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等能够发射荧光的芳香性氨基酸残基，所以它是一种典型的内源荧光物［3］.其最大激发和发射波长（λex/λem）位于280 nm/340 nm处.从图6可知，随着Nime浓度的增加，λem（移到344 nm）处BSA的荧光强度逐渐降低，说明Nime对BSA的荧光有明显的猝灭作用.2.3 猝灭机理荧光猝灭机理通常可分为动态猝灭和静态猝灭［3-5］.在静态猝灭中，生成了新物质，起主要作用的是新物质的稳定性，温度越高，稳定性越差，Ksv越小［3-5］.在动态猝灭中Ksv会随着温度的升高而增大，因为分子扩散起主导.猝灭过程遵循Stern-Volmer方程［3-5］：F0/F=1+Kqt［0Nime］=1+Ksv［Nime］，式中［Nime］为Nime浓度，Kq为速率常数；t0为荧光寿命，10-8s数量级左右［3-5］.在291.6 K，301.6 K，311.6 K时作Stern-Volmer方程（表1），3个温度下的Kq值比最大动态猝灭速率常数2.0×1010L·mol-1·s-1）［3-5］大2个数量级，与动态猝灭机理相违背.由图7可知，随着温度的升高，直线斜率即Ksv降低，与静态猝灭机理吻合.Lineweaver-Burk双倒数方程［6-8］：（F0-F）-1=F0-1+（KLBF［0Nime］）-1，其中：KLB常用来分析静态猝灭过程.用（F0-F）-1对［Nime］-1作不同温度下的L-B曲线（图8），计算KLB值列于表1中，KLB值都在104数量级以上，表明Nime与BSA形成的复合物稳定性较好.随着温度的升高，KLB略有下降，这与因静态猝灭方式而形成的复合物随温度升高而越不稳定的作用机理正好相符合. 另一种推断猝灭机理的重要方法是紫外吸收光谱法［4-6］，由图9的紫外吸收光谱可知，Nime-BSA体系的吸收峰从280 nm蓝移到265 nm，吸收峰的强度也增加了，表明推断Nime与BSA静态猝灭机理是合理的.2.4 结合常数Kb和结合位点数n尼美舒利与BSA的结合常数Kb以及结合位点数n双对数方程［6-8］lg［（F0-F）/F］=lgKA+nlg［Nime］［6-8］.由lg［（F0-F）/F］对lg［Nime］作图，由直线截距可得结合常数Kb，斜率可求n（表1）.n值接近于1，表明尼美舒利与BSA可形成1个结合位点.Kb为106数量级，表明Nime与BSA之间有很强的结合作用.当温度由291.6 K到301.6 K时，Kb变化不大；但当温度升高到311.6 K 时，Kb值减少1个数量级，表明尼美舒利与BSA的相互作用对温度变化比较敏感，高温不利于血清白蛋白在体内运转、贮存和分配尼美舒利.2.5 作用力类型根据热力学公式ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK和ln（K2/K1）=（1/T1-1/T2）ΔH/R ［8-10］计算291.6 K，301.6 K，311.6 K温度下Nime与BSA结合反应的吉布斯自由能变ΔG，焓变ΔH及熵变ΔS（表2）.由表2可得，ΔG＜0，ΔH＜0且ΔS＞0，表明BSA与Nime的结合是自发进行的放热反应，主要作用力为静电作用力.2.6 结合位置的确定亚螺旋域IIA（含有酪氨酸和色氨酸）或IIIA（含有酪氨酸）是大多数药物在BSA 上结合位置［11-13］.比较激发波长为280 nm、295 nm时Nime-BSA体系荧光程度的变化便可知道.由图10可知，λex=280 nm，295 nm的Nime-BSA光谱曲线平行，表明色氨酸和酪氨酸残基都参与其中；λex=280 nm激发曲线比λex=295 nm的降低程度更大，表明亚螺旋域ⅡA是主要结合位置［8-10］. 2.7 药物协同作用药物的协同作用常用Hill方程［11-13］进行分析：E=（F0-F）/F0，1/E对1［/Nime］作图，截距为1/Em，lgE（Em-E）=lgK+nHlg［Nime］，式中，nH 为Hill系数，K为结合常数，E为饱和分数.由表2可知，各温度下的nH值略小于1，表明Nime与BSA结合时有微弱的药物负协同作用，即Nime分子结合到BSA位点上后，对后继药物分子与蛋白质的结合有微弱的阻碍作用.这种负协同作用可能是由于药物分子结构决定的，Nime浓度的加大，导致后续Nime对BSA 的亲和性减弱.随着温度的升高，nH值变化很小，表明Nime的药物协同作用对温度的改变不敏感.2.8 Nime对BSA构象的影响同步荧光光谱法是分析药物小分子对影响蛋白质的构象的常用方法，在Δλ=15nm（显示酪氨酸特征）和Δλ=60 nm（显示色氨酸特征）［6-8］条件下绘制Nime-BSA体系的同步荧光光谱（图11）.由图可知，随Nime浓度的增大，λem 发生红移，酪氨酸和色氨酸的荧光强度逐渐降低，表明BSA腔内疏水环境的极性增强，疏水性减弱.酪氨酸残基的猝灭程度大于色氨酸残基，表明Nime与BSA相结合的位点偏向于酪氨酸.2.9 共存物的影响实验中对常见金属离子、有机物和糖类等共存物质对Nime与BSA相互作用的影响，结果列于3中.从表3中可以看出，当相对误差≤±5.0%，Nime浓度为3.243×10-5mol·L-1时，K+、NH4+、Na+、Zn2+、Ba2+、NO3-、Cl-、SO42-、糖类和有机物等几乎不影响Nime对BSA的作用强度，但是Fe3+和Cu2+等对体系的干扰较大，可通过加入EDTA和硫脲将其掩蔽.因此，BSA可作为荧光探针对Nime的含量进行测定，这一方法具有良好的选择性.应用紫外和荧光光谱法研究推断出尼美舒利与BSA的相互作用是静态猝灭过程，两者通过静电作用力相互作用，因有1个结合位点，药物能被蛋白质转运和储存；有微弱的药物负协同作用，结合位置在BSA的亚螺旋域ⅡA中，靠近酪氨酸残基，Nime与BSA相互作用对BSA构象产生影响.探究了常见金属离子、有机物和糖类等共存物质对Nime与BSA相互作用的影响，其中Fe3+和Cu2+对其相互作用影响较大.BSA可作为荧光探针对Nime进行含量测定.这些重要信息对尼美舒利的临床研究具有参考价值，并为后续非甾体抗炎药的研发提供了理论依据.［1］岑彦艳，覃容欣，李小丽，等.尼美舒利解热镇痛抗炎作用比较研究［J］.中国现代应用药学，2014，31（8）：933-934.［2］陈沫，卢永翎，杭太俊，等.尼美舒利分散片在健康人体内的药代动力学及生物等效性的LC-MS/MS研究尼美舒利分散片制备的处方工艺优选［J］.药物分析杂志，2013，33（1）：30-32.［3］ BOGDAM S.Fluorescence study of sinapic acid interaction with bovine serum albumin and egg albumin［J］.J flurescence，2003，13（4）：349-356.［4］ LAKOWICZ J R.Principles of fluorescence spectroscopy［M］.3rd ed.New York：Springer Press，2006：285-292.［5］许金钩，王尊本.荧光分析法［M］.3版.北京：科学出版社，2006：23-49. ［6］刘里，成飞翔.光谱法研究头孢替唑钠与牛血清白蛋白相互作用［J］.江西师范大学学报（自然科学版），2014，38（6）：639-644.［7］刘里，成飞翔.光谱法研究洛索洛芬钠与牛血清白蛋白的相互作用及共存金属离子的影响［J］.中国生化药物杂志，2014，35（1）：21-24.［8］刘保生，杨超，王晶.硫酸头孢匹罗与牛血清白蛋白结合反应的发光机理［J］.发光学报，2011，32（3）：293-299.［9］ CYRIL L，EARL J K，SPERRY W M.Biochemists handbook［M］.London：Epon Led Press，1961：84-96.［10］ROSS D P，SUBRAMANTAN S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20（11）：3 096-3 102.［11］SULKOWSKA A，MACIAZEK-JURCZYK M，BOJKO B，etpetitive binding of phenylbutazone and colchicine to serum albumin in multidrug therapy：a spectroscopic study［J］.Journal of molecular structure，2008，881（1）：97-106.［12］MACIAZEK-JURCZYK M，SULKOWSKA A，BOJKO B，etal.Fluorescence analysis of competition of phenylbutazone and methotrexate in binding to serum albumin in combination treatment in rheumatology［J］.Journal of molecular structure，2009，919（1）：334-338.［13］XU H，GAO S L，LÜ J B，et al.Spectroscopic investigations on the mechanism of interaction of crystal violet with bovine serum albumin ［J］.Journal of molecular structure，2009，919（1）：334-338.。
番泻苷A与牛血清白蛋白相互作用的研究
４５３ ０４２，相对标准偏差（ＲＳＤ）为２ ４６％，结果表明，对照品溶液室温放置６ｈ稳定性良好。
２ １ ０罗氟司特中溴甲基环丙烷的测定 按照“２ ２ ３”和“２ ２ ４”的方法配制对照品溶液和３批供试品溶液，按“２ １”项下色谱条件进行测定，３批样品均未检出起始原料溴甲基环丙烷。
３ 讨论３ １ 顶空瓶加热温度的选择 溴甲基环丙烷的沸点为１０５℃。
本实验在筛选顶空瓶加热温度过程中发现，温度高于１１０℃时溴甲基环丙烷易受热分解，影响样品中起始原料残留量的准确测定；温度低于９０℃时，挥发量尚未达到平衡，经综合考量，选择９０℃作为顶空瓶的加热温度。
３ ２ 限度的选择 溴甲基环丙烷尚未被国际癌症研究中心（ＩＡＲＣ）鉴别为可能的人类致癌物，参考ＩＣＨＱ３Ｃ残留溶剂的指导原则和中国药典２０１５年版四部通则０８６１残留溶剂测定法的规定，将它的限度设定为０ ５％。
本研究建立了顶空气相色谱法测定罗氟司特中溴甲基环丙烷残留量的方法，并对３批样品进行了检测，均未检出。
经方法学研究证实，该方法简便易行、灵敏度高、结果准确、重复性好，能够有效检测罗氟司特原料中溴甲基环丙烷的残留量，可为罗氟司特的质量控制提供参考依据，实用性强。
参考文献〔１〕ＰｏｒｐｏｄｉｓＫ，ＤｏｍｖｒｉＫ Ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔａｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ ４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｎｄｕｃｅｓｐｈａｇｏｃｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎＧｒｅｅｋＣＯＰＤｐａｔｉｅｎｔｓ〔Ｊ〕 ＩｎｔＪＣｈｒｏｎＯｂ ｓｔｒｕｃｔＰｕｌｍｏｎＤｉｓ，２０１５，１５（１０）：１１２３ １１２８〔２〕ＬｅｅＱ，ＭｏｃａｒｓｋｉＭ ＢｅｎｅｆｉｔｓｏｆｅａｒｌｙｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔｔｒｅａｔｍｅｎｔａｆｔｅｒｈｏｓｐｉｔａｌｏｒｅｍｅｒｇｅｎｃｙｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｄｉｓｃｈａｒｇｅｆｏｒａＣＯＰＤｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ〔Ｊ〕 ＡｍＨｅａｌｔｈＤｒｕｇＢｅｎｅｆｉｔｓ，２０１６，９（３）：１４０ １５０〔３〕汤仲明 ２０１１年美国ＦＤＡ批准药物简介〔Ｊ〕 国际药学研究杂志，２０１２，３９（１）：７１ ８５〔４〕张含康 罗氟司特及其杂质的合成工艺研究〔Ｄ〕 天津大学，２０１５〔５〕杨展雄，孙焕亮，蔡开明 罗氟司特的合成路线图解〔Ｊ〕 华西药学杂志，２０１４，２９（２）：２２２ ２２３ 〔６〕钟永刚，陈国华，李昂，等 罗氟司特的合成〔Ｊ〕 中国医药工业杂质，２０１１，４２（１２）：８８４ ８８６〔７〕美国ＩＣＨ指导委员会 药品注册的国际技术要求〔Ｍ〕 北京：中国医药科技出版社，２０１２〔８〕国家药典委员会编 中国药典２０１５年版四部〔Ｓ〕 北京：中国医药科技出版社，２０１５〔９〕张秉华，王小亮，郭欢迎，等 顶空毛细管气相色谱法测定美司钠原料和注射液的残留溶剂〔Ｊ〕 西北药学杂志，２０１９，３４（１）：３９ ４３〔１０〕吕丹，唐克慧，王宇弛，等 顶空毛细管气相色谱法同时测定磷酸特地唑胺原料药中４种有机溶剂的残留量〔Ｊ〕 中国抗生素杂志，２０１９，４４（１）：１０１ １０５〔１１〕王宇 ＧＣ测定舒巴坦匹酯原料药中６种残留溶剂〔Ｊ〕 海峡药学，２０１９，３１（６）：５５ ５７〔１２〕张海波，李景辉，李杨 顶空气相色谱法测定他达拉非原料中有机溶剂残留量〔Ｊ〕 海峡药学，２０１９，３１（９）：８７ ８９ 番泻苷Ａ与牛血清白蛋白相互作用的研究王 健１，陈圣典２，王甜叶２，陈俭娇２，黄小权２，韩茹霞２，符 玲２（１ 河南省食品药品检验所，河南郑州４５００１８；２ 郑州大学药学院，河南郑州４５０００１）摘要：目的 研究番泻苷Ａ与牛血清白蛋白之间的相互作用，进一步了解该成分在体内的吸收、转运和分布等过程。
盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究
盐酸土霉素与牛血清白蛋白的相互作用研究崔艳;陈建秋;严拯宇【期刊名称】《光谱实验室》【年(卷),期】2010(027)003【摘要】采用同步荧光和紫外吸收光谱法,研究了在pH 7.40的Tris-HCI缓冲体系下,盐酸土霉素(Oxytetracycline HCI)与牛血清白蛋白的相互作用,研究表明在正常生理条件下盐酸土霉素对牛血清白蛋白有较强的猝灭作用,根据不同的药物浓度、温度及紫外吸收光谱的变化,判断其猝灭方式可能为静态猝灭,同时考察了不同离子存在条件下盐酸土霉素对BSA荧光猝灭的影响.得出在不同温度下反应的结合常数KD分别为4.167×10-5mol·L-1(25℃)、3.6×10-3mol·L-1(37℃),盐酸土霉素与BSA按1:1的比例结合;根据反应热力学参数确定了它们之间相互作用的主要形式为疏水作用力;采用同步荧光考察了盐酸土霉素对BSA构象的影响,发现随药物浓度的增大,色氨酸残基的最大发射波长不变,而酪氨酸残基所处环境的疏水性改变,从而导致BSA的构象发生了变化.【总页数】6页(P1064-1069)【作者】崔艳;陈建秋;严拯宇【作者单位】中国药科大学分析化学教研室,南京市童家巷24号,210009;中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室,南京市,210009;中国药科大学分析化学教研室,南京市童家巷24号,210009【正文语种】中文【中图分类】O657.32【相关文献】1.番泻苷A与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 王健;陈圣典;王甜叶;陈俭娇;黄小权;韩茹霞;符玲2.亚甲基蓝及其代谢产物与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 赵刚;杨丹;何茜;黄曦瑶;罗勇3.光谱法与计算机模拟法研究六溴环十二烷与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 庹浔;宋继敏;付豪;吕小兰4.丹酚酸B与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究 [J], 张传英;彭鑫;饶恒军;齐崴;苏荣欣;何志敏5.多光谱法和分子对接模拟法研究黄腐植酸和牛血清白蛋白的相互作用 [J], 王晓霞;吴昊;聂智华;马力通;崔金龙;赛华征;成建国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
反相高效液相色谱法检测血浆及肝脏组织中表阿霉素浓度
反相高效液相色谱法检测血浆及肝脏组织中表阿霉素浓度摘要】目的建立运用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定表阿霉素（Epirubicin，Epi）在大鼠血浆和肝脏组织中的浓度的方法。
方法通过外周静脉注射表阿霉素后，取大鼠血浆及肝脏组织，经蛋白沉淀，有机相萃取，氮气吹干，流动相复溶等处理后，运用反相高效液相色谱法（RP-HPLC），检测表阿霉素的药物浓度，结果血浆中最小检测限为5ng/ml，在5～1000ng浓度范围内线性良好。
肝脏中最小检测限为25ng/ml，在25～2000ng浓度范围内线性良好。
结论建立了检测血浆、肝脏组织内表阿霉素（EPI）药物浓度的反相高效液相色谱荧光检测方法(RP-HPLC)。
该方法具有灵敏度高、操作简单，稳定性好的特点。
【关键词】反相高效液相色谱法表阿霉素肝脏组织血浆【中图分类号】R446.8 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）18-0043-02近年来，针对肝脏肿瘤的局部区域性化疗方法发展很快，如肝动脉介入化疗，门静脉化疗等。
表阿霉素是目前普遍使用的一种化疗药物。
本研究旨在建立一种能够准确检测肝组织及血浆中表阿霉素浓度的方法。
1.材料与方法1.1实验动物健康成年SD大鼠30只,雌雄不拘，体重300～350g。
主要试剂：表阿霉素（Epirubincin，EPI）标准品（≥98.5%，100mg，）中国药品生物制品检定所；柔红霉素（Daunorubicin，DAM,DNR）标准品，（≥91%，50mg）中国药品生物制品检定所。
主要仪器：HP1100型高效液相色谱仪：美国惠普公司；HPLC色谱柱（C18，5μm，250×4.6mm）：美国DIKMA公司；岛津FR-10AXL荧光检测器：美国惠普公司；N2000色谱工作站：美国惠普公司。
1.2方法1.2.1色谱条件HPLC不锈钢色谱柱（C18，5μm，250×4.6mm）；流动相配置：超纯水：0.1mol/L磷酸：三乙胺：乙腈（70：3：0.07：27，v/v），水相与乙腈混和前用6M HCL调节PH值至2.8；流速设定为1.5ml/min柱温：25℃；荧光检测波长：激发光λex＝474nm；吸收光λem＝551nm；内标物质：柔红霉素（Daunorubicin，DAM）；标本进样量：50μl。
马来酸氯苯那敏与牛血清白蛋白相互作用的光谱法研究
马来酸氯苯那敏与牛血清白蛋白相互作用的光谱法研究YANG Yu-ying;DONG Ru;JIA Qin;REN Chun-yan;LIU Chun-ye【摘要】利用荧光光谱分析法以及紫外光谱法研究了生理pH条件下马来酸氯苯那敏(CPM)与牛血清白蛋白(BSA)在不同温度下的相互作用.得到37℃和25℃时BSA与CPM之间的结合位点数(n)、结合常数(K)、热力学函数及结合距离.结果表明,CPM-BSA之间有一个作用点,且K随着温度的升高而增大,37℃值约是25℃值的65倍.由热力学参数可知两者之间主要以疏水作用力进行相互作用.根据F?ster能量转移理论,得到BSA-CPM以5.638 nm的距离进行结合.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2019(047)012【总页数】4页(P104-106,148)【关键词】马来酸氯苯那敏;牛血清白蛋白;紫外光谱法;荧光光谱法【作者】YANG Yu-ying;DONG Ru;JIA Qin;REN Chun-yan;LIU Chun-ye【作者单位】;;;;【正文语种】中文【中图分类】O652.1血清白蛋白作为血浆中最为丰富的蛋白，能够结合与运输外源药物小分子和内源性代谢产物等，生理功能显著［1］。
其中，拥有相似序列以及构型的人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)，常被研究人员选作为研究蛋白与药物之间作用的底物［2－3］，BSA与各种药物结合的相关探索仍备受关注［4－6］。
马来酸氯苯那敏(Chlorpheniramine Maleate，CPM)，又名扑尔敏、马来酸氯苯吡啶，是临床上广泛使用的抗组胺类药［7－8］。
本研究首次以BSA与马来酸氯苯那敏(CPM)作为研究体系，分别采用传统的荧光猝灭法和紫外光谱法，研究了BSA与CPM的相互作用情况，能够帮助理解CPM在体内的运输形式和分布状况，对于表明药物代谢动力学、作用机制及其毒性均起到关键作用。
-磺胺类药物与牛血清白蛋白相互作用研究
第23卷第4期烟台大学学报（自然科学与工程版）Vol．23No．42010年10月Journal of Yantai University （Natural Science and Engineering Edition ）Oct．2010文章编号：1004-8820（2010）04-0277-06收稿日期：2009-12-19基金项目：山东省科技攻关项目（2009GG10009053）．作者简介：朱晓静（1981-），女，山东莱芜人，硕士，研究方向：光谱学与光谱分析；通讯联系人：刘永明（liuyongming100@126．com ），教授．磺胺类药物与牛血清白蛋白相互作用研究朱晓静1，贾风燕1，计岳龙2，潘燕飞1，刘永明1（1．烟台大学化学生物理工学院，山东烟台264005；2．浙江大学药学院，浙江杭州310058）摘要：利用分子荧光法、分光光度法、傅里叶变换红外光谱法研究了磺胺甲基嘧啶（SM1）和磺胺二甲基嘧啶（SM2）与牛血清白蛋白（BSA ）之间的相互作用．实验表明SM1和SM2对BSA 的荧光猝灭均为静态猝灭过程，并得到不同温度下猝灭反应的平衡常数K 0、结合数n 、结合常数K B 与结合距离r．计算了25ħ和37ħ时的热力学常数ΔH 和ΔS ，据此得出SM1、SM2与BSA 结合作用力均为氢键和范德华力．利用傅里叶变换红外光谱研究了结合反应前后BSA 的二级结构，结果表明BSA 的二级结构均发生了改变．关键词：磺胺甲基嘧啶；磺胺二甲基嘧啶；牛血清白蛋白；分子荧光法；分光光度法；傅里叶变换红外光谱中图分类号：O65文献标识码：A磺胺类药物（Sulfonamides ）是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物，常用于预防和治疗细菌感染性疾病，具有抗菌谱广、疗效强、方便安全等优点［1］．其中，磺胺甲基嘧啶（SM1）常用来治疗由溶血性链球菌和肺炎球菌所引起的感染，如肺炎、丹毒、脑膜炎等疾病，吸收较快，毒性较小．磺胺二甲基嘧啶（SM2）是兽医临床常用的磺胺类药，具有抗菌力强、毒性小、吸收迅速完全、在家畜体内药效维持时间较长、能透过血脑屏障进入脑脊液、排泄较慢、不宜损害肾脏及尿路和药价低廉等优点［2］．SM1、SM2的结构式如图1所示．药物进入生物体后一般需要通过血浆的运输到达受体部位，以发生药理作用［3］．血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它可以与许多内源及外源性化合物结合．研究药物与血清白蛋白的作用有助于阐明药物在生物体内的存储和转运过程，并为其药理研究提供有价值的信息［4］．因此，从不同角度研究以血清白蛋白为代表的蛋白质与具有生物活性的小分子间的相互作用，已成为一个非常活跃的研究课题．图1磺胺甲基嘧啶与磺胺二甲基嘧啶结构式Fig．1The structure of SM1and SM2荧光法和紫外可见吸收光谱法是研究药物与蛋白质的相互作用的重要手段，可为研究两者之间的作用力类型、作用距离等提供实验依据．傅立叶变换红外光谱（FT－IR ）是测定溶液中蛋白质二级结构变化的有力手段，它可以从蛋白质二级结构变化的层次来讨论药物与蛋白质的作用情况．本文首次应用上述几种方法对磺胺甲基嘧啶和磺烟台大学学报（自然科学与工程版）第23卷胺二甲基嘧啶与牛血清白蛋白的相互作用进行了系统的理论研究．1实验部分1．1仪器和试剂美国瓦里安公司CARY－Eclipse型荧光光度计（配有温度控制和磁子搅拌功能）；北京普析通用公司TU－1901双光束紫外可见光度计；日本岛津公司FTIR－8400S傅立叶变换近红外光谱仪．BSA标准储备液（BSA，北京军区兽医防治中心生物工程研究室，纯度＞98%，相对分子质量68000）：准确称取适量BSA标准品用pH=7．4的Tris－HCl缓冲溶液配制成浓度为1ˑ10－5mol·L－1的溶液作为标准储备液，并置于冰箱中1 4ħ保存，用时稀释．磺胺甲基嘧啶（SM1，C11H12N4O2S，264.30）、磺胺二甲基嘧啶（SM2，C12H14N4O2S，278.33）标准溶液：分别用分析纯的甲醇配制成1ˑ10－3mol·L－1的溶液，置于1 4ħ冰箱中保存．其余所用试剂均为分析纯，实验室用水为蒸馏水．1．2实验方法1．2．1磺胺类药物对BSA荧光光谱猝灭的测定BSA标准工作液（1ˑ10－6mol·L－1）的配制：准确移取1ˑ10－5mol·L－1的BSA标准储备液1.0mL于10mL比色管中，并加入2.0mL pH=7.4的Tris－HCl缓冲溶液，2.0mL0.5mol·L－1NaCl溶液，以蒸馏水准确稀释至10mL．准确移取BSA标准工作液3.0mL于1cm石英比色皿中并置入荧光光度计中，设定参数（光谱通带5nm，λex =280nm，λem=345nm）测定荧光光谱作为BSA空白的荧光光谱数据．用微量进样器（5μL）分别向3.0mL的BSA 工作液中逐次加入一定体积的1ˑ10－3mol·L－1的SM1标准溶液（累积体积＜100μL），并用磁力搅拌（仪器配置）充分搅拌5min，使溶液混合均匀并充分反应，测定荧光光谱．SM2测定同上．1．2．2紫外吸收光谱的测定配制1ˑ10－4mol ·L－1的SM1、SM2溶液，分别用TU－1901双光束紫外可见光度计在λ=300 500nm范围进行光谱扫描并绘制吸收光谱图．1．2．3红外光谱的采集及谱图处理室温下，以4cm－1分辨率，扫描60次，分别收集样品溶液及参比溶液的红外光谱．将蛋白质溶液的谱图与空白缓冲溶液的谱图差减，即得蛋白质溶液的红外谱图；将药物与蛋白质混合溶液的红外谱图差减相应浓度药物溶液的红外谱图，即得与药物作用后蛋白质的红外谱图．以谱图在1800 2200 cm－1区域呈一条平滑直线为差减终点判据，因此作1800 1400cm－1范围内的样品溶液的红外光谱图即可得到其红外谱图信息．2结果与讨论2．1SM1、SM2与BSA反应的荧光猝灭机理蛋白质中由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的存在使其具有内源荧光（BSAλex/λem=280nm/345 nm），随着磺胺类药物浓度的增加，BSA的内源荧光强度有规律地降低，且激发峰与发射峰的峰位与峰形均不变．说明磺胺类药物对牛血清白蛋白的荧光有猝灭作用，以25ħ的荧光猝灭图为例（图2）．c（SM1）ˑ106/mol·L－1，从1到10：0、1．92、3．83、5．75、7.67、9.58、11．5、13．4、15．3、17．3；c（SM2）ˑ106/mol·L－1，从1到10：0、1．79、3．58、5．37、7．16、8．95、10．74、12．53、14．32、16.11；λex/λem=280nm/345nm；c（BSA）：均为1ˑ10－6mol·L－1．图225ħ时SM1、SM2对BSA的荧光猝灭作用Fig．2The effect of SM1，SM2on fluorescence spectra of BSA at25ħ872第4期朱晓静，等：磺胺类药物与牛血清白蛋白相互作用研究引起BSA荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和（或）静态猝灭．动态猝灭是一种能量转移或电子转移过程，不影响蛋白质的结构和生理活性．静态猝灭则是由于发生了配合作用，通常是产生了不发荧光的配合物，对蛋白质的二级结构可产生影响，并可影响其生理活性．荧光猝灭符合下式［5］：F 0/F=1+K［Q］，（1）式中：F0是猝灭剂不存在时的荧光强度，F为加入猝灭剂后的荧光强度，K为猝灭常数，［Q］为猝灭剂浓度．根据式（1），对于单一的动态猝灭或静态猝灭过程，以荧光分子的荧光强度变化F0/F对猝灭剂浓度［Q］作图应为直线关系，直线斜率代表荧光猝灭过程速率常数K，拟合得到的Stern-Volmer方程和猝灭常数列于表1．表1由荧光猝灭曲线拟合得到的Stern-Volmer方程和速率常数KTab．1Stern-Volmer Equations and K obtained by fitting the curves药物温度/ħF0/F 106c方程K/（L·mol－1）25y=0．0359x+0．9552（R2=0．9882）3．95ˑ104 SM130y=0．0322x+0．9927（R2=0．9985）3．22ˑ104 37y=0．0307x+0．9949（R2=0．9983）3．07ˑ10425y=0．047x+1．0008（R2=0．9978）4．70ˑ104 SM230y=0．0414x+0．9659（R2=0．9965）4．14ˑ104 37y=0．0349x+1．0053（R2=0．9992）3．49ˑ104由于生物大分子的最大动态猝灭过程的速率常数K＜100L·mol－1，因此，对于速率常数大于100L·mol－1的荧光猝灭过程，静态猝灭而非动态猝灭是荧光猝灭的主要原因［6］．对于动态猝灭，随着温度的升高，分子间有效碰撞的次数将增加，能量转移效率增加，荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大；而对于静态猝灭，温度升高则降低形成复合物的稳定性，导致猝灭常数减小．由表1表明，猝灭常数比最大动态猝灭过程速率常数大2个数量级，且SM1、SM2与BSA猝灭常数随着温度的上升而依次下降，证明了SM1、SM2对BSA的猝灭为静态猝灭过程．2．2求算SM1、SM2与BSA的结合数n、平衡常数K对于静态猝灭，荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光分子与猝灭剂之间的结合常数表达式推导求出［7］．设生物大分子B有n个相同且独立的结合点位，则与磺胺类药物间的猝灭反应可表示为n Q+B Q n B，（2）平衡常数K0为K 0=［Q n B］/［Q］n［B］，（3）式中：［B］是游离荧光体浓度，［Q］是猝灭剂浓度，［Q n B］是配合物浓度，若荧光体总浓度为［B］，则［B］=［QnB］+［B］，当［Q］＞＞［B］时，以猝灭剂的起始浓度代替其平衡浓度，则有K=（［B］－［B］）/［Q］n［B］．（4）在静态猝灭中，荧光体系的荧光强度与其游离浓度呈正比（所生成的配合物是非荧光性的）：［B］/［B］=F/F．（5）由式（4）和（5）可得lg［（F－F）/F］=lg K+n lg［Q］．（6）由lg［（F0－F］/F） lg［Q］曲线拟合得到的方程、平衡常数与结合数列于表2．2．3求算SM1、SM2与BSA的离解常数KD与结合常数KB荧光强度、猝灭剂浓度［Q］与解离常数K D之间的关系［8］为（F－F）－1=F－1+KDF－1［Q］－1，（7）通过拟合得到Lineweaver-Burk方程、离解常数K D与结合常数K B列于表3．由表3中的结合常数可以看出BSA与磺胺类药物的结合是很稳定的．972烟台大学学报（自然科学与工程版）第23卷表2lg（（F0－F）/F）－lg［Q］曲线拟合得到的方程、平衡常数K与结合数nTab．2Equations，Kand n obtained by fitting the curves药物温度/ħlg［（F0－F）/F］－lg［Q］方程平衡常数K0/（L·mol－1）n 25y=1．1758x+5．363（R2=0．9920）2．31ˑ1051．1758 SM130y=1．0079x+4．535（R2=0．9971）3．42ˑ1041．0079 37y=1．0275x+4．6161（R2=0．9995）4．13ˑ1041．027525y=1．0332x+4．8402（R2=0．9985）6．92ˑ1041．0332 SM230y=1．1149x+5．1447（R2=0．9962）1．40ˑ1051．1149 37y=0．9732x+4．4162（R2=0．9997）2．61ˑ1040．9732表3Lineweaver-Burk方程、配合物离解常数KD 与结合常数KBTab．3Equations，KD and KBobtained by fitting the curves药物温度/ħ（F0－F）－1－（105［Q］）－1方程K D/（mol·L－1）K B/（L·mol－1）25y=0．0252x+0．006（R2=0．9813）4．20ˑ10－52．38ˑ104 SM130y=0．0161x+0．0062（R2=0．9954）2．60ˑ10－53．85ˑ104 37y=0．0207x+0．0048（R2=0．9995）4．31ˑ10－52．32ˑ10425y=0．0109x+0．0035（R2=0．9988）3．11ˑ10－53．21ˑ104 SM230y=0．018x+0．0029（R2=0．9981）6．21ˑ10－51．61ˑ104 37y=0．0148x+0．0063（R2=0．9999）2．35ˑ10－54．26ˑ1042．4SM1、SM2与BSA作用距离r计算根据偶极－偶极非辐射能量转移理论即F ster理论［7］，当供体与受体足够接近，最大距离不超过7nm，将发生非辐射能量转移，距离越小，能量转移效率越高．据F ster原理，能量转移效率E与给体－受体间的距离r的关系为E=1/［1+（r/R）6］．（8）能量转移的效率（E）为50%时临界距离R0（福斯特距离）为R6 0=8．8ˑ10－25（K2n－4φDJ），（9）式中：K为供体受体各项随机分布的取向因子，n 为介质的折射指数，φD为给体的荧光量子产率，J 表示供体的发射光谱与受体的吸收光谱二者重叠积分：J=∑F D（珋v）εA（珋v）珋v－4Δ珋v/∑F D（珋v）Δ珋v，（10）式中：F D（珋v）为供体在珋v至珋v+d珋v波数间隔内的校正荧光强度，荧光总强度归一化为1．εA（珋v）为受体在波数珋v的摩尔吸光系数．能量转移效率E可用下式计算：E=1－F/F0．（11）只要得到E，K2，和n并通过测定光谱求出积分J，就可以计算得到R0与r．BSA的荧光光谱图和磺胺类药物的吸收光谱图如图3．将光谱重叠部分分割成极小的矩形，通过式（10）求得J（υ）．上述实验条件下，取向因子供体受体各项随机分布的平均值K2=2/3，n（折射指数）取水和有机物平均值n=1．336，φD=0.15，将上述数值代入式（8）求得R0．再通过磺胺类药物与BSA物质的量之比为1ʒ1时配合物的荧光强度，通过（11）式计算得到能量转移效率E．经式（8）求得磺胺类药物距色氨酸残基最短距离r．J、R0、E和r的数值列于表4．BSA的荧光主要来自第212位色氨酸残基，该残基位于BSA的疏水腔内，所求得的r值为结合部位与该残基之间的距离，r值小于7nm，符合F ster能量转移的条件，说明磺胺类药物与BSA之间发生了非辐射能量转移，使BSA的荧光猝灭．因为SM2的空间位阻大于SM1的空间位阻，所以SM1更容易与BSA结合，SM1与BSA的结合距离小于SM2与BSA的结合距离．082第4期朱晓静，等：磺胺类药物与牛血清白蛋白相互作用研究c（BSA）=1．0167ˑ10－6mol·L－1，c（SM1）=1.15ˑ10－4mol·L－1，c（SM2）=1．074ˑ10－4mol·L－1．图3BSA的荧光光谱（1）与磺胺类药物的吸收光谱（2）Fig．3The fluorescence emission spectra of BSA（1）and the absorption spectra of sulfonamides（2）表4重叠积分J、能量转移效率E、R和空间距离rTab．4J，E，Rand r of pharmaceuticals-BSA systems药物J/（cm3·L·mol－1）E/%R0/nm r/nmSM16．020ˑ10－173．971．091．85SM21．355ˑ10－157．181．832．802．5磺胺类药物与BSA作用力的推测药物与生物大分子之间的作用力包括氢键、Van der Waal’s力、静电引力、疏水作用力等，根据热力学参数与作用力间的关系，可以确定其作用力类型．在配合物的形成过程中，热力学参数之间满足如下关系式：ΔG=－RT ln K0=ΔH－TΔS，ΔH=RT1T2ln（K0，2/K0，1）T2－T1，ΔS=ΔH－ΔGT．式中，ΔG为吉布斯生成自由能，ΔH为焓变，ΔS为熵变，各热力学参数列于表5．表5药物－BSA结合过程的热力学参数Tab．5Thermodynamic parameters of pharmaceutical-BSA binding procedure药物T/ħΔH/（kJ·mol－1）ΔG/（kJ·mol－1）ΔS/（J·mol－1·K－1）SM125－110．07－30．59－266．7137－110．07－27．39－266．71 SM225－62．49－27．61－117．0337－62．49－26．21－117．03由表5知，SM1与SM2都满足ΔG＜0，说明它们与BSA之间的结合均是自发进行的．ΔH＜0、ΔS ＜0推测其主要作用力为氢键和范德华力［10］．2．6磺胺类药物对BSA二级结构的影响红外光谱图能够提供BSA与其他分子作用前后有关特征官能团的变化信息［9］．图4为磺胺类药物作用前后BSA的红外光谱图．c（BSA）：5．0ˑ10－5mol·L－1；c（SM1），c（SM2）：5．0ˑ10－5mol·L－1图4BSA（a）和SM1－BSA（b），SM2－BSA（c）的红外光谱图Fig．4FT-IR spectrum of BSA（a），SM1-BSA（b），SM2-BSA（c）182烟台大学学报（自然科学与工程版）第23卷BSA红外光谱的酰氨Ⅰ带（AmideⅠ，1700 1600cm－1）主要是氨基酸残基的C O伸缩振动吸收，对其二级结构的变化非常敏感；酰氨Ⅱ带（AmideⅡ，1600 1500cm－1）包含了C—N伸缩振动和N—H变形振动的信息，也是反映BSA结构的一个重要谱带，但对二级结构变化的敏感程度次于酰氨Ⅰ带［11］．从图4可以看出，BSA酰胺带的吸收峰在1632和1545cm－1，加入SM1或SM2后，均位移到1643，1541cm－1，说明磺胺类药物与BSA分子发生了相互作用，引起了BSA二级结构的变化．参考文献：［1］Furusawa N，Kishida K．High-performance liquid chro-matographic procedure for routine residue monitoringof seven sulfonamides in milk［J］．Fresenius J Anal Chem，2001，371：1031－1033．［2］杨秀娟，张曦．磺胺二甲基嘧啶残留检测方法的研究进展［J］．中国动物保健，2004，11：17－18．［3］刘淑燕，刘春林，刘永明，等．荧光光谱法研究3－吡唑啉基叶绿素－a衍生物和牛血清白蛋白的相互作用［J］．烟台大学学报：自然科学与工程版，2008，21（1）：29－34．［4］廖卫平，司芝坤．荧光光谱法研究槲皮素与牛血清白蛋白的相互作用［J］．烟台大学学报：自然科学与工程版，2006，19（1）：20－24．［5］杨曼曼，杨频，张立伟．荧光法研究咖啡酸类药物与白蛋白的作用［J］．环境科学学报，2006，26（11）：1880－1885．［6］郭灿城，李和平，张晓兵，等．meso－5，10，15，20－四［4－（N－吡咯烷基）苯基］卟啉的合成及对牛血清白蛋白的作用［J］．高等学校化学学报，2003，24（2）：282－287．［7］冯喜增，金瑞祥，曲芸，等．各种离子对血卟啉与牛血清白蛋白相互结合反应的影响研究［J］．高等学校化学学报，1996，17（6）：866－869．［8］刘永明，李桂芝．荧光法研究喹诺酮类抗菌药物和蛋白质的相互作用［J］．化学研究与应用，2005，17（1）：46－48．［9］陈国珍，黄贤智，许金钩，等．荧光分析法［M］．北京：科学出版社，1990：122．［10］Ross P D，Sabramanian S．Thermodynamics of protein association relation：forces contribution to 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binding forces between BSA and sulfanilamides are hydrogen bond and van der waal’s force．The changes of the protein secondary structures are investigated by Fourier transform infrared spectrometry，and the results indicate that the protein secondary structures are changed by SM1or SM2．Key words：sulfamerazine；sulfadimidine；bovine serum albumins；fluorescence spectrometry；UV-Vis ab-sorption spectrometry；Fourier transform infrared spectrometry．（责任编辑周雪莹）282。
盐酸二氧丙嗪与牛血清白蛋白结合性质研究
盐酸二氧丙嗪与牛血清白蛋白结合性质研究吴晓侠;王永霞;何玲玲【摘要】在模拟生理条件下,利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱及圆二色光谱研究盐酸二氧丙嗪(DPZ)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用.结果表明:DPZ对BSA的内源性荧光有猝灭作用,猝灭的主要原因为静态猝灭.DPZ与BSA以1:1的摩尔比结合,结合常数Ka分别为:3.664×103(289 K)、3.439×103(296 K)、3.257×103 (303 K)、2.979×103(310 K).由热力学方程求得该反应的热力学参数表明DPZ与BSA之间的作用力主要为疏水作用力和静电引力.根据Forster偶极-偶极非辐射能量转移理论求得结合距离r=3.161 nm,同步荧光光谱、吸收光谱及圆二色光谱的结果表明DPZ对BSA的构象产生了影响.【期刊名称】《沈阳化工大学学报》【年(卷),期】2014(028)004【总页数】7页(P297-303)【关键词】盐酸二氧丙嗪;牛血清白蛋白;荧光光谱;相互作用【作者】吴晓侠;王永霞;何玲玲【作者单位】沈阳化工大学应用化学学院,辽宁沈阳110142;沈阳化工大学应用化学学院,辽宁沈阳110142;沈阳化工大学应用化学学院,辽宁沈阳110142【正文语种】中文【中图分类】O657.3血清白蛋白是血浆中主要蛋白之一，具有结合和运输内源及外源性物质的作用[1].药物进入人体后，以游离态存在的药物分子可透过生物膜转运、奏效或消除；与血清白蛋白结合的部分则形成大分子物质不能透过生物膜达到治疗病痛目的，因而变成无效的药物分子，但这种结合是可逆的，可重新释放出有活性的药物分子使其成为游离态.所以研究药物分子与血清白蛋白的相互作用对于阐明药物在体内的运输和代谢过程、药物动力学以及药物所具有的毒性具有非常重要的意义[2].牛血清白蛋白(Bovine serum albumin ，BSA)，是牛血清中的一种球蛋白，与人血清白蛋白在结构上有高度的相似性，且BSA更廉价易得，因而它成为研究高分子蛋白质理化性质、生物学功能的理想蛋白质.盐酸二氧丙嗪(Dioxopromethaine Hydrochloride，DPZ)，化学名称为10-(2-二甲氨基-异丙基) 吩噻嗪-5,5-二氧化物盐酸盐.它具有镇咳平喘、祛痰、抗胆胺和局麻作用，也适用于治疗荨麻疹及皮肤瘙痒等[3].本文通过荧光光谱、紫外吸收光谱及圆二色光谱法研究了DPZ与BSA之间的相互作用.1 实验部分1.1 仪器与试剂F-7000荧光光谱仪：日本Hitachi公司；UV-2500紫外-可见分光光度计：日本Shimadzu公司；MOS-450圆二色光谱仪：法国Bio-logic公司；SC-15超级恒温槽：上海比朗仪器有限公司；AL204分析天平：上海梅特勒-托利多仪器有限公司；pHS-25酸度计：上海雷磁仪器厂.BSA:美国Amresco公司;Trish-HCl缓冲溶液:pH=7.4，含0.05 mol/L NaCl 维持溶液的离子浓度；DPZ:辽宁省东港市宏达制药有限公司；布洛芬：萨恩化学技术(上海)有限公司；酮基布洛芬：萨恩化学技术(上海)有限公司.1.2 实验方法1.2.1 溶液的配制BSA用Trish-HCl缓冲溶液配制成0.1 μm/L的储备液，放入冰箱4 ℃下保存.DPZ用Tris-HCl缓冲溶液配制成1.255×10-3 mol/L的储备液.布洛芬和酮基布洛芬溶液配制时，首先用少量乙醇溶解，再用Tris-HCl缓冲溶液均配制成2.51 mmol/L的结合位点标记物溶液.1.2.2 荧光光谱的测定准确移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中，固定激发波长280 nm，激发与发射的狭缝宽度均为5 nm，扫描范围290～500 nm，测其发射光谱，然后再用微量进样器逐次加入不同体积的DPZ溶液，再次进行测定.同样的方法测定位点标记物存在下，DPZ与BSA相互作用的荧光光谱.在这里由于DPZ在280nm激发波长下有吸收，因此在研究中需考虑内滤光效应.采用公式(1)[4]对内滤光进行校正，计算中所用的荧光强度值均为校正后的荧光值.Fcor=Fbor×e(Aex+Ae m)/2(1)其中：Fcor为校正后的荧光强度；Fbor为测量到的荧光强度；Aex为溶液在激发波长处的吸收值；Aem为溶液在发射波长处的吸收值.1.2.3 同步荧光光谱的测定准确移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中，在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm处分别扫描其同步荧光光谱，然后用微量进样器逐次加入不同体积DPZ溶液再次进行扫描.1.2.4 紫外-可见吸收光谱的测定准确移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×1 cm石英比色皿中，扫描范围200～500 nm，光谱带宽1.0 nm，扫描其吸收光谱，然后用微量进样器加入不同体积DPZ溶液，再次进行扫描测定.1.2.5 圆二色光谱的测定准确移取2.5 mL BSA溶液于1 cm×0.5 cm的石英比色皿中，扫描范围200～300 nm，光谱带宽1.0 nm，扫描速度100 nm/s，进行扫描.在同样的条件下再次扫描DPZ存在下BSA的圆二色光谱.2 结果与讨论2.1 DPZ对BSA的荧光猝灭光谱BSA分子因含色氨酸和酪氨酸等残基而成为内源性荧光物质.图1为BSA与不同浓度的DPZ相互作用的荧光光谱图.从图1可以看出:随DPZ浓度的增加，BSA的荧光强度有规律地降低，说明DPZ对BSA的荧光有猝灭作用.c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19c(DPZ)=0.40 μmol·L-1图1 DPZ与BSA相互作用的荧光猝灭光谱Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ2.2 荧光猝灭机理引起荧光猝灭的原因通常有动态猝灭和静态猝灭[5].动态猝灭是猝灭体和荧光物质间的能量转移或电子转移过程；静态猝灭是由于猝灭体和荧光物质相互作用，形成不发光的配合物.一般情况下，荧光猝灭机理可根据不同温度下的猝灭特征加以区分,动态猝灭的猝灭常数会随温度的升高而升高，对于静态猝灭则恰好与其相反.动态猝灭过程符合Stern-Volmer方程[6]:F0/F=1+Kqτ0cQ=1+KSVcQ(2)其中：F0为猝灭剂不存在时的荧光强度；F为加入猝灭剂后的荧光强度；KSV为Stern-Volmer猝灭常数；cQ为猝灭剂的物质的量浓度；Kq为双分子猝灭过程的速率常数；τ0为猝灭剂不存在时荧光体分子的平均寿命，BSA的τ0为6.2 ns. 实验分别绘制289、296、303和310 K温度下BSA-DPZ体系的Stern-Volmer 曲线(见图2).对曲线进行直线拟合，由直线斜率可以得到不同温度下的猝灭常数(见表1).随温度的升高猝灭常数KSV降低，说明引起BSA荧光猝灭的原因不是动态猝灭而是静态猝灭，并且从表1中还可以看出双分子猝灭速率常数Kq远大于最大动态猝灭速率常数2.0×1010 L·mol-1·s-1[7]，进一步说明DPZ对BSA的荧光猝灭是静态猝灭.表1 不同温度下DPZ对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer猝灭常数和猝灭速率常数Table 1 Stern-Volmer quenching constants and quenching rate constants of the fluorescence of BSA quenched by DPZ at different temperaturesT/KKSV/(L·mol-1)Kq/(L·mol-1·s-1)Stern-Volmer 曲线相关系数标准偏差2891.199×1041.911×10120.999 50.005752961.161×1041.858×10120.999 30.006363031.131×1041.811×10120.998 50.009143101.095×1041.761×10120.998 30.009 31图2 不同温度下DPZ-BSA的Stern-Volmer曲线Fig.2 Stern-Volmer curves of the interaction between DPZ and BSA at different temperatures2.3 DPZ与BSA的表观结合常数Ka、结合位点数nDPZ对BSA的荧光猝灭为静态猝灭，即DPZ与BSA相互作用形成基态复合物.假设BSA与DPZ有n个相同且独立的结合位点，可用公式(3)来求算结合常数Ka和n.log[(F0-F)/F]=logKa+nlogcQ(3)其中：Ka为结合常数；n为结合位点数；cQ为猝灭剂DPZ的浓度.以log[(F0-F)/F]对log cQ作图(见图3)可得一条直线，由直线的斜率和截距可求得不同温度下DPZ对BSA的结合常数Ka和结合位点数n(见表2).由表2数据可知:不同温度下的n值均接近于1，表明DPZ与BSA有1个结合位点，即形成摩尔比为1∶1的配合物；Ka随温度的升高而降低，则说明两者的结合过程为静态猝灭过程，且形成的基态复合物的稳定性随温度的升高而降低.图3 不同温度下DPZ与BSA相互作用的双对数曲线Fig.3 Double logarithm regression curves of the interaction between DPZ and BSA at different temperatures表2 不同温度下DPZ与BSA相互作用的结合常数及结合位点数Table 2 The association constants and the number of the binding sites of the interaction between DPZ and BSA at different temperaturesT/KKa/(L·mol-1)n双对数回归曲线相关系数标准偏差2893.664×1030.884 50.998 20.017 642963.439×1030.881 60.997 20.021 953033.257×1030.878 80.996 30.024 943102.979×1030.873 40.995 30.028 202.4 DPZ与BSA之间作用力类型的确定氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力是分子间相互作用的主要作用力类型.Ross[8]等根据大量实验结果总结出判断小分子猝灭体与蛋白质等生物大分子之间的结合性质的热力学规律(见表3).当温度变化范围不大时，可把焓变ΔH看成是一个不随温度变化的常数，由不同温度下的结合常数Ka，根据下列方程可求得焓变ΔH、熵变ΔS和吉布斯自由能ΔG.(4)ΔG=-RT ln Ka=ΔH-TΔS(5)其中：R为气体常数；T为实验温度；Ka为相应温度时的结合常数.表3 热力学函数与作用力类型的关系Table 3 Relationship between thermodynamic parameters and the type of binding force热力学函数作用力类型ΔS>0,ΔH<0疏水作用力,静电引力ΔS>0,ΔH>0疏水作用力ΔS>0,ΔH≈0静电引力ΔS<0,ΔH<0范德华力,氢键DPZ与BSA相互作用的热力学参数可以根据方程(4)和(5)并以ln Ka对1/T作图(见图4)求得(见表4).从表4可以看出ΔG<0，表明DPZ与BSA相互作用的过程为自发进行；ΔS>0，ΔH<0表明使DPZ与BSA结合的相互作用力为疏水作用力和静电引力.图4 DPZ与BSA相互作用的van’t Hoff 曲线Fig.4 Van’t Hoff plot of the interaction between DPZ and BSA表4 DPZ与BSA相互作用的热力学参数Table 4 Thermodynamic parameters of the interaction between DPZ and BSAT/KΔH/(kJ·mol-1)ΔS/(J·mol-1·K-1)ΔG/(kJ·mol-1)289-19.72296-7.17043.47-20.04303-20.38310-20.622.5 DPZ与BSA之间的结合距离根据Förster的偶极-偶极无辐射能量转移理论[4]，要使两种化合物间发生非辐射能量转移，则必须满足3个条件：(1)能量给体发荧光；(2)能量给体的荧光发射与能量受体的吸收光谱有足够的重叠；(3)能量给体与能量受体足够接近，最大距离不超过7 nm.实验测出了DPZ的吸收光谱与BSA的荧光光谱，发现两光谱之间有一定的重叠，如图5所示.c(BSA)=c(DPZ)=0.1 μmol·L-1图5 BSA的荧光光谱与DPZ的吸收光谱的重叠Fig.5 The overlap of the fluorescence spectrum of BSA and the absorption spectrum of DPZ根据能量转移理论，能量转移效率E与能量给体和受体间的结合距离r及转移效率为50 %时的临界能量转移距离R0有如下关系：(6)(7)(8)其中：K2为偶极空间取向因子；N为介质的折射指数；ΦD为能量给体的荧光量子产率；J为能量给体的荧光发射光谱与能量受体的吸收光谱间的光谱重叠积分；F(λ)为能量给体在波长λ处的荧光强度；ε(λ)为能量受体在波长λ处的摩尔吸光系数.将图5的重叠光谱分割成小矩形，并利用公式(8)可求出重叠积分J=5.094×10-15 cm3·L·mol-1，再由公式(6)和(7)可求得临界距离R0=2.254 nm，能量转移效率E=0.1160，进而求得结合距离r=3.161 nm.r<7 nm，表明BSA与DPZ之间能发生非辐射能量转移，但r大于转移效率为50 %时的临界距离R0，说明非辐射能量转移引起荧光猝灭的概率比静态猝灭要小[9].2.6 DPZ与BSA相互作用的结合位点的确定结合位点可以利用小分子猝灭体与位点标记物进行竞争结合的实验来确定.以酮基布洛芬和布洛芬作为siteⅠ和siteⅡ的位点标记物，固定BSA的浓度，分别作3组对比实验，并利用公式(2)对3组荧光数据进行处理(见图6)，通过计算得到酮基布洛芬和布洛芬存在下DPZ与BSA的结合常数Ka和结合位点数n(见表5).由表5可知：布洛芬的存在对DPZ与BSA的Ka和n几乎没有影响，而在酮基布洛芬存在下Ka和n显著降低，表明酮基布洛芬占据了DPZ与BSA的结合位点，说明siteⅠ为DPZ在BSA上的结合位点.图6 结合位点标记物存在条件下DPZ与BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.6 Double logarithm regression curves of the nteraction between DPZ and BSA in the presence of site marker probes表5 结合位点标记物存在条件下DPZ与BSA相互作用的结合常数Table 5 The association constants and the number of the binding sites for the interaction between DPZ and BSA in the presence of site marker probes标记物Ka/(L·mol-1)n双对数回归曲线相关系数标准偏差空白3.664×1030.884 50.998 20.017 64布洛芬3.685×1030.887 50.993 60.033 31酮基布洛芬1.042×1030.766 90.995 60.023 922.7 DPZ对BSA构象的影响2.7.1 同步荧光光谱利用蛋白质的同步荧光光谱可以了解小分子猝灭体对蛋白质构象的影响，红移表明蛋白质所处环境的疏水结构有所瓦解，极性在增强，而蓝移则恰恰相反[10].固定激发波长和发射波长的间距Δλ，Δλ=15 nm为蛋白质中酪氨酸残基的荧光，Δλ=60 nm则是色氨酸残基的荧光.图7为DPZ存在下BSA的同步荧光光谱.c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19c(DPZ)=0.40 μmol·L-1图7 含不同浓度DPZ的BSA溶液的同步荧光光谱Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ由图7可见：随着DPZ浓度的不断增加BSA的荧光强度有规律地降低，Δλ=15 nm时酪氨酸残基的最大发射波长没有改变，而Δλ=60 nm时色氨酸残基的最大发射波长由281 nm红移至284 nm，说明随DPZ的不断加入，色氨酸残基所处环境的极性增强，使色氨酸残基更多的暴露于所处的溶剂中.上述同步荧光表明DPZ的加入使BSA的构象发生了改变.2.7.2 紫外-可见吸收光谱紫外-可见吸收光谱也是证实蛋白质构象发生变化的一种简单有效的方法.蛋白质在220和278 nm处有两处紫外吸收峰，当蛋白质生色基团所处的环境发生改变时，紫外吸收光谱也会随之改变.图8为DPZ与BSA相互作用的吸收光谱.c(BSA)=0.10 μmol·L-15 c(DPZ)=0.20 μmol·L-11 c(DPZ)=0.00 μmol·L-16c(DPZ)=0.25 μmol·L-12 c(DPZ)=0.05 μmol·L-17 c(DPZ)=0.30 μmol·L-13c(DPZ)=0.10 μmol·L-18 c(DPZ)=0.35 μmol·L-14 c(DPZ)=0.15 μmol·L-19c(DPZ)=0.40 μmol·L-1图8 DPZ与BSA相互作用的吸收光谱Fig.8 Absorption spectra of BSA in the presence of different concentrations of DPZ由图8可见：BSA在279 nm处有一特征吸收峰，随DPZ的加入，其吸收峰呈明显的增色效应，且发生红移.该现象说明DPZ与BSA发生了相互作用，使BSA分子的肽链伸展，包围在BSA分子内部氨基酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，从而使279 nm处的吸收峰的吸收增强，同时使疏水作用增强，吸收峰红移.2.7.3 圆二色光谱圆二色(Circular dichroism，简称CD)光谱是研究稀溶液条件下蛋白质二级结构的重要工具.由BSA及BSA-DPZ混合溶液的CD光谱图(见图9)可知：BSA在222 nm和208 nm处分别有一特征负峰，这是典型的α-螺旋结构的特征.本实验主要通过对208 nm处的特征峰强度进行计算，分析DPZ对BSA构象的影响.采用公式(9)、(10)[11]可以求得不同条件下BSA分子中α-螺旋结构的含量.(9)α-螺旋结构(10)其中：MRE为平均残基椭圆率；cP为蛋白质物质的量浓度； n为蛋白质中氨基酸残基的数目(BSA，n=582)； l为光路的长度(本实验中l=0.5 cm)；MRE208为208 nm处的MRE值；4 000为β-折叠和无归卷曲构象跨过208 nm的MRE值；33 000为纯α-螺旋在208 nm的MRE值.c(BSA)=1.0 μmol·L-1,c(DPZ)=5.0 μmol·L-1图9 BSA及BSA-DPZ混合溶液的CD光谱Fig.9 CD spectra of BSA and BSA-DPZ mixed solutions在本实验条件下，BSA分子中α-螺旋结构的含量为55.64 %，DPZ的加入使得负峰强度减小，即α-螺旋结构的含量在下降，降至50.41 %.BSA中α-螺旋结构的降低是由于DPZ与肽键中氨基酸残基结合，从而在一定程度上破坏了蛋白质的氢键网络结构，导致BSA分子肽链的伸展而引起的.综合以上同步荧光光谱、吸收光谱和圆二色光谱的实验结果可以看出，DPZ与BSA的相互作用使BSA的构象发生了改变.3 结论在模拟生理条件下，用荧光光谱、紫外吸收光谱及圆二色光谱研究DPZ与BSA的相互作用，得到以下结论：(1) DPZ对BSA的荧光猝灭过程为静态猝灭，形成摩尔比为1∶1的复合物.(2) 两者之间的主要作用力为疏水作用力和静电引力.(3) 通过非辐射能量转移理论求得DPZ与BSA残基的结合距离r=3.161 nm，r<7 nm，表明两者之间存在非辐射能量转移，但r大于转移效率为50 % 时的临界距离R0，说明非辐射能量转移引起荧光猝灭的概率比静态猝灭要小.(4) 利用位点标记物进行竞争结合的实验结果表明，DPZ在BSA上的结合部位为siteⅠ位.(5) 同步荧光光谱、吸收光谱及圆二色光谱的研究结果表明，DPZ能使BSA的构象发生改变.【相关文献】[1] 张敏.人血浆白蛋白的生理功能及临床应用[J].四川生理科学杂志，2011，33(1)：36-38.[2] 张国文，陈秀霞.荧光法研究3种黄酮化合物与牛血清白蛋白的结合作用[J].南昌大学学报：工科版，2010,32(24)：140-144.[3] 高瑞，马红燕，孙雪花，等.流动注射时间扫描荧光分析法测定盐酸二氧丙嗪[J].分析科学学报，2011,27(1)：81-84.[4] 何玲玲.吩噻嗪类药物与蛋白质相互作用及其声动力活性的光谱法研究[D].沈阳，东北大学理学院，2012:28-29.[5] 许金钩，王尊本.荧光分析法[M].3版.北京：科学出版社，2006：124.[6] 颜乘农，童金强，熊丹，等.荧光光谱法研究培氟沙星与牛血清白蛋白结合反应特征[J].分析化学，2006,34(6)：796-800.[7] Ware W R.Oxygen Quenchixg of Fluorescence in Solution:An Experimental Study of the Diffusion Process[J].The Journal of Physical Chemistry,1962,66(3):445-458.[8] Ross P D,Subramanian S.Thermodynamics of Protein Association Reactions:Forces Contributing to Stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3102.[9] He W Y,Li Y,Xue C X,et al.Effect of Chinese Medicine Alpinetin on the Structure of Human Serum Albumin[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2005,13(5):1837-1845.[10] 何丽芳，林丹丽，李耀群.同步荧光分析法的应用及其新进展[J].化学进展，2004,16(6)：879-884.[11] Zhang J,Wang X J,Yan Y J,et parative Studies on the Interaction of Genistein,8-Chlorogenistein,and 3’,8-dichlorogenistein with Bovine Serum Albumin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2011,59(13):7506-7513.。
尼可刹米与牛血清白蛋白相互作用及共存金属离子的影响
尼可刹米与牛血清白蛋白相互作用及共存金属离子的影响刘里;成飞翔【摘要】在优化的实验条件下，运用光谱法研究牛血清白蛋白（BSA）与尼可刹米（NI）的相互作用及共存金属离子的影响。
研究表明：NI 对 BSA 的荧光有猝灭作用，属于动态猝灭。
BSA 能运输 NI，是一个自发过程，其作用力类型主要为疏水作用力。
BSA 的亚螺旋域ⅡA 是主要结合位置，离酪氨酸残基更近，无药物协同作用。
NI 对 BSA构象产生影响。
Mg2＋、Cu2＋对 PDS 与 BSA 结合产生竞争作用，增强药效。
Mn2＋、Cr3＋和Co2＋对PDS 与BSA 结合产生促进作用，延长药效时间。
该实验对揭示药物动力学问题及新药的研发提供了理论依据。
%Under the optimal conditions,the interactions between bovine serum albumin (BSA)with Nik-ethamide (NI)and the potential effects of metalions were studied with spectrometry.It was found that the fluorescence of BSA was quenched by NI,which was a dynamic quenching process.BSA could transport NI.The hydrophobic attraction might play an importantrole in the conjugation reaction of BSA and NI. The primary binding site for NI was located at sub-domain ⅡA of BSA and near by tyrosineresidue.There was almost no cooperative effect.The conjugation reaction could affect the conformation of BSA.Mg2+ and Cu2+ competed in the interactions of NI with BSA,increasing medical effectiveness.Mn2+ ,Cr3+ and Co2+promoted on interactions and prolonged drug effect time.The results provided a theoretical basis for revea-ling the pharmacokineticsand further research on development of new drugs.【期刊名称】《南昌大学学报（理科版）》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P385-389)【关键词】尼可刹米;相互作用;金属离子【作者】刘里;成飞翔【作者单位】曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖 655011;曲靖师范学院化学化工学院，云南曲靖 655011【正文语种】中文【中图分类】O657尼可刹米(Nikethamide，简称NI)，又名可拉明、尼克拉明，化学名称为：N，N- 二乙基-3-吡啶甲酰胺[1]，在临床上主要有三方面的应用，一是人体中枢兴奋剂；二是降低肝脏转氨和黄疸，常用来治疗新生儿黄疸；三是作为溶解性较差药物的促溶剂[1]。
阿霉素与牛血清白蛋白结合作用的研究
阿霉素与牛血清白蛋白结合作用的研究
黄波;邹国林;杨天鸣
【期刊名称】《化学学报》
【年(卷),期】2002(060)010
【摘要】结合荧光光谱和吸收光谱研究了阿霉素与牛血清白蛋白间的结合作用,确定了阿霉素对牛血清白蛋白的荧光猝灭过程的猝灭机理.测定了不同酸度条件下该结合反应的结合常数、结合位点数,依据能量转移理论确定了药物和蛋白间的结合距离.通过比较阿霉素和去糖基阿霉素与牛血清白蛋白的相互作用,结合阿霉素对蛋白构象的影响,讨论了药物与蛋白的结合模式.
【总页数】5页(P1867-1871)
【作者】黄波;邹国林;杨天鸣
【作者单位】武汉大学生命科学学院,武汉,43002;武汉大学生命科学学院,武
汉,43002;中南民族大学化学系,武汉,430074
【正文语种】中文
【中图分类】O6
【相关文献】
1.青霉素与牛血清白蛋白结合作用机理的光谱法研究 [J], 李瑞光;陈历俊;姜铁民
2.叶酸负载两亲嵌段聚合物与牛血清白蛋白结合作用的研究 [J], 邹斯婷;王峥;王千
3.荧光光谱法研究氢化可的松与牛血清白蛋白的结合作用 [J], 徐科;黄亚励;刘红;徐红
4.聚乙二醇修饰树枝状聚(胺-酯)与牛血清白蛋白结合作用的研究 [J], 宁春花;金圣;
秦玉杰;钟超;张奎
5.金芪降糖片与牛血清白蛋白结合作用的超滤-色谱联用技术研究 [J], 夏娜;邓雁如;金华;丁菲菲;曹颖
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荧光光谱法研究盐酸阿霉素与溶菌酶的相互作用
荧光光谱法研究盐酸阿霉素与溶菌酶的相互作用倪志华;张玉明【摘要】盐酸阿霉素（ doxorubicin hydrochloride， DOX）是临床上广泛应用的一种抗癌药物，溶菌酶（ lysozyme， LYS）是生物体内普遍存在的一种具有杀菌、抗病毒、抗肿瘤作用的蛋白质，研究DOX与LYS之间的相互作用十分必要。
研究利用荧光光谱法研究了不同温度下（298 K、308 K和318 K） DOX与LYS的相互作用，阐述了DOX对LYS荧光猝灭的机理；并计算了二者之间的结合位点和结合常数。
结果表明，DOX能使LYS的内源荧光发生猝灭，荧光猝灭机理属于二者形成复合物所引起的静态猝灭。
Stern－Volmer方程分析显示，DOX与LYS 具有1个结合位点，不同温度下DOX与LYS的结合常数（ KA ）：4.79×106（298 K）、2.82×106（308 K）和2.14×106（318 K）。
通过计算热力学参数，可知DOX与LYS的相互作用主要是由分子之间的静电作用引发的；并且二者之间相互作用是伴随吉布斯自由能降低的自发反应。
三维荧光光谱实验显示，DOX的加入引起LYS构象的变化，表现为蛋白质内部色氨酸残基所处微环境的疏水性降低。
%Doxorubicin hydrochloride ( DOX) is a kind of medicine with widely application of anti-cancer.Ly-sozyme ( LYS) , a protein existing in organism, has effect of anti-bacteria, anti-virus, and antineoplastic.Thus, studies on the Interaction of LYS with DOX is necessary.The interactions between DOX and LYS at different tem-perature were studied by fluorescence spectroscopy.The quenching mechanism between DOX and LYS was demon-strated, and the binding parameters were determined.The results showed that the intrinsic fluorescence of LYS could be quenched by DOX.The quenching mechanism between is due to static manner byforming DOX-LYS com-plex.The binding parameters were determined according to Stern-Volmer equation, and the thermodynamic param-eters were calculated.The results showed, there is one binding site between DOX and LYS.The binding constants ( KA ) between DOX and LYS at different temperature were 4.79 ×106 (298 K) , 2.82 ×106 (308 K) , and 2.14 ×106(318 K), respectively.Thermodynamic analysis indicated that the interaction process was spontaneous, and electrostatic force might be primarily responsible for the interaction.In addition, the effect of DOX on the confor-mation of LYS was analyzed by three-dimensional fluorescence spectra.The result indicates that the polarity micro-environment around Trp residues decreased.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2016(000)005【总页数】6页(P32-36,44)【关键词】盐酸阿霉素;溶菌酶;相互作用;荧光光谱【作者】倪志华;张玉明【作者单位】河北大学生命科学学院，保定071002; 河北省生物工程技术研究中心，保定071002;河北大学生命科学学院，保定071002【正文语种】中文【中图分类】Q55;TN249生物科学盐酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)是一种蒽环类抗癌抗生素，具有抗瘤谱广、抗瘤活性强的特点，临床上广泛应用于治疗多种恶性肿瘤[1]。
芯片电泳
［９］Ｄｅａｎｎｅ ＫＴ，Ｓｉｍｏｎ ＫＷ．Ｊｏｈｎ ＢＣ，ｅｔ ａ１．Ｐｅｒｉｎａｔａｌ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒｓ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｂｒａｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｔｅｒｍ ｉｎｆａｎｔ［Ｊ］．Ｂｒａｉｎ，２００７，１３０
（３）：６６７—７７．
ａｐｏｌｉｐｏｐｍ・ｒｅｉｎ Ｅ３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ
Ｐｒａｔｔ
ｉｎｊｕｒｙ［Ｊ］．Ｂｅｓｔ
Ｃｌｉｎ
Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎａｅｃｏｌ，２００７．２１
ｂｒａｉｎ
［１４］ｕ ＢＭ．Ｓｔｍｃｔｕｒｃ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｐｅｏｐｌｅ’ｓ ｂｒａｉｎ［Ｊ］．Ｚｈｏｎｇｇｕｏ Ｄａｎｇｄａｉ Ｅｒｋｅ Ｚａｚｈｉ（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｏｎｔｅ Ｐｅｄｉａｔｒ）２００２，２（Ｓ）：２５—７． ［１５］Ｍａｅｇｅｌｅ Ｍ，Ｌｉｐｐｅｒｔ—Ｇｒｕｅｎｅｒ Ｍ，Ｅｓｔｅｒ—Ｂｏｄｅ Ｔ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｈｉｍｏｄａｌ ｅａｌ－＝
在一般厚度不超过５咖、面积为数平方厘米的平板芯片上，
是将传统毛细管电泳技术（ＣＥ）与微电机加工技术（ＭＳＭＳ） 相结合的一种分离分析技术，它以刻蚀在芯片上的纤细管道 为分离通道，以高压直流电场为驱动力，是毛细管电泳技术的 重大技术延伸，它不但继承了传统毛细管电泳技术中纳升水 平检测及可分离分析大分子样品的优势，还发挥了微系统体 积小、检测效率高、时间短、耐用性好、成本低廉、可以在一块 微芯片上实现多路并行检测等优势旧Ｊ，不仅是减小尺寸，而 且大大提高了分析效能。已用于ＤＮＡｐ Ｊ、氨基酸Ｈ Ｊ、蛋白 质＂Ｊ、细胞‘６０等的检测和分析，在食品安全、新药筛选、环境 检测、司法鉴定、临床疾病诊断等领域逐步得到应用。 １芯片电泳原理与方法 微流控芯片电泳主要以电渗流作为蛋白区带的驱动力。 玻璃或石英芯片在中性或碱性ｐＨ下，其表面带负电荷，液流 中与其相邻的部分形成沿通道壁的带正电荷的界面。在通道 两端施加高电压，带正电荷的界面在电场作用下产生迁移，继 而带动通道内界面包裹的液流产生电渗流，使液体向负极移
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ａｎｄ Ｕｒｉｎｅ Ｓａｍｐｌｅｓ
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（７）
３样品分析
取人血清样品及尿样各Ｏ．２５ ｍＬ，按实验方法，利用连 续标准加入法分男４测定盐酸表阿霉素在二者中的含量，结果 见表２。
式中，Ｋ２是偶极空间取向因子，Ｎ是介质的折射指数．中为 给予体的荧光量子产率．Ｊ是给予体的荧光发射光谱与接受 体的吸收光谱之间的重叠积分。能量转移效率可用下式表示
Ｅ＝１
常数的影响，确定了药物与血清白蛋白之间的相互作用力．并根据Ｆ６ｒＳ憎非辐射能量转移理论求出给体爱
体问的结合距离ｒ＝４．２５ ｒ曲和能量转移效率Ｅ＝ｏ．０１８。叉进一步在生理条件下成功的测定了药物在血清 与尿样中的含量。 主题词盐酸表阿霉素；牛血清白蛋白；荧光猝灭法 中圈分类号：ｃｂ４４．１７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００—０５９３（２００３）０５—０９３７—０４ 子溶液；Ｏ ｐＨ＝７．４的Ｔｎ争Ｈａ缓冲溶液；实验
ｒｒｄ・Ｌ。１时．回归方程为：ｋ＝３．１５８ｃ（１０咱ｍｏｌ
・Ｌ－１）＋１６．６．ｒ＝０．９９２ ３，另取１１支１０ｍＬ的比色管配制
（６）
空白溶液，测得ｓｂ＝Ｏ．０６９ ９２，检测限ＤＬ““＝Ｏ．３９１
Ｌ＿。。
７“】ｇ・
式中．Ｒ。是转移效率为５０％时的ｌ临界距离．ｒ是给体与受体
Ｒ：＝８．８×１０。２５Ｋ２Ｎ。吖
２；ｆ＝ ２。
５；￡－３５℃时，Ｋ。＝２．１７×１０“，ｒ＝０．９９８
４５℃时，Ｋ。＝２．１６×１０”，ｒ＝０．９９９ ２．Ｏ×１０”（ｒｒｄ・Ｌ。１）
而各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为 ・ｓ叫【９］，显然，盐酸表阿霉紊对蛋白 质猝灭过程的速率常数远远大于扩散控制的Ｋ。，所以进一 步证实以上猝灭不是由于动态碰撞引起的．而是形成复合物 时引起的静态猝灭，故用静态猝灭公式”１ １／（Ｆ。一Ｆ）＝１／Ｆ０＋ＫＤ／（Ｆ０“Ｑ］） （２） 以１／（Ｆ０一Ｆ）～ｌ／［Ｑ］作双倒数图，见图３（ｂ），由图３（ｂ） 得盐酸表阿霉素与ＢｓＡ的结合常数Ｋ．（Ｋ“二１／Ｋ。）。ｆ＝ ２５℃时，Ｋ＾＝２．３４２×１０‘，ｒ＝０．９９８ ８；￡＝３５℃时，Ｋ＾
＝１．９９３×１０‘，ｒ＝０．９９９ １０‘．ｒ＝０．９９８ ３。
６；￡＝４５℃时，Ｋ．＝１．６３８×
可以看出，盐酸表阿毒素与血清白蛋白的结合常数较 大，且温度对结合常数Ｋ．影响较小，说明盐酸表阿霉素与 ＢｓＡ有较强的结合力，可以在体内被蛋白质所储存、转运。 ２．２共存＾子对药物与蛋白质形成常数的影响 由于金属离子与蛋白质确有一定的结合力“】．因此金属 离子的存在直接影响着药物与蛋白质的结合。为了进一步探 讨金属离子的存在对药物与蛋白质的结合力的影响。本文测 定了在多种金属离子存在下，不同温度时药物与ＢＳＡ的结合 常数，结果见表１。 金属离子与药物竞争的结果．减小了蛋白质与药物的结 合常数，一般减小１０％～４０％。这样便减小了药物与蛋白质 的结合力。 ２．３药榜与ＢｓＡ作用力的确定 药物与生物大分子的作用力包括氢键、范德瓦尔斯力、 静电引力、疏水作用力等。药物不同，与蛋白质的作用力类 型也不同。当温度变化不大时，反应焙变可以看作常数．由 式 ｌｒＬＫ２／Ｋ－＝（１／Ｔｌ—ｌ／Ｔ２）△Ｈ／尺
Ｆ／Ｆｎ
（８）
Ｆ和Ｆｎ分别为存在和不存在能量接受体时能量给予体的荧 光发射强度。 由公式（５）可得重叠积分Ｊ为４
２２６×１０。５ ｃｒＩｌｑ・Ｌ・
１铀ｋ
２．Ｄｅ蛔砷ｉ衄ｔｉ蚰删ｂ
ｉｎ鞠ｍｐｌ俗（ｎ＝３）
０ｆ
ｅｐｉｍ“ｄｎ
ｍｏｌ一。将参数Ｋ２＝２／３，Ｎ＝１．３６，ｍ＝０．１５““代人公式
（７）．可得Ｒ。＝２．１８ｍ。由公式（８）可求出能量转移效率￡
１
２ ｒＩ】ｏ卜Ｌ。１
引言
血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白．它能和许 多内源性物质相互作用“１。生物体内还存在许多微量元素和 宏量元素，它们也参与许多重要的生命过程，因此研究药物 与白蛋白及金属离子的相互作用具有重要的意义”Ｊ。盐酸表 阿霉紊是新一代的葸环类抗肿瘤药物’３ Ｊ，具有传统柔红霉素 及阿霉素的高效、广谱的特点，但其耐受性远远优于后两 者．尤其在心脏毒性和骨髓抑制方面，毒性较其它葸环类抗 肿瘤药物明显降低，大大提高了安全性。但是，其用量仍需 要严格控制，尤其是肝功能不全者。因此，研究盐酸表阿霉 素与蛋白的作用机理及其含量的测定在临床医学及药厂生产 等方面具有重要意义。对盐酸表阿霉素的分析测定有 卜Ⅱ，Ｌｄ“法、电致发光法”Ｊ、伏安法”１的报道。本文首次应用 荧光光谱法对其进行了研究。
二０．０１８，进而可求得药物分子与蛋白质残基的距离ｒ＝
４ ２５
ｒｌｒＴｌ。
２．５盐酸衰阿霉素的测定
２
５．１测定方法
１０
ｍＬ比色管中依次加入１ ｍＬ Ｔｎ５－Ｈａ缓冲溶液．
参
考
文
献
［１］杨频生物无机化学导论西安：西安交通大学出版社，１９９１ Ｌ
２］Ｈ＾Ｎ‰ｚｈｕ．ｕｕＹｕｎ－垴（韩国柱，刘云海）Ｐｍｇ㈣ｎ Ｂｊｏ崦ｉｃａｌ ＳｃＩｅｎｃｅ（生物科学进展），１９９７：２８０
ＢＳＡ
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№．４
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（１）ｗｉｔｈｔｌ．ｅ 的重叠积分
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定。 ２．５．３精密度和栓洲限和工作曲线 取１１支１０ ｎ１Ｌ的比色管按实验方法配制溶液，固定盐 酸表阿霉素的浓度为２．０×１０’６ ｍｏｌ・Ｌ．测得其相对标准
【３］王汝龙，原正平药物（第三版）北京：化学工业出舨社，１９９９：２６６
万方数据
光谱学与光谱分析
［４］ ［５］ ［６］ Ｆ砘ｌｌ Ｓ，Ｉ）。Ｔｌ幅ｉ Ｒ．Ｉｎｎｏｃ叭ｔｉ
Ｆ
第２３卷
Ｔｈ叮Ｄｎ培Ｍ０ｎｉｔ，１９９９，２１（３）：３６７
ＹｕＨ血ｅｔ
陋Ｐｉｎ＿ｇａｎｇ，ＬｌＵＸｉａｎｇｍｎｇ，
１０６２
△Ｇ＝△Ｈ—Ｔ△Ｓ＝一ＲＴｌｎＫ
（３）
（４）
ｚ
可求得△Ｈ．△Ｇ，△ｓ（△Ｇ为自由能，△ｓ为熵变）。△Ｈ
一１２．３
ｋＪ・ｒＩ】０ｌ－１，△ｓ＝４２．３ Ｊ・Ｋ・ｍｏｌ～，当△Ｈ＜０，△ｓ
＞０时，认为药物与ＢｓＡ之间的作用力主要为静电引力“…。
ｌ／ｆｐ＂ｌｏ‘５（ｍ０Ｊ Ｌ
ｂ‘
２．４盐ｔ寰阿霉素在瑙Ａ上结合位置的探讨
ｄ（何品剐，刘祥萍，余慧等）ｃＫｎｅｓｅ Ｊ
ｏｆＡｄ
ｃｈ目ｎｌ砒ｒｙ（分析化学），２０００，２８（９）
ＹＡＮ６ Ｚｈｊｔｅ，ＬＩＵ （４）：４７１
Ｓ｝ｌ舶ｇ－ｈｕｉ
ＹＥ
Ｊ；ａ１１．ｒ啪ｇ吼ｄ（杨志杰，刘盛辉，叶建农等）ｃＫｎｅｓｅ Ｊ ｏｆＡ商ｃｈ哪・ｎ珂（分析化学）．１９９６，２４
７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４
ｃｙ五ｌ Ｌ，Ｅｄ ＪＫ，鄂蜘ｙｗＭ
Ｉｒｖｌｎｇ １９８７ Ｈ
Ｂｏｃｈ卧ｉ如Ｈａｎｄｂ诎，ｋ幽ｏｘｈｄ：Ｅ＆ＦＮＥｐ∞Ｌ七ｄ Ｐｒ髑，１９６１，８３
Ｔ Ｓ
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Ｂｉ。ｃｈｄＴｌｉｎｒｙ，１９７７，１６（２３）：５１００ Ｙｏ出：Ｐｋｎｕｍ
Ｐｒ鹊，１９８３
Ｍ
Ｈ
Ｎ，Ｆ托吕ｅｒ Ｈ，ｗ∞ｔ
万方数据
９３８
光谱学与光谱分析
第２３卷
荧光强度有规律的降低（发射峰的峰位Ａ咖＝３４４ ｎｍ和峰形 不变），见图２，说明盐酸表阿霉紊与ＢｓＡ形成复合物而使 ＢｓＡ的荧光猝灭。
从图３（ａ）可以看出，曲线有良好的线性关系．且随着温 度的升高，ＢｓＡ的猝灭曲线的斜率降低，可初步证明此过程 为静态猝灭。为进一步证实其猝灭过程．把此过程按动态猝 灭处理，猝灭方程为”Ｊ Ｆ０／Ｆ＝ｌ＋Ｋ。ｆｏ［Ｑ］＝１＋Ｋ。［Ｑ］
收稿日期：２００２
０３
浆拶
ＮＨ３
Ｆ．ｇ．１
Ｓｌｎｌ咖ｍ ｏｆ
ｅｐｉｍＭｄｎ
２结果与讨论
２．１
ＢｓＡ与盐酸裹阿霉素结合常数的求取 蛋白质中色氨酸的存在使其具有内源荧光。在ＢｓＡ浓度
一定的条件下，随着盐酸表阿霉素浓度的增加，ＢｓＡ的内源
１１．修订日期：２００２。０７ ２２
怍者筒介：江崇球。１９４４年生，山东师范大学化学系教授
２ｍＬ
Ｎａａ溶液，一定体积的药物，在＾一卧＝５００／５５０ ｎｍ下
测其荧光强度。 ２．５．２实验条件的优化 蛋白质的最大发射波长为＾曲＝３４４ ｎｒｎ，而盐酸表阿霉
∞ｕ１８ｉ
素的最大发射波长为Ａ锄＝５５０ ｎｒｎ，可见二者的最大发射波 长相差较大，因此在＾帅＝５５０ ｎｍ处，蛋白质的存在不影响 盐酸表阿霉素的测定。实验结果表明：温度在２５～４５℃之 间，离子强度Ｉ在Ｏ～１．Ｏ之间，对其荧光强度几乎没有影 响。本文选在室温，ｆ＝０．１，ｐＨ＝７．４的生理条件下进行测
（１）
式中，Ｋ。为双分子猝灭过程的速率常数，Ｋ，为动态猝灭常 数，ｒｏ为猝灭体不存在时分子的平均寿命，［Ｑ］为猝灭剂的 浓度，而Ｋ，＝Ｋ。ｒｏ，Ｋ。＝Ｋ。／ｒｏ。由于生物大分子的荧光 寿命约为１０一ｓ－８Ｊ，故可由猝灭曲线的斜率求出猝灭常数Ｋ。 （单位：（ｒ∞ｌ・Ｌ－１）
＝０．９９８
・ｓ－１），产２５℃时．Ｋ。＝２．３０５×１０“，ｒ
ｉ电．３
ｓｔｅｒｍＶ曲眦ｒ删ｒｖ葛（ａ）ａｎｄ
ＵｍｍｍＢｌＦｋⅧｒｖｓ（ｂ）
根据Ｆ黼ｅｒ提出的偶极一偶极非辐射能量转移理