多糖提取与纯化技术应用进展

作者简介：朱晓霞（１９８２－），女（汉），硕士研究生，从事天然生物大分子研究。

糖类物质是地球上数量最多的一类有机化合物，是生命物质的组成成分之一。

糖类物质广泛地存在于生物界，特别是植物界。

糖类物质按干重计占植物的８３％～９０％，占细菌的１０％～３０％，动物的小于２％。

大量药理及临床研究证实：多糖有调节免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降胆固醇、降血脂等生理功能，可广泛应用于医药、保健品及功能食品，作为绿色生物医药产品具有广阔的市场前景。

目前多糖产品开发相当热门，也卓有成效。

多糖的生理功能与其纯度和化学结构有着重要的关系，多糖的提取纯化是其研究的基础。

因此科学高效地从动植物及微生物中提取、纯化其中的多糖成分是目前的核心问题。

本文对多糖制备常用提取与纯化方法，特别是一些新技术的应用进展进行了综述。

１多糖的提取纯化１．１常规方法提取１．１．１原料预处理提取前，必须破坏或抑制共存的水解酶，可采用丙酮、乙醚、乙醇等低极性溶剂，以破坏水解酶并分离脂溶性杂质。

１．１．２浸提一般采用不同温度的水或稀碱溶液提取。

浸提参数中，温度是影响多糖提取的主要因素，另外浸提固液比、浸提时间均影响提取率，可根据需要选取最佳工艺参数。

１．１．３过滤或离心分离提取液有的可以直接过滤，有的因提取液较黏稠不易过滤，往往用离心法除去不溶物。

１．１．４有机溶剂沉淀提取所得的滤液或上清液浓缩，加２～５倍量的有机溶剂，得粗多糖沉淀。

常用有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇及丙酮。

现有很多植物多糖的提取研究都是采取的常规水提法：大麦［１］中活性多糖提取、大枣［２］多糖提取、老头草［３］中多糖的含量测定、乌龙茶［４］多糖提取等。

朱晓霞，罗学刚（西南科技大学材料科学与工程学院，四川绵阳６２１０１０）多糖提取与纯化技术应用进展摘要：多糖由于它们独特的功能和低毒性，在保健食品和药品发展方面具有广阔的应用前景。

提取和纯化是制备多糖的关键。

目前用的提取方法有：常规水提法、超声波、微波辅助提取、超临界流体萃取；分离纯化技术有：色谱、膜分离。

综述了多糖制备常用的提取与纯化工艺与新技术的应用进展，分析了它们的原理及优缺点并探讨了发展前景。

关键词：多糖；提取；分离；纯化ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮＯＦＰＯＬＹＳＡＣＣＨＡＲＩＤＥＳＺＨＵＸｉａｏ－ｘｉａ，ＬＵＯＸｕｅ－ｇａｎｇ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＭａｔｅｒｉａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉａｎｙａｎｇ６２１０１０，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈｖａｌｕｅｈａｓｂｅｅｎｆｏｕｎｄｆｏｒｔｈｅｂｉｏａｃｔｉｖｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｈａｖｅｗｉｄｅｌｙａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｆｏｒｅｇｒｏｕｎｄｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆｈｅａｌｔｈ－ｃａｒｅｆｏｏｄｓｔｕｆｆａｎｄｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｂｅｃａｕｓｅｏｆｉｔｓｌｏｗｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｉｔｓｐａｒｔｉｃ－ｕｌａｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｔｈｅｋｅｙｉｓｓｕｅｉｎｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｈｅｃｏｍｍｏｎ－ｌｙｕｓｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｕｓｕａｌ－ｗａｔｅｒ，ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ，ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｕ－ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｃｌｕｄｅｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｎｇａｎｄｐｕｒｉｆｙｉｎｇｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｔｈｅｐｒｏｓｐｅｃｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｉｓｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｂｒｕｐｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ１．２物理辅助提取目前常将物理场应用于对多种生物大分子的辅助提取，以提高多糖得率，主要是采用微波及超声波进行样品预处理。

１．２．１微波提取微波加热是靠微波电子管发出的电磁波，感应生电，又转化成分子的动能而发热，具有快速、高效、安全的特点；其次微波的频率很高，能透入物体的深度较深，对细胞的结构有较大作用。

王莉、孙萍［５￣６］等利用连续微波反应器，用石油醚、乙醚除去药材中的脂溶性杂质，用８０％乙醇除去所含单糖、低聚糖及甙等干扰性成分后，再运用微波技术用水提醇沉法分别制得板蓝根多糖和甘草多糖，并用苯酚－硫酸比色法对其多糖含量进行测定，得率均较传统方法提取明显提高，平均回收率在９８．５０％￣１０１．５０％之间，ＲＳＤ小于１．５０％，反应时间缩短１２倍。

付志红［７］为保持车前子多糖的生物活性，采用微波技术提取车前子多糖。

结果表明，微波提取方法时间短，得率高。

１．２．２超声波提取超声波主要是利用超声波空化产生的极大压力造成被破碎物细胞壁及整个生物体破裂，而且整个破裂过程在瞬间完成；同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散及溶解，加速植物中的有效成分进入溶剂，使其进一步增大了有效成分的溶出。

Ｓｔａｈｍａｎｎ［８］等报道，一种具有β－１，３－Ｄ－葡聚糖结构的多糖经过长时间的超声处理后，分子量从２５万降至５万左右，经小角度Ｘ光衍射分析，此多糖的超声降解产物的空间结构与具有免疫调节活性的裂褶多糖相似。

超声降解的速率受以下因素的影响：母体分子量、浓度、体积、超声辐照时间和反应温度等。

Ｃｈｅｎ［９］等认为，相对分子量越高或浓度越低，则降解速度越快。

此外，增大超声波的强度、降低环境温度、施加外压或在外加气体存在的条件下均可导致降解速度提高。

韩兵兵［１０］等通过单因素法对超声波法提取大枣多糖的实验条件进行优化，并与常规的水浴提取法作了比较。

结果显示，超声法提取具有高效、节能、省时的特点。

常秀莲［１１］等在超声波法提取芦荟花多糖的研究中发现，采用超声波分两批次加水比单次加相同水量可多提取７％的多糖。

１．３超临界流体萃取超临界流体萃取（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＣＦＥ）是２０世纪９０年代发展起来的一项新型提取技术，利用超临界流体（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｓ，ＳＣＦ）为萃取剂，从液体或固体中萃取目标组分。

用纯ＣＯ２提取糖及苷类化合物的产率低，这是因为这类化合物分子量较大、羟基多、极性大，如加入携带剂和加大压力则可提高产率［１２］。

廖周坤等用ＳＥＦ－ＣＯ２萃取装置试验从藏药雪灵芝中萃取总皂苷粗品及多糖，确定最佳多糖萃取条件为：１０ＭＰａ、４５℃６．４ｈ，其中加不同极性夹带剂的梯度ＳＦＥ萃取法与传统溶剂萃取工艺相比，多糖收率可以提高至１．６２倍。

２多糖的纯化多糖的纯化是获得粗的活性多糖提取液后，除去共存杂质，进行混合糖的相互分离，随糖类组分的复杂性不同而有所区别。

一般分为两个过程：多糖除杂、多糖分离。

２．１多糖除杂主要过程２．１．１去蛋白Ｓｅｖａｇ法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、酶解。

微生物多糖去蛋白常采用Ｓｅｖａｇ法、三氟三氯乙烷法；植物多糖去蛋白常用三氯乙酸法，也可以用蛋白质水解酶使样品中的蛋白质部分降解后，再用Ｓｅｖａｇ法效果会更好。

李知敏等［１３］选用了３种较为常见的方法：三氯乙酸法、盐酸法及Ｓｅｖａｇ法对植物多糖提取液进行脱蛋白处理。

其脱蛋白率分别为４６．１％、７２．５％和４２．３％，多糖损失率分别为６．１％、１５．１％和１４．３％。

盐酸法脱蛋白率高，但它的多糖损失率较高；三氯乙酸法、Ｓｅｖａｇ法较温和，但除蛋白效率不高。

２．１．２透析流水透析４８ｈ，蒸馏水透析２４ｈ，去除小分子杂质。

２．１．３有机溶剂洗涤透析后的沉淀相继用乙醇、丙酮、乙醚洗涤，干燥得粉末状的粗多糖。

２．２多糖分离主要有分级沉淀、季铵盐沉淀法、透析法、金属盐沉淀法和制备性区域电泳等，目前大多采用ＤＥＡＥ－凝胶或其他各种不同类型的凝胶柱层析以及离子交换色谱法。

２．２．１色谱分离依据被分离多糖组分间的理化性质差异及其在固相载体和流动相之间分布和流动速度的差异而达到分离的目的。

２．２．１．１凝胶色谱凝胶色谱是一种分辨率低、载样量少的分离技术，但方法简单、快速。

常用的凝胶有葡聚糖凝胶（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）和琼脂糖凝胶（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ），以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂，从而使不同大小的多糖分子得到分离纯化，但不适宜粘多糖的分离。

一般生药提取物得以分离多用Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＥＡＥ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（甲基丙烯酸聚合树脂）、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（丙烯葡聚糖凝胶）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ精制得到各种多糖。

魏江洲等［１４］用热水抽提法提取海螵蛸多糖粗品，用ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ柱及ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－６Ｂ柱对海螵蛸多糖粗品进行分离，最后使用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－３００柱进一步纯化，最后得到相对均一的活性精品多糖ＣＰＳ－１。

２．２．１．２离子交换色谱法通过载体表面带电基团与样品离子和淋洗离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附实现色谱分离。

不同多糖尤其是多糖与蛋白质结合在一起的复合多糖，在一定ｐＨ条件下，所带电荷不同，则可根据各多糖上电荷的差异而达分离目的。

毛建山［１５］等经脱脂、沸水抽提、乙醇沉淀、酶－Ｓｅ－ｖａｇ法脱蛋白得到的粗多糖，再经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅｆａｓｔｆｌｏｗ阴离子交换和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００葡聚糖凝胶柱色谱分离得到纯化的白毛藤多糖（ＳＬＰＳ）。

２．２．２膜分离膜分离技术（ｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＭＳＴ）是一项新兴的高效分离技术，分离过程以选择透过性膜作为分离介质，通过在膜两侧施加某种推动力（如压力差、化学位差、电位差等），使原料液中组分选择性通过膜。

以压力差为推动力的膜分离过程包括微滤、超滤、纳滤、反渗透，根据筛分原理使某些组分选择性透过，实现提纯和浓缩［１６］。

目前应用较多的是超滤和微滤技术。

２．２．２．１超滤超滤［１７］（ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ＵＦ）的孔径范围为１ｎｍ～１００ｎｍ，截留相对分子质量为１０３￣１０６。

溶解的盐和水会通过超滤膜，分子量在１０００以上的物质则被截留，故可从水和其它液体中分离出很小的胶体和大分子。

超滤膜的另一特点是由于受渗透压的阻碍作用小，所以在相当低的压力差（０．０４ＭＰａ￣０．７０ＭＰａ）下，仍具有高流通率。