低氧预适应对光损伤小鼠视网膜感光细胞保护作用的研究

青岛大学硕士学位论文低氧预适应对光损伤小鼠视网膜感光细胞保护作用的研究姓名：张跃红申请学位级别：硕士专业：眼科学指导教师：牛膺筠20050530低氧预适应对光损伤小鼠视网膜感光细胞保护作用的研究摘要目的研究低氧预适应（ｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）对光损伤后小鼠视网膜感光细胞的保护作用，并探讨其可能的基因调控机制。

方法将５４只ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠随机分成单纯光照组、低氧预适应组和正常对照组，其中前两组又各自分出６ｈ、１２ｈ、３６ｈ和７ｄ四个亚组，每个亚组各６只小鼠。

将单纯光照组和低氧预适应组小鼠在自制光照箱中连续光照３小时，制成光损伤动物模型。

应用光镜观察并对比各组视网膜感光细胞层形态及厚度的差异；应用免疫组织化学染色法比较ｃ—ｆｏｓ和ｃａｓｐａｓｅ—ｌ在各组感光细胞层阳性表达数量的差异。

结果①正常小鼠视网膜组织结构层次清楚，内节和外节排列整齐，外核层细胞排列规则，染色均匀；光照后小鼠视网膜感光细胞层出现了光损伤，且随着光照后时间的延长损伤加重，主要表现为不同程度的外节空泡样变，内外节排列紊乱，外核层变薄，出现核浓染及不规则细胞核，其中光照后１２，３６ｈ和７ｄ亚组外核层厚度与正常组比较差别ｐ＜Ｏ．０１，有统计学意义，而其他各层细胞形态和分布无变化：低氧预处理组感光细胞层得到了保护，其外核层厚度与正常组比较无明显变化，细胞形态和排列明显优于单纯光照组；②ｃ—ｆｏｓ在正常视网膜中无阳性表达：单纯光照后６ｈ，外核层有大量ｃ—ｆｏｓ阳性细胞表达，且此时表达达到最高峰，单纯光照后１２和３６ｈ虽也有阳性表达，但呈现递减的趋势，而在单纯光照后７ｄ，基本检测不到阳性细胞：低氧预处理组表达规律基本同单纯光照组，两组比较差别ｐ＞Ｏ．０５，无统计学意义；⑨ｃａｓｐａｓｅ一１在正常视网膜中无阳性表达；单纯光照后６ｈ开始出现少量表达，以后随着时间的推迟表达增加，光照后７ｄ表达达到最高峰：低氧预处理组光照６和１２ｈ后，外核层均未见到ｃａｓｐａｓｅ一１的阳性表达，至光照３６ｈ后才有少量表达。

与单纯光照组相比，６ｈ和１２ｈ亚组差别ｐ＜Ｏ．００４，３６ｈ和７ｄ亚组差别ｐ＜Ｏ．０１，均有统计学意义。

结论①低氧预适应通过抑制凋亡相关基因的表达而对感光细胞有神经保护作用：②ｃａｓｐａｓｅ一１参与了低氧预适应的保护机制。

硕士研究生张跃红（眼科学）指导教师牛膺筠教授关键词：低氧预适应；光损伤；感光细胞；凋亡；组织化学；ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠目录Ｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇａｇａｉｎｓｔｌｉｇｈｔ—ｉｎｄｕｃｅｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ０ｂＪｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｉｎｐｈｏｔｉｃｉｎｊｕｒｙｍｉｃｅａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｇｅｎｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ５４ＢＡＬＢ／Ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｓｉｍｐｌｅｌｉｇｈｔ—ｉｎｄｕｃｅｄｇｒｏｕｐ（ＳＬ），ｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（ＨＰ）ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ＣＯＮ）．６ｈ、１２ｈ、３６ｈａｎｄ７ｄ“ｆｏｕｒｓｕｂ—ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｇｏｔｆｒｏｍＳＬａｎｄＨＰｇｒｏｕｐｓｅｐａｒａｔｅｌｙ．ＴｈｅｍｉｃｅｏｆＳＬａｎｄＨＰｗｅｒｅｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙｅｘｐｏｓｅｄｔｏｌｉｇｈｔｆｏｒ３ｈ，ｗｈｉｃｈｂｕｉｌｔｍｏｄｅｌｏｆｌｉｇｈｔ—ｉｎｄｕｃｅｄｄａｍａｇｅ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｉｃｋｎｅｓｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｉｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｒｏｕｐｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ。

Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｐｒｅｅｓｉｏｎｏｆｃ－ｆｏｓａｎｄｃａｓｐａｓｅ一１ｇｅｎｅｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄ．ｔ－ｃｈｅｃｋａｎｄｌｉｎｅａｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｄｅａｌｗｉｔｈｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ＠Ｔｈｅｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃｆｉｎｄｉｎｇｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｈａｄｃｌｅａｒｌａｙｅｒｓｏｆｒｅｔｉｎａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｏｕｔｅｒｎｕｃｌｅａｒｌａｙｅｒｓｗｅｒｅｎｅａｔｌｙａｒｒａｎｇｅｄａｎｄｔｈｅｄｙｉｎｇｗａｓｃｌｅａｒ．Ｔｈｅｏｔｈｅｒｌａｙｅｒｓｈａｄｎｏｏｂｖｉｏｕｓｃｈａｎｇｅｓ．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒｓｇｒａｄｕａｌｌｙｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｅｄｕｎｄｅｒｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ１ｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｔｈｅｍａｉｎｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｏｕｔｅｒｎｕｃｌｅａｒｌａｙｅｒｂｅｃａｍｅｔｈｉｎｎｅｒａｎｄｓｐａｒｓｅｒ．Ｔｈｅｏｕｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｏｐｔｉｃｒｏｄｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓｗｅｒｅｉｎａｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄｐａｔｔｅｒｎａｎｄｙｅｓｉｃｕｌａｔｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｇｒｅｅ，ｗｈｉｌｅｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｔｉｎａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐ；②Ｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｒｅｔｉｎａ。

ｃ－ｌｏｓｗａｓｎｅｇａｔｉｖｅ．Ａｇｒｅａｔｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｎｕｍｂｅｒｓａｐｐｅａｒｅｄｉｎｏｕｔｅｒｎｕｃｌｅａｒｌａｙｅｒ６ｈａｆｔｅｒ１ｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅａｎｄｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｌｉｇｈｔｉｎｊｕｒｙｒｅａｃｈｅｄｉｔｓｐｅａｋ．Ｔｈｅｒｅｗａｓｓｔｉｌｌｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ１２ｈａｎｄ３６ｈａｆｔｅｒｌｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅ，ｗｈｉｃｈｄｅｃｒｅａｓｅｄｇｒａｄｕａｌｌｙ．Ｎｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｆｏｕｎｄ７ｄａｆｔｅｒ１ｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅ．ＴｈｅｓａｍｅｒｅｇｕｌａｒｉｔｙａｐｐｅａｒｅｄｉｎＨＰｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（ｐ＞０．０５）ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅＳＬｇｒｏｕｐａｎｄＨＰｇｒｏｕｐ；③Ｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｒｅｔｉｎａ，ｃａｓｐａｓｅ一１ｗａｓｎｅｇａｔｉｒｅ．Ａｆｅｗｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓａｐｐｅａｒｅｄｉｎｏｕｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔ６ｈａｆｔｅｒｌｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅ．Ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｄａｓ目录ｔｉｍｅｏｆ１ｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅａｃｈｅｄｉｔｓｐｅａｋ７ｄａｆｔｅｒｉｉｇｈｔｅｘｐｏｓｕｒｅ．ＮｏｐｏｓｉｔｉｒｅｅｘｐｒｅｓｓｉＯｉｌ６ｈａｎｄ１２ｈｓｕｂ—ｇｒｏｕｐｉｎＨＰ．Ａｓｍａｌｌｑｕａｎｔｉｔｙｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｗａｓｆｏｕｎｄｉｎ３６ｈｓｕｂ—ｇｒｏｕｐ．ＴｏｃｏｍｐａｒｅＳＬｗｉｔｈｔｔＰ，ｃａｓｐａｓｅ一１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒ（ｐ＜Ｏ．０１）Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ①Ｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｈａｓｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｅｆｆｅｃｔｏｎｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｓｂｙｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ—ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｍｉｃｅｐｈｏｔｉｃｉｎｊｕｒｙｍｏｄｅｌ：②Ａｎｄｃａｓｐａｓｅ－ｉｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｍｅｃｈａｎｉＳｍ．ＰｏｓｔｇｒａｄｕａｔｅＺｈａｎｇＹｕｅｈｏｎｇ（ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ）ＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＮｉｕＹ虹西ｕｎＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｙｐｏｘｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ；ｐｈｏｔｉｃｉｎｊｕｒｙ；ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌＬ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；ＢＡＬＢ／Ｃｍｉｃｅ低氧预适应对光损伤小鼠视网膜感光细胞保护作用的研究引言当可见光的强度和持续时间超过视网膜承受限度时，会引起视网膜感光细胞的凋亡，并促进视网膜变性及年龄相关性黄斑变性等疾病的发展“１。

各国学者虽致力于光损伤防治的研究，但由于血一视网膜屏障的限制，目前仍未发现防治该类疾病有效的方法。

本研究建立小鼠光损伤动物模型来模拟视阏膜感光细胞退行性变性，并采用低氧预适应这种不受视网膜屏障限制的特殊方法探讨其是否对视网膜感光细胞变性起保护作用及其可能的基因调控机制。

低氧预适应是指机体预先经受１次或多次短暂，非致死性低氧刺激后，再恢复常氧状态，而获得的对更严重甚至致死性损伤的耐受性。

１９８６年Ｍｕｒｒｙ［２】等在研究犬的心肌缺血时首先发现了这种内源性保护现象。

在随后的２０年里，人们逐渐认识到低氧预适应还广泛存在于肝、脑、肾、视网膜等多种组织和器官。

但长期以来，人们对低氧的防治仍停留在供氧或氧疗等措旆上。

实际上，机体对于低氧有着很大的耐受性，因此，应该充分调动组织细胞耐受低氧的潜能，从而在低氧条件下使组织细胞保持生命活动能力。

近年来用药物造成轻度缺氧以诱发中枢神经系统的缺氧耐受性从而产生化学缺血预适应在临床应用最为典型，如已在临床使用的阿司匹林是具有化学缺血预适应作用的典型药物；又如，对于临床低氧症患者可以通过降低体温或注射低氧敏感成分的激动剂等对脑组织产生耐受性的措施进行抢救或治疗。

因此，我们对低氧预适应这一现象进行研究，旨在揭示低氧预适应对视网膜的保护机制，寻找相关的抗低氧神经活性物质，并制成抗低氧的体内生物制剂，从而为治疗视网膜变性疾病寻找到新的方法。

一——．．塑型墨查鲨一１．材料与方法１．１实验动物与分组实验用动物为５４只健康成年近交系ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，体重为１２－－２０９，购自山东医科大学动物实验中心，雌雄兼用，动物基因背景为Ｒｐｅ６５４５０Ｌｅｕ，对光损伤具有高度敏感性。

将动物随机分为单纯光照组（２４只）、低氧预适应组（２４只）和正常对照组（６只）３组。

其中前两组按光照卮处死时间的不同又各自分出６ｈ、１２ｈ、３６ｈ和７ｄ四个亚组，每个亚组各６只小鼠，１２只眼球。

１．２主要仪器设备及试剂１．２．１主要实验仪器（１）ＯＬＹＭＰＵＳ光学显微镜日本（２）ＯＰＴＯＮＶＩＤＡＳ图象分析仪德国（３）切片机日本（４）恒温水浴箱上海医疗器械厂（５）微量注射器１】『Ｙ００８８—９２上海医用激光仪器厂（６）烤箱德国Ｍｅｍｍｅｒｔ公司（７）显微摄像系统日本１．２．２主要试剂（１）ｃ－ｆｏｓ兔ＩｇＧ多抗美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司（２）ｃａｓｐａｓｅ－１兔ＩｇＯ多抗武汉博士德公司（３）生物素化山羊抗兔抗体美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司（４）ＳＰ免疫组化试剂盒美国Ｚｙｍｅｄ公司（５）ＳＡＢＣ免疫组化试剂盒武汉博士德公司（６）ＤＡＢ显色试剂盒北京中山生物技术有限公司（７）Ｐｏｌｙ—Ｌ－Ｌｙｓｉｎｅ粘片剂北京中山生物技术有限公司１．３动物模型１．３．１自制光照箱箱高１米、宽０．５米，８根灯管（光照强度为５８００一７２００ＬＵＸ，约６０００ＬＵＸ）置于箱四壁，使小鼠在每个角度受到的光照强度均匀一致。