第十章电泳0521

T=
Acr（g）+Bis（g） V（ml）


×100%
C=
Bis（g）
×100%
Acr（g）+Bis（g）

凝胶孔径大小，主要受凝胶浓度的影响。凝胶浓度越大， 孔径越小（分离蛋白质时，一般T在5-15%左右）。 为得到富有弹性、完全透明的凝胶，Acr:Bis应在30左右

§10.2 Polyacrylamide Gel Electrophoresis （PAGE）
防止对流（扩散降到最小）；具有分子筛效应（凝胶多孔）→分辨率↑
1、电泳的理论基础

电泳是在电场的作用下而产生的物质运动 不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电 荷不同 → 受到的引力不同

→ 向相反电极泳动速度不同
→ 达到分离目的
1）带电粒子的泳动速度v

若将带净电荷Q的粒子放入电场强度为E的电场，则该 粒子所受到的电荷引力为：
6、Close the lid of the tank and Apply the desired voltage (15 V/cm) to the gel to begin the electrophoresis. (合上电泳槽施 加电压开始电泳)
7、紫外灯下观察样品分离情况
§10.1.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳简介
F引=E Q （1）

在溶液中，运动粒子与溶液之间存在阻力F阻
F阻=6πrηv （2）

当F引=F阻 时 EQ= 6πrηv
EQ v 6r
与电场强度(E)和粒子所带电荷 量(Q)成正比，而与粒子的半径 (r)及溶液的粘度(η)成反比。
2）带电粒子的电泳迁移率u

迁移率 u ：带电粒子在单位电场强度下的泳动速度代替 泳动速度v表示粒子的泳动情况。


§18.1 电泳分离技术概述

Tiselius电泳仪价格昂贵，分辨率低，且因为自由溶液 受热发生密度变化，产生对流，使区带扰乱
→区带电泳：电泳迁移中以一个缓冲溶液饱和了的固 相介质作为支持介质，减少外界干扰（导电性？） 按支持介质的不同，分为惰性载体类和凝胶类



惰性载体：滤纸、醋酸纤维素薄膜等 凝胶类：聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等

其他影响因素

②电内渗p225 若支持物质带有羧基、磺酸基、羟基等功能团

在一定的pH值溶液中，它们会电离，使支持物带 负电荷
与支持物相接触的溶液层(通常是水)带正电荷，在 电场的作用下，此溶液层会向负极移动。
若电渗方向与样品迁移方向一致→加快样品的表观迁 移速率


凝胶电泳


凝胶电泳的介质：琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶
2）If the gel concentration is fixed 3）If the gel/buffer system is continuous
§10.2.1 SDS-PAGE


Before run on SDS-PAGE
Samples are dissolved in sample buffer containing：
琼脂糖凝胶：孔径较大，对蛋白质筛分作用不大 →一般用于较大的核酸分子的电泳分离 聚丙烯酰胺凝胶：适宜分离鉴定分子量在5200kDa的蛋白质、较小的核酸分子，长度仅相差 0.2%的核苷酸分子即能分离

§10.1.1 琼脂凝胶简介

将琼脂糖悬浮于缓冲液中（浓度是0.7％－3％），加热煮 沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却 凝胶的孔径由浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔 径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。


§10.1 电泳分离技术概述

概念：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为 电泳（electrophoresis）。 十九世纪初被发现 1937年Uppsala大学的Tiselius教授第一次建立“移动 界面电泳”→成功将血清蛋白分成白蛋白、α-、β-和γ球蛋白四个主要成分 近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳 技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得 到了广泛应用。
Classification of PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳分类）
1）If proteins are denatured SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 Non-denaturing /Native PAGE非变 性聚丙烯酰胺凝胶电泳 Fixed-concentration Gel固定浓度胶 Gradient Gel 梯度胶 Continuous system 连续电泳 Discontinuous system不连续电泳
§10.3 Isoelectric Focusing 等电聚焦（IEF） §10.4 Capillary Electrophoresis毛细管电泳 （CE）

§10.1 Introduction to Electrophoresis Review

The disadvantages of moving boundary electrophoresis(移动界面电泳) The character and application of the most commonly used matrix Factors influencing the mobility of the charged molcules




SDS-PAGE

With the treatment of SDS，DTT and bioling The SDS-denatured and reduced proteins are flexible rods （eliminating differences in molecular form）
2、 Cool down the solution to 60 0C. You may add ethidium bromide (Et Br) in this step or you can submerge the gel in an Et Br solution once it solidifies 溶液冷至60℃后加入溴化乙锭（或等凝胶固化后再将其浸 入溴化乙锭溶液中）

With uniform negative charge per unit length

In sieving gels the proteins separate by molecular weight
5、Mix the samples and standards with appropriate amounts of loading buffer (10×). Slowly load the mixture into the wells with a micropipette（将 样品与适量上样缓冲液混合并缓 慢加入上样槽中）
4、Remove the comb when the gel has completely hardened and place the gel in the electrophoresis tank. Add enough electrophoresis buffer to the tank to cover the gel（胶凝好后取 出梳子和胶带并将胶放入电泳槽中， 向其中加入一定量的电泳缓冲液）
3、Pour the gel in the glass plate. Position the comb above the plate, thus permitting that a complete well is formed when the agarose solidifies（倒溶液入制胶槽中 并插入梳子，使胶凝固的同时形成上样孔）
(Polyacrylamide gel electrophoresis ，PAGE)

以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳，除利用物质所带电荷 差别外，还具有分子筛的作用 优点：分辨率高、凝胶孔径大小可调、机械强度好、弹性大、 不产生电渗、化学惰性、需要的样品量少并不易扩散


缺点：单体具有神经毒性，使用高纯度试剂且需无氧下聚合
化学聚合

微量TEMED （N，N，N’，N’-四甲基乙二胺） 的加入→使过硫酸铵形成自由基

过硫酸铵APS （ammonium persulfate）引发自 由基聚合 →引发丙烯酰胺Acr与亚甲基双丙烯酰胺Bis的 聚合、交联反应，形成有一定网孔结构的聚丙 烯酰胺凝胶


凝胶的物理性质如机械强度、弹性、透明度和粘度都取决于 凝胶总浓度（T）和Bis 占总单体量的百分比（交联度C） 。 凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时， 凝胶稀软，不易操作。 交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；过低，凝胶呈糊状
Sodium dodecylsulphate (十二烷基磺酸钠SDS) and
reducing agent Dithiothreitol（二硫苏糖醇DTT） And then boiled for 5 min
The function of SDS and DTT

SDS is an anionic （阴离子）detergent denaturing the protein. One SDS molecule binds for every two amino acid residues. Each protein in the mixture is changed into a rodshaped structure. The original native charge on the molecule is therefore completely swamped （掩盖）by the SDS molecules, thus conferring （赋予）a net negative charge to the polypeptide in proportion to its length. DTT cleaves any disulphide bonds(S-S) between cysteine residues.