增强型抗荧光淬灭封片剂

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DAPI-抗荧光淬灭封片剂

DAPI-抗荧光淬灭封片剂
产品编号：F-0045 规格：10ml
产品简介
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，它能与DNA结合，在紫外光下可观察到蓝色荧光，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm。

使用范围
本产品为即用型工作液，无须稀释，直接用于FISH、IF、TUNEL等细胞核的荧光染色。

储存条件
-20℃，避光
本产品需要严格避光，可放于铝饭盒中或用锡纸包裹。

本产品为淡黄色粘稠液体，由于其中的抗荧光淬灭成分会吸收光，使用时间长后，液体会慢慢变深，最终为变为深褐色时，请勿使用。

使用方法
FISH
杂交结束，标本经过洗液洗涤、再经梯度酒精脱水、干燥，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，室温下，大约20分钟后可观察荧光。

IF
孵育二抗结束，PBS洗涤后，直接在标本上滴加10～20μl DAPI，加上盖玻片，避光，室温下，大约20分钟后可观察荧光。

注意：
本产品含有甘油、抗荧光淬灭剂，也具备封片作用，在细胞核染色后，无须清洗，可减缓荧光淬灭，在严格避光情况下，4℃保存一周，荧光仍不会淬灭。

相关产品
广州市外显子生物技术有限公司
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多色免疫荧光染色试剂盒使用说明

多色免疫荧光染色试剂盒使用说明多色免疫荧光染色试剂盒使用说明酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采纳HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。

之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来其次轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA具体原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与四周的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增加。

简洁来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。

荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟接近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。

然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。

再换个一抗来其次轮孵育，周而复始。

等到全部抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最终去检测结果。

由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担忧抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大削减了试验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。

也就是说，假如用TSA技术，同一张片子上全部的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。

搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行试验，而且信号放大的倍数大大增加。

茹创生物开发的试剂盒详细酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。

免疫组化,免疫检测

免疫组化,免疫检测北京华越洋生物-----------------------------------------------DMDC玻片硅化剂(2%) 100ml 免疫组化40% 室温,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由二甲二氯硅烷(DMDC)组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×100ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

玻片硅化试剂盒(APES法) 3×500ml 免疫组化40% 4℃,6个月玻片的硅化,包括盖玻片和载玻片主要由APES、洗涤液、DEPC水组成。

PBS-Triton去污剂100ml 免疫组化40% 室温,12个月去污主要由PBS、Triton-100组成。

Sorensen磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH5.3-8.04)500ml 免疫组化40% 4℃,6个月组织化学常用缓冲液主要由磷酸二氢盐(钠/钾)和磷酸氢二盐(钠/钾)溶液组成,按不同比例混合后获得对用PH值。

pH值可选5.3，5.6，5.91，6.24，6.47，6.64，6.81，6.98，7.17，7.73，8.04。

Sorensen磷酸缓冲液(1×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度17mM。

Sorensen磷酸缓冲液(10×,pH6.2) 500ml 免疫组化40% 4℃,6个月少量细胞趋化实验主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化镁、氯化钙组成,终浓度170mM。

TBS缓冲液(0.02mol/L,pH8.2) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠组成。

TBS缓冲液(0.05mol/L,pH7.4) 500ml 免疫组化40% 室温,6个月免疫金银染色缓冲液主要由Tris、氯化钠、叠氮钠、BSA组成。

P0126抗荧光淬灭封片液

Acta Astronautica 63 (2008) 929 – 946. 6. Huang W, Zhang L, Niu R, Liao H.
Tenascin-R distinct domains modulate migration of neural stem/progenitor cells in vitro. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 2009 Jan-Feb;45(1-2):10-4. Epub 2008 Oct 15. 7. Chen X, Kang H, Zou F. Low concentration of GA activates a preconditioning response in HepG2 cells during oxidative stress-roles of Hsp90 and vimentin. Cell Stress Chaperones. 2009 Jul;14(4):381-9. Epub 2009 Jan 10.
2. Wang ZY, He FF, Sun ZY, Chen Y. Assessment of a new cryoloop vitrif ication protocol in the cryopreservation of mouse mature oocytes. Journal of Reproductive Medicine. 2008 Feb.Vol.17 No.1.
包装清单：
产品编号
产品名称
包装
P0126
抗荧光淬灭封片液
5ml
—
说明书
1份
保存条件： -20℃保存，一年有效。
注意事项： ¾ 需自备盖玻片与载玻片。盖玻片与载玻片可以向碧云天订购。 ¾ 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。可以向碧云天选购各种型号的载玻片存储盒。 ¾ 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。 ¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

IF步骤

IF/ICC实验步骤基本实验步骤：（1）细胞准备。

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2）固定。

根据需要选择适当的固定剂固定细胞。

固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。

PBS洗涤3×5 min。

（3）通透。

使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。

选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。

通透的时间一般在5-15min。

通透后用PBS洗涤3×5 min。

（4）封闭。

使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。

（5）一抗结合。

室温孵育1h或者4℃过夜。

PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

（6）二抗结合。

间接免疫荧光需要使用二抗。

室温避光孵育1h。

PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7）封片及检测。

滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

（一）细胞准备用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。

贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。

少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（二）固定和通透除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

固定的目的有三：①防止细胞从玻片上脱落；②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；③使标本易于保存。

标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③应保持细胞和亚细胞结构；④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。

防止细胞荧光淬灭的方法

防止细胞荧光淬灭的方法
选择合适的荧光染料和荧光蛋白：使用与荧光显微镜的激发波长和发射波长相匹配的荧光染料和荧光蛋白进行细胞成像。

降低激发光的强度：尽可能降低激发光的强度，减少曝光时间。

避免长时间暴露：避免长时间将样品暴露在“无用”的光照条件下，例如在没有收集数据时在镜下长时间观察。

使用抗荧光淬灭封片剂：为尽量减少实验样品的光漂白，可以使用抗荧光淬灭封片剂，以提高活细胞和固定细胞样品中荧光染料的光稳定性。

使用荧光淬灭剂：荧光淬灭剂中的离子可通过碰撞方式，捕获自发荧光光源分子发出的电子，阻止该电子从激发态回归基态和能量释放，从而淬灭自发荧光。

使用Evan’s蓝或者台盼蓝：可以采用0.001%或至0.1%浓度的Evan’s蓝或者台盼蓝染色，这种物质会均匀分布到组织或者细胞上，它能够结合不必要的固有荧光物质或背景性荧光物质，显著减少自发荧光。

抗荧光淬灭封片剂配方

抗荧光淬灭封片剂配方一、简介抗荧光淬灭封片剂是一种用于荧光显微镜下观察细胞的试剂。

在荧光显微镜下，由于荧光分子的不可逆性猝灭作用，会导致样品中的荧光信号逐渐减弱或消失，影响观察效果。

抗荧光淬灭封片剂可以有效地减轻这种猝灭作用，提高样品中荧光信号的稳定性和持久性。

二、配方1. PVA（聚乙烯醇）：PVA是本试剂的主要成分之一，在封片剂中起到增稠、降低表面张力、防止气泡生成等作用。

常见的PVA型号有17-88和10-98两种，前者的粘度较低，后者较高。

2. Glycerol（甘油）：甘油是一种具有保湿性质的化合物，在本试剂中起到保持细胞膜完整性、减少蒸发和挥发等作用。

3. DABCO（1,4-二氨基环己烷）：DABCO是一种具有活性氮原子的化合物，在本试剂中起到抗荧光淬灭的作用。

它可以与氧气、水和其他有机分子形成复合物，从而减少荧光分子的不可逆性猝灭作用。

4. PBS（磷酸盐缓冲液）：PBS是一种缓冲液，可以调节试剂的pH 值，使其适合于细胞生长和显微镜观察。

5. DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吡啶）：DAPI是一种DNA染料，在本试剂中起到标记细胞核的作用。

它可以与DNA结合，发出蓝色荧光。

6. Mounting medium（封片剂）：封片剂是一种用于固定细胞和显微镜观察的介质。

常见的封片剂有DABCO、Vectashield等。

三、制备方法1. 加入PVA：将适量的PVA加入PBS中，并在50℃下搅拌至完全溶解。

2. 加入甘油：将适量的甘油加入PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。

3. 加入DABCO：将适量的DABCO加入甘油-PVA溶液中，并搅拌至均匀混合。

4. 加入DAPI：将适量的DAPI加入甘油-PVA-DABCO溶液中，并搅拌至均匀混合。

5. 制备封片：将制备好的样品滴在载玻片上，加入适量的封片剂，然后用盖玻片覆盖。

最后用胶水固定盖玻片。

四、注意事项1. 避免过度搅拌：过度搅拌会使PVA分子链断裂，导致溶液黏度降低。

免疫荧光方法

免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。

利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。

免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。

这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。

最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。

基本实验步骤:(1) 细胞准备。

细胞免疫荧光步骤

免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

基本实验步骤：（1）细胞准备。

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2）固定。

根据需要选择适当的固定剂固定细胞。

固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。

PBS洗涤3×5 min.（3）通透。

使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。

选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。

通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.（4）封闭。

使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.（5）一抗结合。

室温孵育1h或者4℃过夜。

PBST漂洗3次，每次冲洗5min.（6）二抗结合。

间接免疫荧光需要使用二抗。

室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7）封片及检测。

滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

DAPI是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料。

DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm；DAPI和双链DNA结合后，最大激发波长为364nm，最大发射波长为454nm。

DAPI溶液用水配制。

推荐DAPI工作浓度为0.5-10μg/ml。

Hoechst 33258染色

Hoechst 33258染色固定液50 mlHoechst 33258染色液50 ml抗荧光淬灭封片液 5 ml说明书1 份保存条件：4℃保存，Hoechst 33258染色液需4℃避光保存。

本试剂盒自订购之日起六个月内有效。

注意事项：Ø 需荧光显微镜或激光共聚焦显微镜。

Ø 需PBS或0.9%NaCl溶液。

Ø 需盖玻片与载玻片。

Ø 荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光保存。

Ø 在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

使用说明：1. 贴壁细胞A. 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B. 刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C. 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D. 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E. 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

F. 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。

使细胞接触封片液，切勿弄反。

G. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

激发波长在350nm左右，发射波长在460nm左右，详细图谱请参考下图。

2. 悬浮细胞A. 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B. 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

洗涤期间手动晃动。

C. 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D. 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

抗荧光淬灭封片剂配方

抗荧光淬灭封片剂配方一、引言在生物荧光显微镜技术中，荧光淬灭是一个非常重要的问题。

荧光淬灭指的是在激发荧光标记的样品时，标记的荧光会随着时间的推移逐渐减弱甚至消失。

这一现象常常会干扰实验结果的观察和分析。

为了解决荧光淬灭问题，研究人员通常会使用抗荧光淬灭封片剂来抑制荧光的淬灭，使得荧光信号能够更稳定和持久地显示。

本文将围绕抗荧光淬灭封片剂配方展开探讨，介绍常用的配方组分及相关考虑。

二、抗荧光淬灭封片剂配方的组成抗荧光淬灭封片剂的配方通常包含以下几个关键组分：1. 缓冲液缓冲液在抗荧光淬灭封片剂中扮演着重要的角色。

合适的缓冲液可以维持溶液的酸碱平衡，稳定荧光标记物并减少荧光淬灭的发生。

常见的缓冲液组分包括：•Tris（三羟甲基氨基甲烷）：用作缓冲剂并维持溶液的pH值稳定。

•磷酸盐缓冲液：常用的生物学实验缓冲液，能够提供稳定的pH值。

2. 荧光稳定剂荧光稳定剂是抗荧光淬灭封片剂中的关键组分，能够减缓或阻止荧光淬灭的发生。

它们可以与氧气或其他荧光淬灭因素发生反应，从而维持荧光信号的稳定性和持久性。

常见的荧光稳定剂包括：•溴化物盐：例如溴化钾、溴化钠等，能够减缓氧气对荧光的影响并提高荧光信号的持久性。

•抗氧化剂：例如丙酮酸、谷胱甘肽等，可以抑制氧气对荧光信号的淬灭。

3. 抗褪色剂抗褪色剂也是抗荧光淬灭封片剂的重要组成部分，它们能够保护荧光标记物免受光照引起的褪色和淬灭。

常见的抗褪色剂包括：•糖：例如蔗糖、葡萄糖等，能够降低光照对荧光淬灭的影响。

•抗氧化剂：例如硫代硫酸盐、联胺等，可以减少光照引起的褪色。

4. 抑制剂某些情况下，样品中的某些成分会对荧光信号产生干扰，因此需要加入适当的抑制剂来消除干扰。

常见的抑制剂包括：•胺基甲酸酯类物质：例如二乙氨基乙酸酯（DEAE）、甲基硫醇（MEA）等，可以抑制非特异性背景信号。

三、抗荧光淬灭封片剂配方的考虑因素在选择和设计抗荧光淬灭封片剂配方时，需要考虑以下几个因素：1. 样品特性不同的样品可能对荧光淬灭存在不同的敏感性和特性。

细胞免疫荧光详细步骤

细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。

一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。

培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。

最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。

荧光淬灭

如果这种能量传递不有效的话，可能荧光就强。

另外金的plasmon也会增强荧光材料的光吸收，可能会增强荧光总强度。

这两个竞争过程除了与波长有关外，朱要与距离有关，一般5纳米是界限，距离短被淬灭荧光淬灭有以下几种说法:1. 动态淬灭(碰撞淬灭,淬灭剂与发光物质的激发态分子之间的相互作用)2. 静态淬灭(发光分子基态和淬灭剂形成不发光的基态络合物)3. 转入三重态淬灭4. 自吸淬灭(浓度高时，自淬灭)首先确定荧光物质是否有电性，就是说荧光物质是否带有电荷，而且贵金属，例如纳米金，在制作过程中，表面由于有柠檬酸根而带有负电荷，可以和带正电荷的荧光物质，如带正电荷水溶性荧光共轭聚合物，通过静电作用，而使荧光猝灭；如果带相同电荷或者一方不带电荷，猝灭是不怎么明显的。

可以这样说，这种猝灭，是通过电荷作用相互吸附在一起，你可以让两者相互作用后，做一个TEM，就可以判断了。

荧光淬灭有动态淬灭和静态淬灭两种，稳态的荧光强度都显示出荧光强度的衰减，无法分辨，而动态淬灭至少分裂为2个荧光寿命，意味着能量转移的发生，而静态淬灭只是淬灭剂与荧光物结合生成非荧光物质，荧光寿命并不发生变化。

Acrylamide和碘离子分别用于疏水淬灭或亲水淬灭，测量蛋白质中Trp残基荧光淬灭的寿命，能够轻易的得知Trp残基是位于蛋白质表面还是内部。

荧光淬灭多用于分析大分子或胶体的结构或构象，用淬灭的方法研究荧光基团在分子内还是分子表面，有个淬灭的方程，一时写不出来，大概是淬灭剂浓度和荧光变化的关系，有个K常数，和淬灭效率和荧光寿命有关，如果分子构型改变，K会变化，这样就可以用来研究某些化合物对大分子构型或构象的影响。

荧光漂白，就是用强光把荧光素的激发态全部给消除了，有可逆和不可逆两种，可逆的漂白相当于清理出一个没有荧光的区域，相当于荧光清零，然后再观察测量某种特定的荧光的扩散、产生或恢复。

漂白是否可以恢复依赖于荧光素的种类和漂白光强，作为副作用，荧光素的漂白常会发生。

抗荧光淬灭封片液成分

抗荧光淬灭封片液成分
嘿，朋友们！今天咱来聊聊抗荧光淬灭封片液的成分。

你可别小看了这玩意儿，它就像是给我们的样本穿上了一层保护衣呢！
这抗荧光淬灭封片液里啊，通常有一些特别的成分。

就好像是一个团队里的各个成员，都有着自己独特的作用。

比如说，有一种成分就像是一个忠诚的卫士，努力维持着样本的稳定，让荧光信号能乖乖地待在那里，不轻易消失。

还有的成分呢，就如同一个神奇的魔法师，能够增强荧光的亮度和持久性，让我们能更清楚地看到那些细微之处。

你想想看，要是没有这些成分的精心呵护，我们观察的那些漂亮的荧光图像岂不是很快就会变得暗淡无光啦？那可就太可惜了呀！就好比你精心画了一幅美丽的画，结果没一会儿颜色就掉光了，那多让人沮丧啊！
而且啊，这些成分还得相互配合得恰到好处才行。

这就跟踢足球一样，每个球员都要在自己的位置上发挥好作用，同时和队友紧密配合，才能赢得比赛。

如果某个成分“掉链子”了，那整个封片液的效果可就大打折扣啦。

再打个比方，这抗荧光淬灭封片液的成分就像是一道美味菜肴里的各种调料。

盐不能太多，不然太咸；糖不能太少，不然没味道。

只有各种调料搭配得宜，才能做出让人赞不绝口的美食。

咱在使用抗荧光淬灭封片液的时候，可一定要选对产品，就像挑水果一样，得挑新鲜又甜美的。

不同的样本可能需要不同的封片液呢，这可得仔细着点儿。

要是选错了，那不就相当于给千里马套上了小毛驴的缰绳，能发挥好才怪呢！
总之，抗荧光淬灭封片液的成分可真是太重要啦！它们默默地守护着我们的样本，让我们能更好地探索微观世界的奥秘。

可别小瞧了它们哟！你说是不是呀？。

抗荧光淬灭剂的原理

抗荧光淬灭剂的原理抗荧光淬灭剂，这可是个挺有趣的东西呢！咱先得知道啥是荧光淬灭。

就好比一个小彩灯，本来亮堂堂的，突然被什么东西给捣乱了，一下子就暗下去了，这就是荧光淬灭啦。

那为啥会这样呢？有好多原因呢。

有时候是周围的环境里有一些调皮捣蛋的分子，它们像小坏蛋一样，把荧光分子的能量给抢走了，荧光分子没能量了，就不发光或者发光变弱了。

这时候抗荧光淬灭剂就闪亮登场啦。

它就像是荧光分子的小保镖一样。

这个小保镖很聪明哦，它会在荧光分子周围形成一种保护圈。

那些想捣蛋的分子靠近的时候，小保镖就会把它们拦住，不让它们去抢荧光分子的能量。

比如说，有些抗荧光淬灭剂就像一个个小盾牌，把荧光分子遮得严严实实的，那些坏分子就没办法下手啦。

还有些抗荧光淬灭剂呢，它们会和荧光分子手拉手，就像好朋友一样。

当有危险靠近的时候，它们就一起抵抗。

这种拉手可不是简单的拉手哦，它们在能量的传递上也有一套。

会让荧光分子的能量稳定住，不会轻易被抢走。

再说说这些抗荧光淬灭剂的神奇之处吧。

你想啊，在科学研究里，要是荧光分子老是淬灭，科学家们就没法好好观察那些微观的东西啦。

比如说在观察细胞里面的一些小结构的时候，就靠荧光分子来标记呢。

如果荧光淬灭了，就像在黑夜里突然没了手电筒一样，啥都看不到了。

而抗荧光淬灭剂就保证了这个手电筒一直亮着，让科学家们能顺利地进行研究。

在一些检测实验里也是一样的。

比如说检测一些疾病的标志物，如果荧光老是淬灭，那检测结果可能就不准啦。

抗荧光淬灭剂就像是一个稳定结果的小能手，让检测能够准确地进行。

其实抗荧光淬灭剂就像一个默默奉献的小英雄呢。

它没有那些特别耀眼的光环，但是它在幕后做的事情可重要啦。

它让那些荧光分子能够稳定地发光，为我们的科研、检测等好多方面都提供了大大的帮助。

如果没有它，很多关于荧光的应用可能都会变得一团糟呢。

所以呀，可别小看了这个抗荧光淬灭剂哦。

免疫荧光

免疫荧光
1.铺片：20微升PLL处理盖玻片，涂于玻片上置于37度培养箱晾干，置于24孔板底部（处理过的一面朝上）。

加入1*106/mL的细胞1毫升（按细胞大小选择所加入的细胞数，此为脾细胞），300g离心1min，吸取上层液。

注：如果是贴壁细胞的话就不需要PLL处理玻片，直接提前一天接种细胞，次日细胞自动贴到玻片上。

2.固定打孔：用4%的多聚甲醛250微升室温固定二十分钟，PBS洗两遍，每遍3min。

然后用250微升的0.3% Triton X室温打孔20分钟。

3.封闭：吸取上层液,250微升PBS洗两遍，加入2%的BSA（PBS溶解）250微升室温30min或4度过夜，封闭完无需PBS洗。

4.一抗孵育：1:1500稀释抗体每孔250微升室温45min到2h。

然后PBS洗三遍，每遍10min。

此后的步骤都应避光处理。

5.二抗孵育：1:1500稀释抗体，每孔250微升室温45min到2h。

然后PBS洗三遍，每遍10min。

6.染核：1:3000稀释DAPI，250微升每孔，处理3-5min，然后用PBS洗5-6遍。

7.封片：2-3微升封片剂（甘油，防淬灭剂），滴到载玻片上，取出盖玻片，有细胞的一面朝下置于载玻片上（不要有气泡）。

注：A 实验前应根据一抗的来源及所用荧光显微镜的通道来选择合适的二抗。

B 0.3% Triton X现配现用，2%BSA应提前配置，溶解很慢，4度储存不可超过一周以上，用前确保澄清，有杂物的话可离心去除。

抗荧光淬灭封片液(含DAPI) P0131-5ml 25ml说明书

抗荧光淬灭封片液(含DAPI)产品简介：碧云天生产的抗荧光淬灭封片液(含DAPI) (Antifade Mounting Medium with DAPI)是一种含有细胞核蓝色荧光染料DAPI 并能减缓荧光淬灭的封片试剂。

本封片液不仅可以减缓各种常见荧光染料的荧光淬灭，还能在封片的同时完成对细胞核的DAPI 染色。

本封片液内含DAPI ，DAPI 的英文全称为2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride ，中文名称为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，也称DAPI dihydrochloride ，分子式为C 16H 15N 5·2HCl ，分子量为350.25，CAS Number 28718-90-3。

DAPI 的最大激发光波长为340nm ，最大发射光波长为488nm ；DAPI 和双链DNA 结合后，最大激发光波长为364nm ，最大发射光波长为454nm 。

DAPI 和双链DNA结合后的激发光谱和发射光谱参考图1。

图1. DAPI 和双链DNA 结合后的激发光谱和发射光谱。

DAPI 是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，和双链DNA 结合后可以产生比DAPI 自身强20多倍的荧光，和EB(ethidium bromide)相比，对双链DNA 的染色灵敏度要高很多倍。

DAPI 染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

DAPI 也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA 染色。

本产品用于细胞染色的效果图参考图2。

图2. 凋亡诱导处理后的HeLa 细胞使用本产品染色后的效果图。

左侧为明场下HeLa 细胞的形态图，图中可以看到皱缩变圆的凋亡细胞；右侧为荧光显微镜下观察到的细胞核染色效果图，图中除了正常染色的细胞核外，还有致密浓染的凋亡细胞核。

实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

封片剂使用方法

封片剂：一般是指在涉及载玻片和盖玻片的实验中需要用到的一种粘稠剂。

方便标本样品的保存和信号的保留，具有隔绝空气的作用。

一般我们用到的有普通封片剂和抗荧光淬灭的封片剂。

下面以一个例子来讲讲吧。

就来讲讲组化最后的事吧--封片。

这个实验中我们可以选择的封片较多，可以用中性树脂和甘油明胶等。

那就以甘油明胶来说吧。

首先将甘油明胶加热融化。

因为在常温情况下，甘油明胶是半凝固状的，浓稠的粘稠体，不利于盖玻片的使用。

接下来就是利用移液枪或者干净的玻璃棒吸取或者沾取甘油明胶滴在组织上，观察液体表面是否有小气泡，若有，则尽量用一个盖玻片占去；若无，就直接用盖玻片和载玻片成一定角度（边缘靠近液滴）慢慢的靠近液滴，让液体慢慢的赶出盖玻片和载玻片之间的空气。

最后，只要将封好的片子晾干即可。

这里面需要注意的就是避免气泡出现在组织中，若不小心有气泡了，也要将气泡赶出组织的范围，不能影响观察结果和样品的保存。

抗荧光衰减封片剂 (Antifade Solution)

抗荧光衰减封片剂(Antifade Solution)SC1210 5 ml 200 元10 ml 350 元概述：抗荧光衰减封片剂以高纯度甘油为介质，内含抗荧光淬灭剂，有强烈的抗荧光衰减作用，用于对荧光组织和细胞样品的封片。

样品封片后4ºC或－20ºC避光保存2-3周，可最大限度延长荧光持续时间和维持荧光发光强度，同时封片剂中的其它成分有助于保持组织抗原抗体处于结合状态。

适用于所有光谱范围的荧光如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。

适用：1. 组织细胞免疫荧光组织化学染色样品封片；2. 染色体荧光观察封片；3. 核酸荧光原位杂交样品封片。

对所有光谱范围的荧光均有抗衰减作用，如FITC，Cy2, Cy3, Rhodamine, Texas Red, Cy5, Cy7，DAPI, AMCA, R6G, Hoechst 33258 and 33342。

使用方法：1. 吸去载玻片上的液体，略微晾干残留液体。

2. 取约20µl封片试剂滴加在载玻片的样品处。

也可取适量直接加到细胞培养孔内。

3. 盖上盖玻片。

盖玻片规格为24 x 24 mm或24 x 60 mm大小。

4. 轻轻压盖玻片，用滤纸小心吸除盖玻片周围多余液体，室温放置数分钟。

5. 直接进行荧光显微镜观察。

片子于4ºC或－20ºC避光保存2周，荧光无明显衰减。

6. 如需永久封片可用市售指甲油封固盖玻片周围，但通常这样做并无必要。

规格：5 ml或10 ml包装，每一24 x 24 mm盖玻片用约10-20µl。

储存：自然温度运输，收到后－20ºC避光保存。

组织自发荧光淬灭剂AutoFluo QuencherSC1212 20 ml 200 元概述：许多组织会产生可透过各种波长滤光片的内源性自发荧光，显著干扰抗体标记荧光观察甚至导致荧光组化染色失败。