基础生物化学实验-离子交换层析
离子交换层析讲解
三、离子交换剂的种类和性质 1.离子交换剂的基质
• 其中：聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以
苯乙烯和二乙烯苯合成的具大、流速快。但它与 水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变 性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、 核苷酸等。 以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚 糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交 换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子 物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50 为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基 质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
离子交换层析
原理及应用
一、简介
• 1、定义：
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换 剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力 大小的差别而进行分离的一种层析方法
2、发展历程
• 1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交
二、基本原理 阴离子交换
• 通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子
强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加， 洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上 的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置 换出来，随洗脱液流出。 与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来， 而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度 才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与 离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下 来，从而达到分离目的。
X+ Y-↔ A-
二、基本原理
• 从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交 •
离子交换层析法
五、缓冲液的选择
缓冲液酸碱度的选择，决定于被分离物质的等电点、稳定 性、溶解度和交换剂离子的pK值。使用阴离子交换纤维时要选 用低于pK值的缓冲液，若欲分离的物质属于酸性，则缓冲液的 pH值要高于该物的等电点；用阳离子交换纤维时要选用高于 pK值的缓冲液，目的物属于碱性物质的话，缓冲液要低于该物 等电点的pH值。 缓冲液离子以不干扰分离物活性测定、不影响待测物溶解 度、不发生沉淀为原则，如使用UV吸收法测样品，那么 pyridine或barbital这类会吸收UV的物质就不适用。
三、树脂的选择
最常见的离子交换树脂材质是聚苯乙烯苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene）， 它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯 （divinylbenzene）聚合产生的三维网状结 构，举例来说，Dow化学公司所生产的树脂 Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。 具体的，根据交换树脂的性能，树脂可分 为阳离子与阴离子交换树脂：
1. 阳离子交换树脂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型树脂含有－R－ SO3H，中强酸型树脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2， 弱酸型树脂含有－COOH或－OH。 阳离子交换树脂进行的反应 如下：
2. 阴离子交换树脂 分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有铵盐，四级铵盐 [ － N+(CH3)3] 为强碱型树脂，三级以下铵盐 [－N(CH3)2]、[ － NHCH3]、[ －NH2] 都属弱碱型树脂；同时具有强碱和弱碱型基 团的，为中强碱型的树脂。阴离子交换树脂进行的反应如下：
洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可 逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适 宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目 的物的位置，并回收目的物。
离子交换层析法
离子交换层析法一、原理离子交换层析法是从复杂的混合物中，分离性质相似大分子的方法之一，依据的原理是物质的酸碱性、极性，也就是所带阴阳离子的不同。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
二、方法与步骤：1.实验试剂与仪器：可溶性蛋白质溶液、TB缓冲液、NaCl溶液、乙醇、去离子水，层析柱、移液器、尼龙纱布、离子交换剂......2.实验步骤（1）装柱：取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子;用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水;取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，用去离子水冲洗填料5个柱体积;（2）柱的平衡与上样：用0.02M TB bufferA缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6;对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合;（3）洗杂蛋白：用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;分别用含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL 的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL、40mMNaCL、60mMNaCL、80mMNaCL、100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（4）解离目的蛋白（洗脱）：分别用含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL、200mMNaCL、500mMNaCL、1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测;（5）柱的清洗与保存：用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液(PH7.6)以冲洗层析柱，共冲洗30ml;用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml;用过滤去离子水冲洗50ml;用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
离子交换柱层析原理
离子交换层析介质得应用离子交换层析分离纯化生物大分子得过程,主要就是利用各种分子得可离解性、离子得净电荷、表面电荷分布得电性差异而进行选择分离得。
现已成为分离纯化生化制品、蛋白质、多肽等物质中使用最频繁得纯化技术之一。
离子交换层析(IｏｎExcｈａnｇｅChromatｏgraphｙ简称为IＥC)就是以离子交换剂为固定相,依据流动相中得组分离子与交换剂上得平衡离子进行可逆交换时得结合力大小得差别而进行分离得一种层析方法。
离子交换层析就是目前生物化学领域中常用得一种层析方法,广泛得应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等得分离纯化。
1、离子交换层析得基本原理:ﻫ离子交换层析就是通过带电得溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化得方法,也可以认为就是蛋白质分子中带电得氨基酸与带相反电荷得介质得骨架相互作用而达到分离纯化得方法。
离子交换层析法主要依赖电荷间得相互作用,利用带电分子中电荷得微小差异而进行分离,具有较高得分离容量。
几乎所有得生物大分子都就是极性得,都可使其带电,所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子得分离、中等纯化及精制得各个步骤中。
由于离子交换层析法分辨率高,工作容量大,并容易操作,因此它不但在医药、化工、食品等领域成为独立得操作单元,也已成为蛋白质、多肽、核酸及大部分发酵产物分离纯化得一种重要得方法。
目前,在生化分离中约有75%得工艺采用离子交换层析法。
2、离子交换层析介质:离子交换层析得固定相就是离子交换剂,它就是由一类不溶于水得惰性高分子聚合物基质通过一定得化学反应共价结合上某种电荷基团形成得。
离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团与平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电得可进行离子交换得基团。
平衡离子就是结合于电荷基团上得相反离子,它能与溶液中其它得离子基团发生可逆得交换反应。
平衡离子带正电得离子交换剂能与带正电得离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电得离子交换剂与带负电得离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。
离子交换层析法的原理
离子交换层析法的原理
离子交换层析法是一种根据物质带电性质差异，从而实现分离纯化的层析技术。
该方法的原理是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离的各种蛋白质结合力的差异，而将混合物中不同蛋白质进行分离。
离子交换的本质是目标物和介质功能配基之间的静电相互作用，蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的，而蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。
层析时，离子交换树脂的分子中有活性基并带有阴、阳电荷，在水溶液中可与其它阴、阳离子起交换作用，这种交换作用是可逆的，遵循化学平衡原理。
通过连续添加洗脱液，溶液平衡向右进行，可以把原有离子交换树脂上的活性离子洗脱下来，而带有相同电荷的离子被交换吸附在树脂上，然后被吸附的物质又可用另一种洗脱液洗下来，从而达到分离提取的目的。
离子交换层析
离子交换层析在各方面的应用离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。
在生物化学及临床生化检验中主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。
【2】2009年方希修，王冬梅等人应用平板式膜超滤技术与DEAE高子交换层析法对卵黄免疫球蛋白(IgY)进行分高纯化，经DEAE离子交换层析得到高纯度的IgY。
【4】2010年马江涛、陈昕等人使用Bio—Rad的DiaSTAT糖化血红蛋白检测系统(LPLC)和Biosystem.S.A的微柱离子交换层析法分别测定糖化血红蛋白，并进行精密度、网收率、干扰闪素及相关性的比较分析,证明了离子交换层析法测定糖化血红蛋白的方法适合临床常规应用。
【5】2010年蒋超，张或等人用超滤、阳离子交换层析方法从热钙法处理过的干酪乳清中分离纯化乳铁蛋白，其纯度达93.6%。
近年来，随着合成技术的发展和生产的需要，人工合成的刚性材料被陆续开发出来，这也是未来离子交换介质发展的一个趋势。
1.层析分离纯化家兔血清PONl条件的优化代恒、赵敏等人报道，Paraoxonase(PONl)是--个钙离子依赖的酯酶，它可以水解包括有机磷类，芳香酯类在内的多种化合物。
作为一种生物酶，PONl 可以在普通的生物环境下将有机磷类毒剂迅速水解，使之分解为无毒或低毒的化合物。
存在于血清中的PONl，可达到在有机磷毒物到达它的生物受体之前将其清除的目的。
在本研究中，使用Cibacron Blue F3GA琼脂糖的假亲和层析得到初步分离富含PONl的Cibacron流分，选定DEAE Sepharose Fast Flow为离子交换层析介质，通过AKTA purifier全自动层析仪，在PH值分别为7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，9．5条件下对Cibacron流分进行离子交换层析。
离子交换层析
子构成的!!基质与电荷基因以共价键连 接!!电荷基因与反离
子以离子键结合？？
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以
离子交换方式进行!!假设以RA+代表阳离子交换剂!!其中A+为
反离子!!A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应!!反
应式为：RA++B+
RB++A+
离子交换色谱中所进行的离子交换过程【以阳离子交换树脂为例】
㈡ 交联度和网孔结构
交联度的大小影响着离子交换剂的很多特 性!!包括机械强度、膨胀度、网孔大小、 交换容量等？？
一般交联度越高!!网孔的孔径越小!!交联度 越低!!网孔孔径越大？？仅琼脂糖交换剂 是例外.
㈡ 交联度和网孔结构
分离介质的孔有三种结构？？第一种通过交联 使大分子链间形成孔!!这叫凝胶孔？？
离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机 离子或生物大分子物质分开!!其主要依据是离子交换剂对 各种离子或离子化合物有不同的结合力？？
氨基酸的离子交换分离原理
8
What happens in ion exchange?
Equilibration
anion exchange
bead
+-- ++--+++---
两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离 子交换剂的结合力!!主要取决于它们的物理化学性质和在 特定pH条件下呈现的离子状态？？当pH低于等电点【pI】 时!!它们带正电荷能与阳离子交换剂结合!!反之!!pH高于 pI时!!它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 ？？pH与pI 的差值越大!!带电量越大!!与交换剂的结合力越强？？
阴离子交换层析原理
阴离子交换层析原理
阴离子交换层析是一种常用的色谱分离技术，其原理是利用固定在固定相上的阴离子交换剂与待分离物质中的阴离子之间的相互作用来实现物质的分离。
在这种技术中，固定相通常是一种带有阴离子交换基团的树脂，而移动相则是一种能够与阴离子交换剂竞争结合的离子溶液。
在进行阴离子交换层析时，待分离物质首先被溶解在移动相中，并注入到固定相柱中。
由于固定相上的阴离子交换剂具有一定的亲和性，它们会与待分离物质中的阴离子发生竞争性结合，从而使得不同阴离子之间发生分离。
随着移动相的不断流动，不同的阴离子将会以不同的速率被释放出来，从而实现它们的分离。
在实际的应用中，阴离子交换层析技术通常被用于分离和富集水中的阴离子物质，比如离子色谱法中常用的氯离子、硝酸盐离子、磷酸盐离子等。
此外，阴离子交换层析技术还可以应用于生物化学领域，用于分离和富集蛋白质、核酸等生物大分子中的阴离子物质。
总的来说，阴离子交换层析技术是一种简单、快速、高效的分离技术，具有广泛的应用前景。
通过对其原理的深入理解和实际操作的掌握，可以更好地应用于实际的科研和生产中，为我们的工作带来更多的便利和效益。
生物化学实验-离子交换层析
1、仪器连接
AB
开关
A、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓
冲液
B、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（0.5
mol/L NaCl） pH7.3缓冲液 1.接通各仪器电源，将A,B泵头分别放置
A，B两个溶液瓶中。注意B为含NaCl溶
液。1：缓冲液阀（Buffer valve） 2. 点2：击混电和脑器桌（面M上ixUenri）corn软件图标，打 开软3：件样。品选阀择（SySsatemmplCeovnatrlovel ，）点击OK ，进4：入泵操（作P界u面m。p）点击Connect 3. 在5：操压作力界传面感的器工（具P栏re，ss点u击reMannual Rusne。n出so现r）FlowRate 窗口，调节flowrate 为 61：ml清/m洗in，阀确（定Wa。sh valve）
Wash valve Collector
（1）连接混和器及样品阀，流速调整为1.0ml/min （2）切换至BufferB，直至Conductivity到达40mS/cm （3）连通BufferA，直至Conductivity接近2并平稳 ，准备装柱
3、装柱和平衡： （1）检查层析柱的两端接头，底端有膜的置于下方。 （2）程序暂停。将层析柱放入卡槽，上端接头与混合器（mixer) 相连，下端接头与样品阀（sample valve)相连。
实验器材与仪器
1、高速冷冻离心机 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组） 3、ÄKTATM start（1套/组） 4、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） 5、－20℃冰箱（保存样品用） 6、微量移液枪 200ul、1000ul 7、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用） 8、7ml离心管（留样品Ⅳ用） 9、恒温水浴（50℃、100℃） 10、试管、移液管、试管架等
离子交换层析原理
简介离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。
本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。
50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。
目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
基本原理离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。
离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。
离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。
平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。
也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。
离子交换层析分离核苷酸的实验方法
ｍｏ／ ｌＬ甲酸 ； ． １ｍｏ／ 甲酸一． ５ ｍｏ／ 甲酸钠 溶 ０ ０ ｌＬ ０ ０ ｌＬ
液 （ Ｈ４ ４ ） ０ １ｍｏ／ 甲 酸一． ｌＬ 甲酸 钠 溶 液 ｐ ． ４ ；． ｌＬ ０ １ｍｏ／ （ Ｈ３ ７ ） ０ ２ｍｏ／ 甲 酸 一． ｌＬ 甲 酸 钠 溶 液 。 ｐ ． ４ ；． ｌＬ ０ ２ｍｏ／ 化 学试剂 均为分 析纯 。
了学 生 的综 合 实验 能力 。 关键词 ： 核苷 酸 ； 碱 型 阴离 子交 换 树 脂 ；阶段 洗 脱 ； 度洗 脱 强 梯
中 图分 类 号 ：Ｑ５３ —３ 文 献标 志 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ：１ ０ —９ ６ ２ １ ） ３ ０ ２ ４ ０ ２４ ５ （ ０ １ ０ —０ ３ —０
内容 。
物 ， 们 在 医药得 到 了广 泛 的 应 用 ［ １ １ 。核 苷 酸 的 生 产 方 法 有 很 － ２
多 ｒ ， 子 交 换 层 析 法 是 普 遍 应 用 中 的 主 要 分 离 纯 ３ 离 ］ 化 方 法 。 离子交换 层析法是 分离生物 大分子有 效而 常用 的
Ｉｖ ｓｉａｉｎｏ ｈ ｘ ｅｉ ｎａ ｔｏ ｂ ｕ ｎ ｅ ｃ ａ ｇ ｎ ｅｔ ｔ ｆｔｅｅ ｐ ｒ ｇ ｏ ｍｅ ｔｌ ｍｅｈ ｄａ ｏ ｔｉ －ｘ ｈ ｎ ｅ ｏ
ｃ ｒｍａｏ ｒｐ ｙｆｒｉ ｌｔ ｇｎ ｃ ｏｉｅ ｈｏ ｔｇａ ｈ ｏａｉ ｕ ｌ ｔ ｓ ｏ ｓ ｎ ｅ ｄ
（ 京 大 学 生 命 科 学 学 院 ，北 京 １ ０ ７ ） 北 ０ ８ １
摘
要： 对传 统 的离 子 交换 层 析 分 离 单 核苷 酸实 验 方 法进 行 改 革 和 创 新 。以强 碱 型 阴 离 子 交 换 树 脂 、 用 梯 采
离子交换层析的纯化原理
离子交换层析的纯化原理离子交换层析是一种常用的分离纯化技术，它基于离子交换作用原理，通过离子交换树脂将混合物中的离子进行吸附和释放，从而实现对目标离子的纯化。
离子交换层析在生物分子的分离纯化、水处理、药物纯化等领域具有广泛的应用。
离子交换层析的纯化原理包括离子的吸附和释放步骤，具体过程如下：1. 吸附阶段：在离子交换层析中，选择具有离子交换基团的树脂作为固定相，常见的有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂。
在混合物中，选择性地吸附目标离子，其他离子则通过树脂层析柱。
当混合物溶液通过层析柱时，目标离子与离子交换基团发生静电作用，被吸附在树脂上。
吸附过程可通过控制pH值、离子浓度和离子交换柱的选择来实现。
2. 洗脱阶段：吸附在树脂上的目标离子可以通过改变溶液性质来实现释放。
这可以通过改变pH值、离子浓度或添加竞争性离子等方式来实现。
当采用酸性洗脱时，通过调节pH值，使目标离子与交换基团结合的静电作用减弱或破坏，从而使目标离子从树脂上解吸下来。
类似地，碱性条件下发生的酸洗脱也可以通过调节pH值实现目标离子的解吸。
此外，还有一些特殊洗脱方法，如温度调控法、浓度梯度洗脱法等。
离子交换层析的纯化原理主要包括两个方面：选择性吸附和静电作用。
1. 选择性吸附：离子交换树脂的交换基团具有特定的亲和性和选择性，可以选择性地吸附目标离子。
交换基团通常是带电的官能团，如硫酸树脂的交换基团为SO3-，对应着可吸附阳离子。
这些交换基团与离子之间通过静电作用或化学键形成吸附结合，从而实现离子的选择性吸附。
通过调节交换基团的类型和性质，可以选择性吸附不同类型的离子。
2. 静电作用：离子交换主要通过静电作用来实现离子与交换基团的结合和解离。
当目标离子与交换基团发生静电作用时，会产生电荷之间的相互作用力。
离子交换树脂通常带有正电荷或负电荷，吸附的离子通常与树脂的电荷相反。
当pH值适当时，离子交换层析系统中溶液中的目标离子与交换树脂之间会出现较大的静电吸引力，从而实现目标离子的吸附。
离子交换层析的原理
离子交换层析的原理离子交换层析（Ion-Exchange Chromatography，简称IEC）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法。
该方法基于弱酸性或弱碱性的高分子吸附物质与带电离子之间的相互作用，利用其选择性地吸附、分离和纯化带电离子。
在吸附步骤中，样品溶液通过含有离子交换基团的固相介质（通常是高分子树脂）时，带电离子与固相介质表面的离子交换基团发生相互作用。
对于阳离子交换树脂，固相表面上的阴离子交换基团可以与带正电荷的离子结合，而对于阴离子交换树脂，固相表面上的阳离子交换基团可以与带负电荷的离子结合。
吸附度取决于样品中离子的电荷性质、离子交换基团的性质和浓度，以及环境条件（如pH、温度等）。
洗脱步骤是将在固相上吸附的离子从固相上解离出来，通过改变洗脱溶剂的性质或浓度来实现。
这种方法基于洗脱溶剂中的离子与固相上吸附的离子进行竞争吸附，使被吸附的离子被替换出来。
常用的洗脱溶剂包括反离子和酸碱溶液。
阳离子交换层析主要适用于分离和纯化带正电荷的生物大分子，如蛋白质和多肽。
这种层析材料通常含有阴离子交换基团，如羧基（-COO-）或磺酸基（-SO3-）。
在吸附步骤中，带正电荷的生物大分子与固相上的阴离子交换基团结合。
洗脱步骤中，通过增加洗脱溶剂中的盐浓度或改变pH值来解离吸附的离子。
阴离子交换层析适用于分离和纯化带负电荷的生物大分子，如核酸和糖类。
这种层析材料通常含有阳离子交换基团，如胺基（-NH2）或季铵盐基（-N+(CH3)3）。
在吸附步骤中，带负电荷的生物大分子与固相上的阳离子交换基团结合。
洗脱步骤中，通过增加洗脱溶剂中的阴离子浓度或改变pH值来解离吸附的离子。
离子交换层析广泛应用于生物制药、生物化学和生物学研究中，可以用于纯化重组蛋白、肽段、核酸和多糖等生物大分子。
这种技术具有选择性高、适应性强、纯化效果好的优点，为生物大分子的研究和应用提供了重要的工具。
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作离子交换柱层析在生物分离和纯化中广泛应用，包括蛋白质分离和纯化。
蛋白质通常具有带电的氨基酸残基，可以与柱子上的离子交换基团发生静电相互作用。
在离子交换柱层析中，通过调节溶液的pH值和离子浓度，可以控制蛋白质与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，从而实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
1.离子交换柱的选择：根据所要分离的目标分子的特性选择合适的离子交换柱。
离子交换柱可以根据其固定相的性质分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，根据离子交换基团的类型分为疏水基团和孔隙基团等。
2.样品预处理：将待分离的样品进行预处理，包括清除杂质、富集目标分子等步骤，以获得较高的纯度和回收率。
3.样品加载：将预处理过的样品溶液加载到离子交换柱上。
样品溶液中的目标分子与离子交换基团之间发生静电相互作用，被柱子上的固定相吸附。
4.柱洗脱：通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度或盐浓度等条件，改变目标分子与离子交换基团之间的相互作用，使其从柱子上洗脱下来。
5.纯化目标分子：将洗脱得到的目标分子进一步纯化和收集，可以通过再次进行柱层析、凝胶过滤、电泳等方法进行。
离子交换柱层析操作对于蛋白质的纯化十分重要。
在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的等电点和溶液的pH值选择合适的离子交换柱，实现对特定蛋白质的选择性吸附和洗脱。
通过优化离子交换柱层析操作的条件，可以获得较高纯度和产量的蛋白质。
总结起来，离子交换柱层析操作是一种常用的用于生物分离和纯化的方法。
它利用样品中带电的离子与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，实现对生物分子的选择性吸附和洗脱。
离子交换柱层析对于蛋白质的纯化具有重要意义，可以通过调节柱层析条件实现对特定蛋白质的纯化和富集。
离子交换柱层析操作是一种非常有用和广泛应用的生物分离技术。
生物化学实验-DEAE纤维素离子交换层析法分离血清蛋白
实验器材
762分光光度计、梯度发生器、磁 力搅拌器、量筒、漏斗、烧杯、 试管、乳头吸管、移液管、玻璃 棒、尼龙布、螺旋夹。
实验试剂
4、加样 当液面恰好与凝胶面重合时，立即拧紧螺旋夹，用枪向界
面缓慢的加入血清0.2ml，打开柱下口，液体缓慢流出。 当全部血清恰好完全渗到纤维素柱界面时，立即小心地加
0.01mol/L Na2HPO4 缓冲液0.5ml。连上乳胶管胶塞。
平衡液 界面
分离介质
5、洗脱 拧松梯度发生器盛液桶间的螺旋夹。开动磁力搅拌器，（搅
平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶 液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正 电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称 为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电 的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。
DEAE纤维素(二乙基氨基乙基，Dicthylaminoethyl，DEAE) 是阴离子交换剂。在pH8.0的溶液中，血清蛋白质都解离成为 阴离子，可交换结合到DEAE纤维素离子交换层析柱上。
空白管）。 以光密度为纵坐标，管号为横坐标，用方格坐标纸绘出血清
蛋白层析谱。观察并判断结果。
注：洗脱开始时先用1个体积的0.01mol/L Na2HPO4起始（100ml）洗脱，然 后再进行梯度洗脱，加样后即开始收集，每管约3ml。
7、作图
• 8、实验结束后，40 ml pH8.0缓冲液清洗， 用pH试纸检测，pH8.0终止。
然后用梯度洗脱法即逐步改变洗脱液的然后用梯度洗脱法即逐步改变洗脱液的phph值与离子强度使值与离子强度使deaedeae纤维素与蛋白质的亲和力降低可使不同蛋白质按其亲纤维素与蛋白质的亲和力降低可使不同蛋白质按其亲和力的大小不同而分步洗脱下来从而达到分离提纯的目的
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7、离子交换剂的再生与保存
取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱 内吹气，用烧杯收集流出的树脂。 使用过的离子交换树脂经过再生处理后，可重复 使用。可以在柱内处理，也可以将树脂取出后处 理。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方 法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗 涤，最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。 保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂 宜用0.002％氯已定（洗必泰），阳离子交换剂 可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些产品用0.02 ％叠氮钠。
聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂
R-SO3H + M+ = R-SO3M + H+
C H=C H2 +
交联剂
C H=C H2
聚合
C H=C H2
CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH CH2 CH
交联作用
CH2 CH CH2
磺化
H2SO 4
CH CH2 CH CH2 CH CH2
水的净化
阳
ห้องสมุดไป่ตู้
离
子 交
H+
换
阴
离
OH-
子 交
换
R-SO3H + M+ RN+H3OH- + XH+ + OH-
R-SO3M + H+
去离子水
RN+H3X- + OH-
H2O
除去水中的杂质离子
由于生物样品的复杂性，一般很难只经 过一次离子交换层析就达到高纯度，往往 要与其它分离方法结合使用。
使用离子交换层析分离样品要充分利用 其按带电性质来分离的特性，只要选择合 适的条件，通过离子交换层析可以得到较 满意的分离效果。
离子交换层析的应用
离子交换层析技术已广泛于各 学科领域。在生物化学及临床生 化检验中主要用于分离氨基酸、 多肽及蛋白质，也可用于分离核 酸、核苷酸及其它带电荷的生物 分子。
离子交换层析的应用
1)水处理 离子交换层析是一种简单而有效的杂质及各
种离子的方法，聚丙乙烯树脂广泛的应用于高纯 水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。 2)分离纯化小分子物质
+
+
+
+
+—
+
+
+
+ +—
++
—
+
离子交换剂
离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不 溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应 共价结合上某种电荷基团形成的
阳离子交换剂 （磺酸甲基、羧甲基、磷酸基）：平 衡离子带正电，能与带正电的离子基团发生交换作 用。可交换离子为Na+、H+ 阴离子交换剂（ 二乙基胺乙基、三乙基胺乙基）: 平衡离子带负电，与带负电的离子基团发生交换作 用。可交换离子为Cl-、OH-
按层析过程的机理分类：
名称
操作方式 固定相 流动相 分离依据
分配层析
纸层析 薄层层析
液体
离子交换层析 离子交换柱层析 固体
吸附层析 亲合层析
吸附薄层层析 气体吸附层析 酶与底物 抗原与抗体
固体 固体
固体
液体 溶解度
液体
液体 气体
带电性 静电引力
吸附力
液体 配体专一性
凝胶层析
凝胶过滤
固体 液体 分子大小
按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向 移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动 相展开，以达到分离鉴定的目的。
薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸 层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。
纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测 分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析 是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化 学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高 效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
通过改变离子强度或(和)pH使氨基酸再从离子交 换剂上先后被洗脱下来。
若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交
换荷而的离结物子合质交在 可换树与脂O层H上-发析。生的若交选基换择而本阴结原离合子理在交树换脂树上脂。，则带负电
物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因 此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下 来，达到分离纯化的目的。
洗脱速度
洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效 果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗 脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过 慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变 宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际 情况选择合适的洗脱速度。
6、部分收集及分析
柱的流出液可以用人工的方法收集到一系 列试管中或使用部分收集器(这种装置能使 每一管按照预定的时间或滴数收集流出 液，然后自动移位，下一管再继续收集)。
•溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处 理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
2、装柱:最关键的一步
¾ 层析柱夹在铁架台上，调成垂直 ¾ 先关闭出口，用溶剂灌注至1／3体积 ¾ 重力沉降法装柱:陆续不断地添加糊状物，使胶
粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适 当的柱床体积为止。 ¾ 为了避免分层。最好一次装完，如需分几次填 装，则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用 玻棒搅拌后再倾注。 ¾ 柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱 高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。
层析法不断发展，形式多种多样。 1944年出现
纸层析以后，层析法不断发展，相继出现薄层层 析、亲和层析、凝胶层析、气相层析、高压液相
层析（HPLC）等。 几乎每一种层析法都已发展成为一门独立的生
化高技术，在生化领域内得到了广泛的应用。
层析系统都由两个相组成：
固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也 可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶 液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的 吸附，溶解，交换等作用。
增大离子强度，用0.5M 柠檬酸缓冲液洗脱吸 附的氨基酸。
洗脱缓冲液
在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有 改变离子强度和改变pH值两种方式。改变离子 强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度， 从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下 来；而改变pH值的洗脱，对于阳离子交换剂一 般是pH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是 pH 值从高到低。 由于pH值可能对蛋白的稳定 性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强 度的梯度洗脱
离子交换层析广泛应用于无机离子、有机 酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分 离纯化。例如对氨基酸的分析使用强酸性阳离子 聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH值为2～3上 柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗 脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不 同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。全自 动氨基酸分析仪就是采用这种原理制成。
3)分离纯化生物大分子物质
离子交换层析是依据物质的带电性质的不 同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生 物大分子的一种重要手段。
由于生物样品的复杂性，一般很难只经过 一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其 它分离方法结合使用。
使用离子交换层析分离样品要充分利用其 按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条 件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离 效果。
实验五 离子交换层析法分离氨基酸
实验目的 学习用阳离子交换树脂分离氨基酸 的操作方法和基本原理
层析技术
1903年，俄国科学家M.C.Jber首创了一种从绿 叶中分离多种不同颜色色素成分的方法，他将 植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各 种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而 被分开，由此得名为色谱法 (Chromatography)，又被称为层析法。
4、加样
先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降 到刚接近树脂表面。
旋紧下端螺旋夹，用滴管准确移取1.0 ml 氨 基酸混合样品液，沿柱壁小心加到树脂表面， 然后松开下端螺旋夹，使样品液面下降至树脂 表面。
在树脂表面缓慢滴加少许缓冲液，重复两 次。
5、洗脱
当水面降至树脂表面时，再用一个柱体积的 缓冲液0.05M柠檬酸缓冲液洗柱，将不被树 脂吸附的氨基酸洗下来。
SO 3H CH CH2 CH CH2
SO 3H CH CH2 CH
活性基团
SO 3H
CH2 CH CH2
SO 3H
实验操作
层析柱 层析柱通常是玻璃的。离子 交换用的层析柱一般粗而 短，不宜过长。层析柱的基 本装置如图。
1、离子交换剂预处理
•对于离子交换剂要用流水洗去少量碎的不 易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对 于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
离子交换层析以离子交换剂作固定相，利 用它与流动相中需要分离的各种离子的亲 和力不同而达到分离的目的。
氨基酸的PI不同，在同一pH下所带电荷的数量和 性质不同，与树脂的亲和力就有差异
在pH接近中性的溶液中，精氨酸、组氨酸、赖氨 酸残基带正电荷，而天冬氨酸和谷氨酸则带负电 荷。
在一定pH下净电荷为正的氨基酸（精氨酸）可通 过静电键结合到阳离子交换剂上
3、平衡
用一个柱体积的0.05M柠檬酸缓冲液进行平衡。
平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换 柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH值的选择 首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要使各 个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量 使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的 差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定 的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合 不稳定。