siRNA 中文操作手册(lipo2000)
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
siRNA说明书
产品以冻干粉的形式，常温运输。
收到产品后，请于-20 C〜-80 'C保存，冻干粉可以稳定保存一年。
使用前请瞬时离心，用RNase-freeH 2O或者灭菌ddH20，配制成20gM储存液，分装保存，避免反复冻融（尽量不超过5次）。
表120 gM储存液的配置参考使用前须知为避免外界因素（包括酶，极端pH或者温度条件等）导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20 C~-80 C小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24〜72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2. 转染步骤：以Iipofectamine2000（简称Iipo2000）转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1）转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%（不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验）。
注意: 转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2）对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-Iipo2000混合液：a. 稀释siRNA :用50 g 不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释g I20 gM siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min ;b. 稀释Iipo2000 :用50 g不含血清培养基Opti-MEM I （v1）稀释1 g Ilipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min ;c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min（溶液可能会有浑浊，但不会影响转染）。
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
siRNA 中文操作手册(lipo2000)
THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
lipo转染操作步骤
L i p o2000瞬时转染细胞步骤Stealth?RNAiorsiRNATransfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
PlasmidDNATransfectionDNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1中板。
贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。
2转染。
A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。
B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C将AB两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cmdish细胞质粒转染量4-6ug足以。
Opti-MEM?I减血清培养基是EMEM的改良型,其中使用了HEPES和碳酸氢钠进行缓冲,并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、痕量元素和生长因子.常用其作为无血清培养基与质粒和lip2000分别混合。
SiRNA 使用说明
因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)，请使用无抗生素的培养基。 注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，从而降低细胞的转染效率。而 细胞密度过低则可能达不到生长的要求，也会因此影响转染效率。 (2) 对于每个转染样品，按如下步骤准备 siRNA-lipo2000 混合液(试剂的用量和体积，请参照“转染 siRNA 用量参考”)： a. 稀释转染试剂 lipo2000：使用前，将 lipo2000 转染试剂轻轻摇匀，然后取适量，用不含血清的优化培养基(Opti-MEM I
E-mail: support@
1
Tel: 020-32290221
实验指导
96-well 24-well 12-well 6-well
表 1 使用 lipofectamine2000(invitrogen)转染 siRNA 用量参考(siRNA 转染浓度为 10-100nM) V1：细胞培养液体积；V2: siRNA-lipo2000 混合液总体积
siRNA 使用说明
产品简介：
常规化学合成 siRNA 为 21-25nt 的双链小分子 RNA。即用型的 siRNA，已经经过纯化、退火等处理，只要用灭菌的 ddH2O 或 RNase-free water 溶解并配制成 20µM 液体即可直接转染细胞。 产品剂型为冻干粉，产品剂量经过严格测算，以摩尔数标明。
使用： 产品使用时，siRNA 最好冰上放置，使用完毕后，请于-20℃或-70℃小心保存;整个实验过程，要求无 RNA 酶环
lipo2000转染操作步骤
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
siRNA 使用说明
Reduced Serum Medium)稀释，轻轻混和，室温孵育 5min； b. 稀释 siRNA：用 Opti-MEM I Reduced Serum Medium 稀释 siRNA，轻轻混和； c. 稀释好的 lipo2000 经过 5min 的孵育后，与上述(b)稀释好的 siRNA 轻轻混和，室温培养 20min 以形成 siRNA-lipo2000
siRNA说明书
使用前须知为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。
实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20℃~-80℃小心保存。
细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a.转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b.接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。
1.转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。
推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为24~72h。
最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5~100nM。
2.转染步骤：以lipofectamine?2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。
1)转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到30~50%(不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。
注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。
2)对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：a.稀释siRNA：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1.25μl20μM的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基Opti-MEM?Ⅰ(v1)稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。
注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA 混合。
另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。
赛默飞lipo2000说明书
赛默飞lipo2000说明书产品概述：值得信赖的、简单的广谱转染试剂，适用于大多数细胞系。
转染；通常是指将核酸引入真核细胞，或者更具体地说，引入动物细胞中。
Invitrogen Lipofectamine 2000 转染试剂是一种多功能转染试剂，经证明可以将各种有效载荷有效地转染到各种贴壁和悬浮细胞系中。
研究人员将 Lipofectamine 2000 试剂用于质粒 DNA 转染以及基于 siRNA 和 shRNA 的基因敲除实验、基因表达研究。
使用 Lipofectamine 2000 试剂，您可实现：适用各种细胞系，转染效率极高，重组蛋白表达水平高，实验方案简单siRNA 和质粒 DNA 共转染性能出众、可靠，适合各种高通量应用Lipofectamine 2000 转染试剂的使用被更多出版物引用，远超其他转染试剂进行可靠的细胞转染：图 1.Lipofectamine 2000 试剂使用方案步骤概要。
Lipofectamine 2000 试剂以其出色的转染性能为蛋白表达、基因沉默和功能测定递送DNA 或 siRNA。
这种广谱试剂效率超高，实验方案简单，成功应用于各种细胞系，因此倍受欢迎（图 1）。
查看下列实验方案。
对于基因沉默，高效转染提供高水平的基因敲除，从而获得令人信服的结果Lipofectamine 2000 转染试剂能够有效转染 siRNA 和质粒 DNA，因此是共转染的极佳选择能够为自动化或机器人系统轻松创造转染条件，因而非常适合高通量工作高性能常见转染试剂：Lipofectamine 2000 转染试剂可有效处理所有常见细胞系（图 2）和多种难以转染的细胞系，可在含或不含血清的培养基中使用。
查看下面“相关资源”部分中的实验方案。
图 2.使用 Lipofectamine 2000 试剂进行转染后的高水平 GFP 表达。
Lipofectamine 试剂的认可度：Lipofectamine 2000 试剂于 1999 年上市，此后引用该试剂的出版物数量稳步上升，该产品仍然是被引用次数最多的在售转染试剂之一（图 3）。
lipo2000转染操作步骤
.Lipo2000 瞬时转染细胞步骤RNAi or siRNA Transfection Stealth?1 24孔板为例，其余规格的转染见表以适宜30-50%。
1 中板，细胞密度为如果转染后需要长时间注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
24-36小时后）每个孔转染方式如下：2 第二天（无血清培养基中。
溶于A 将20pmol siRNA50ul Opti-mem 。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min 两管混合，放置C 将A B20min。
加管mix3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C 孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
入24Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
70-80%5 时转染 cells/well贴壁细胞：0.5-2X10，第二天待细胞密度达到 5 ，中板后随即转染。
4-8X10cells/well悬浮细胞：2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
1 / 3.：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考* 足以。
6孔板细胞质粒转染量1-2ug**：足以。
6cm dish细胞质粒转染量4-6ug***：和碳酸氢钠进行缓HEPES 其中使用了减血清培养基是EMEM 的改良型,Opti-MEM? I常用其作为无.谷氨酰胺、痕量元素和生长因子并添加次黄嘌呤、胸苷、丙酮酸钠、冲,L-lip2000分别混合。
lipo 2000说明书
Lipofectamine™2000转染说明书IntroductionLipofectamine™ 2000 CD is a proprietary animal origin-free formulation for the transfection of nucleic acids into eukaryotic cells. A Drug Master File (DMF) has been submitted to the FDA. Contact Technical Service or your local Sales Representative for permission to cross-reference the DMF. Using Lipofectamine™ 2000 CD for transfection provides the following advantages:Highest transfection efficiency in many cell types and formats. Refer to the Cell Lines database at for a list of cell types transfected. he animalorigin-free formulation ensures that mammalian cell culture and bioproduction processes are free of animal-derived materials. DNA-Lipofectamine™ 2000 CD complexes can be added directly to cells in culture medium. It is not necessary to remove complexes or change/add medium after transfection, but complexes may be removed after 4-6 hours.Important Guidelines for Transfection1.Culture cells in serum-free media that are free of animal-derived components.Test serum-free media for compatibility with Lipofec tamine™ 2000 CD since some serum-free formulations (e.g. CD 293, 293 SFM II, CD Hybridoma)may inhibit cationic lipid-mediated transfection.2.For consistent animal origin-free transfection, use OptiPro™ SFM (Cat. No.12309-019) to dilute DNA and Lipofecta mine™ 2000 CD before complexing.3.Transfect cells at high cell density: For adherent cells, 90-95% confluence atthe time of transfection is recommended for high efficiency, high expressionlevels, and to minimize cytotoxicity. For suspension cultures, transfect cells ata density of 0.8-1.1 x 106 cells/ml. Optimization may be necessary. Maintainthe same seeding conditions between experiments.4.Do not add antibiotics to media during transfection as this causes cell death.5.Do not add Pluronic® or charged media extracts (e.g. dextran sulfate) tomedia during transfection as these reagents can inhibit transfection Transfecting Adherent CellsUse the following procedure to transfect mammalian cells in a 24-well format. For other formats, see Scaling Up or Down Transfections. Use the recommended Lipofectamine™ 2000 CD amount as a starting point, then optimize conditions for your cell line and serum-free medium, as needed. All amounts and volumes are given on a per well basis.1.One day before transfection, plate 0.5-2 x 105 cells in 500 μl of growthmedium without antibiotics so that they will be 90-95% confluent at the timeof transfection.2.For each transfection sample, prepare complexes as followso a. Dilute DNA in 50 μl of OptiPro™ SFM. Mix gen tly.o b. Mix Lipofectamine™ 2000 CD gently before use, then dilute the appropriate amount in 50 μl of OptiPro™ SFM. Incubate for 5 minutesat room temperature. Note: Combine diluted Lipofectamine™ 2000CD with diluted DNA within 30 minutes.o c. After 5 minute incubation, combine the diluted DNA with diluted Lipofectamine™ 2000 CD (total volume = 100 μl). Mix gently andincubate for 20 minutes at room temperature (solution may appearcloudy). Note: Complexes are stable for 6 hours at room temperature.3.Add the 100 μl of complexes to a well containing cells and medium. Mixgently by rocking the plate back and forth.4.Incubate cells at 37°C in a CO2 incubator for 18-48 hours prior to testing fortransgene expression. It is not necessary to change the medium, but mediummay be replaced after 4-6 hours.5.For stable cell lines: Passage cells at a 1:10 (or higher dilution) into freshgrowth medium 24 hours after transfection. Add selective medium thefollowing day.TOP Scaling Up or Down TransfectionsTo transfect cells in different tissue culture formats, vary the amounts of Lipofectamine™ 2000 CD, DNA, cells, and medium used in proportion to the relative surface area, as shown in the table. With automated, high-throughput systems, a complexing volume of 50 μl is recommended for transfections in 96- well plates.Culture vessel Surf. areaper well(cm2)Relativesurf. areavs. 24-wellVol. ofplatingmediumDNA (μg) inmedia vol. (μl)Lipofectamine™2000 CD (μl) inmedia vol. (μl)96-well 0.3 0.2 100 μl0.2 μg in 25 μl0.5 μl in 25 μl 24-well 2 1 500 μl0.8 μg in 50 μl 2.0 μl in 50 μl12-well 4 2 1 ml 1.6 μg in 100μl4.0 μl in 100 μl35-mm 10 5 4.0 μg in 250μl10 μl in 250 μl6-well 10 5 2 ml 4.0 μg in 250μl10 μl in 250 μl60-mm 20 10 5 ml 8.0 μg in 0.5ml20 μl in 0.5 ml10-cm 60 30 15 ml 24 μg in 1.5 ml 60 μl in 1.5 mlNote: Surface areas are determined from actual measurements of tissue culture vessels, and may vary depending on the manufacturer.Transfecting Cells in SuspensionUse the following procedure to transfect suspension cells at any scale. Before beginning, make sure that cells are healthy and > 90% viable.1.On the day of transfection, prepare a single cell suspension from stock cells at< 3 x 106 cells/ml. Seed cells at a density of 0.8-1.1 x 106 cells/ml in growthmedia without antibiotics.2.For each transfection sample, prepare complexes as in Step 2, using thefollowing reagent amounts and volumes for every ml of cells transfected:o Dilute 0.5-1.5 μg DNA in 34 μl of OptiPro™ SFMo Dilute 1-10 μl of Lipofectamine™ 2000 CD in 34 μl of OptiPro™ SFM3.Add the complexes to the flask containing cells and media.4.Incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator on an orbital shaker rotating at125 rpm for 24-96 hours prior to testing for transgene expression.Optimizing TransfectionTo obtain the highest transfection efficiency and low non-specific effects, optimize transfection conditions by varying cell density and Lipofectamine™ 2000 CD concentrations.Quality ControlLipofectamine™ 2000 CD is tested for the absence of microbial contamination using blood agar plates, Sabaraud dextrose agar plates, and fluid thioglycolate medium, and functionally by transfection of CHO-K1 cells with a reporter plasmid.。
Lipofectamine 2000 siRNA RNAi说明书
Reverse Transfection of Stealth™ RNAi or siRNA using Lipofectamine™ 2000 in a 96 well plate formatIntroductionLipofectamine™ 2000 Reagent is a proprietary formulation that facilitates highly efficient delivery of Stealth™ RNA moleculesor short interfering RNA (siRNA) to mammalian cells for RNAi analysis (1, 2). Here, we describe reverse transfection using Lipofectamine™ 2000. Reverse transfection is a method for high throughput (HTP) transfection of multiple siRNA or Stealth™RNAi duplexes, and is well suited in combination with RNAi duplexes pre-dispensed in 96-wells plates, such as the Stealth™RNAi Human Collections (available through our website, ).Reverse transfection combines RNA, transfection reagent, and cells in an altered sequence compared to traditional Lipofectamine™ 2000 transfection protocols. In short, a different RNAi molecule is put in each well prior to transfection and combined with diluted Lipofectamine™ 2000 to form complexes in each well. Cells are added directly to the Lipofectamine™2000-RNA complexes and transfection occurs while cells are attaching to the well.General Guidelines for TransfectionFollow these general guidelines when using Lipofectamine™ 2000 to reverse transfect siRNA or Stealth™ RNAi duplexes into mammalian cells.• Use low-passage cells, and make sure that cells are healthy and greater than 90% viable before transfection. This protocol is for use with adherent cells, as transfection efficiency for suspension cells generally is lower and may need optimization. • Do not add antibiotics to the medium during transfection as this reduces transfection efficiency and causes cell death.For optimal results, use Opti-MEM® I Reduced Serum Medium to dilute Lipofectamine™ 2000, DNA, and dsRNA oligomers prior to complex formation.• To increase accuracy and reduce assay variability, we recommend performing triplicate transfections for each sample condition.Materials NeededYou should have the following materials on hand before beginning:• Mammalian cell line cultured in the appropriate growth medium• Stealth™ RNAi or siRNA of interest (20 µM stock in 1X RNA Annealing/Dilution Buffer)• RNAi controls• Lipofectamine™ 2000 Reagent (Catalog nos. 11668-027 or 11668-019; store at +4°C and mix gently before use)• Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (pre-warmed; Catalog nos. 31985-062 or 31985-070)• 96-well tissue culture plates and tissue culture suppliesTransfection ProcedureUse this procedure to reverse transfect your siRNA or Stealth™ RNAi duplexes into mammalian cells in 96-wells plates using Lipofectamine™ 2000. The complexes are prepared inside the wells, after which cells and medium are added. Remember to include the proper positive and negative controls in your experiment.1. For each well to be transfected, prepare DNA-RNAi molecule-Lipofectamine™ 2000 complexes as follows.a. Mix Lipofectamine™ 2000 gently before use, then dilute 0.25 µl Lipofectamine™ 2000 in 25 µl Opti-MEM® I Mediumwithout serum in a separate vessel. Mix gently and incubate for 5 minutes at room temperature.b. Dilute 15 pmol siRNA or Stealth™ RNAi in 25 µl Opti-MEM® I Medium without serum in the well of the tissue cultureplate. Mix gently.c. After the 5 minute incubation, add the diluted Lipofectamine™ 2000 to the wells with the diluted RNAi molecules. Mixgently and incubate for 15 minutes at room temperature to allow complex formation to occur. The solution may appear cloudy, but this will not impede the transfection.2. Add 100 µl complete growth medium without antibiotics with 20,000 cells to each well containing RNAi molecule-Lipofectamine™ 2000 complexes. This gives a final volume of 150 µl and a final RNA concentration of 100 nM. Mix gently by rocking the plate back and forth.3. Incubate the cells at 37°C in a CO2 incubator until you are ready to harvest cells and assay for your target gene.We recommend harvesting cells 24-48 hours after transfection to assay for target gene knockdown.Part no. 250877w.pps Rev. Date: 8 Sep 2005 For research use only. Not intended for any animal or human therapeutic or diagnostic use.For technical support, contact tech_service@.Page 2 Transfection Optimization.• 0.25 µl Lipofectamine™ 2000 per well is recommended as a starting point but optimization of transfection conditions may be required. A range of 0.125 µl to 1 µl is recommended.• Note that for highly potent RNAi molecules (i.e. RNAi molecules inducing > 90% target knockdown), the amount of dsRNA required to obtain effective knockdown may be less than the amounts specified. This needs to be determined empirically for each cell line.Limited Use Label License No. 27: Lipofectamine™ 2000The purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) to not transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. Use of this product in conjunction with methods for the introduction of RNA molecules into cells may require licenses to one or more patents or patent applications. Users of these products should determine if any licenses are required. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of patents owned by Invitrogen and claiming this product based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. If the purchaser is not willing to accept the limitations of this limited use statement, Invitrogen is willing to accept return of the product with a full refund. For information on purchasing a license to this product for purposes other than research, contact Licensing Department, Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, California 92008. Phone (760) 603-7200. Fax (760) 602-6500.Limited Use Label License No. 173: Inhibition of Gene Expression by Double-Stranded RNAThis product’s and/or its use may be covered by one or more of U.S. Patent No. 6,506,559 and/or foreign equivalents, and is sold under license to Invitrogen Corporation by the Carnegie Institution of Washington, 1530 P Street, N.W. Washington, DC 20005. A separate license from the Carnegie Institution of Washington may be required to use this product.Limited Use Label License No. 196: Stealth™ RNAiThe purchase of this product conveys to the buyer the non-transferable right to use the purchased amount of the product and components of the product in research conducted by the buyer (whether the buyer is an academic or for-profit entity). The buyer cannot sell or otherwise transfer (a) this product (b) its components or (c) materials made using this product or its components to a third party or otherwise use this product or its components or materials made using this product or its components for Commercial Purposes. The buyer may transfer information or materials made through the use of this product to a scientific collaborator, provided that such transfer is not for any Commercial Purpose, and that such collaborator agrees in writing (a) not to transfer such materials to any third party, and (b) to use such transferred materials and/or information solely for research and not for Commercial Purposes. Commercial Purposes means any activity by a party for consideration and may include, but is not limited to: (1) use of the product or its components in manufacturing; (2) use of the product or its components to provide a service, information, or data; (3) use of the product or its components for therapeutic, diagnostic or prophylactic purposes; or (4) resale of the product or its components, whether or not such product or its components are resold for use in research. Invitrogen Corporation will not assert a claim against the buyer of infringement of patents owned by Invitrogen and claiming this product based upon the manufacture, use or sale of a therapeutic, clinical diagnostic, vaccine or prophylactic product developed in research by the buyer in which this product or its components was employed, provided that neither this product nor any of its components was used in the manufacture of such product. 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lipo2000转染方法
lipo2000转染方法Lipo2000转染方法引言：Lipo2000是一种常用的转染试剂，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Lipo2000转染方法的原理、步骤以及其在实验中的应用。
一、原理：Lipo2000转染试剂是一种基于脂质体的转染方法。
其原理是通过脂质体与目标DNA或RNA结合形成复合物，然后将复合物转染至靶细胞中。
脂质体的疏水性结构使其能够与负电荷的核酸结合，从而实现核酸的传递。
二、步骤：1. 准备工作：a. 将Lipo2000转染试剂取出并放置于室温下回温。
b. 根据实验需要，准备好需要转染的靶细胞。
c. 根据转染试剂和靶细胞的要求，选择合适的培养基和培养条件。
2. 转染复合物的制备：a. 将所需的DNA或RNA与Lipo2000转染试剂按照一定的比例混合，轻轻摇晃使其均匀混合。
b. 将混合液静置一段时间，使其形成稳定的脂质体-核酸复合物。
3. 细胞转染：a. 将转染复合物滴加到准备好的细胞培养基中，轻轻摇晃培养皿使其均匀分布。
b. 将培养皿放回培养箱中，按照细胞的培养要求进行后续处理。
4. 细胞培养：a. 根据实验需要，选择合适的培养基和培养条件进行细胞培养。
b. 根据实验设计，进行所需的时间点采样或进一步处理。
三、应用：Lipo2000转染方法在生物医学研究中有着广泛的应用。
以下列举几个常见的应用领域：1. 基因功能研究：通过转染特定基因的siRNA或miRNA，可以实现对基因的特定抑制，从而研究其功能。
2. 蛋白表达调控：通过转染携带特定启动子的DNA或RNA，可以实现对目标蛋白的表达调控。
3. 细胞信号通路研究：通过转染特定信号通路相关基因的DNA或RNA，可以研究该信号通路的调控机制及其在疾病发生发展中的作用。
4. 肿瘤药物筛选：通过转染肿瘤细胞系，可以评估特定药物对肿瘤细胞的抑制效果，为药物筛选提供参考依据。
5. 病毒感染研究：通过转染携带特定病毒基因的DNA或RNA，可以模拟病毒感染过程，研究病毒的传播机制和致病机理。
lipo2000转染操作步骤 new
Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以6孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
（含血清，不含抗生素）注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（12小时后）每个孔转染方式如下：A 将100pmol siRNA溶于250ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将5ul lipo2000溶于250ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，用PBS洗2次，将6孔板培养基换成Opti-mem，每孔1.5ml。
将C 管mix加入6孔板对应孔中， 6小时后换成有血清培养基。
Plasmid DNA Transfection转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
（含血清，不含抗生素）贴壁细胞：第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：中板后随即转染。
2 转染。
A 将4ug DNA溶于250ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将10ul lipo2000溶于250ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，用PBS洗2次，将6孔板培养基换成Opti-mem，每孔1.5ml。
将C 管mix加入6孔板对应孔中， 6小时换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
lip2000转染说明书
4. 哺乳动物细胞siRNA转染4.1 转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。
目前用的最多的是阳离子脂质体法。
4.1.1 磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
4.1.2 电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
4.1.3 DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.1.4 机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
4.1.5 阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
lip2000转染说明书
Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml 含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。
复合物可以在室温保持6小时稳定。
直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
lipo2000转染操作步骤复习过程
Lipo2000 瞬时转染细胞步骤Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
SiRNA 使用说明
0.25µL
10-100
0.25µL(0.2-0.5µL)
100µL(50µL+50µL)
30nM
0.15µL
10-100
0.25µL(0.2-0.5µL)
100µL(50µL+50µL)
20nM
0.1µL
10-100
0.25µL(0.2-0.5µL)
100µL(50µL+50µL)
10nM
0.05µL
荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察，也可以通过流式细胞仪检测，确定是否有效转染及转染效率的高低。荧光标记的 siRNA 还可用作追踪 siRNA 在胞内的定位及分布的情况。
表 2 锐博生物荧光标记 siRNA 种类
Dye
Max Excitation Max Emission Compatible Filter Compatible Fluorescence
5µL(2.5-6µL)
2mL(1500µL+500µL)
20nM
2µL
500-1000
5µL(2.5-6µL)
2mL(1500µL+500µL)
10nM
1µL
500-1000
5µL(2.5-6µL)
转染小贴示(以 24 孔板为例)：
a. 24 孔板每个孔的细胞培养总体积是 500µL。由于 siRNA-lipo2000 混合液的体积是 100µL，转染前可以先将原细胞培养 基(500µL)吸弃，更换为 400µL 无抗生素(可含血清)的新鲜培养基，使得培养基体积与 siRNA-lipo2000 混合液体积之 和刚好达到 500µL。转染时，各用 50µL Opti MEMⅠ来分别稀释 lipo2000 和 siRNA，对于 24 孔板，lipo2000 用量是 1µL/孔；siRNA 用量则根据所选用转染浓度而异(详见“转染 siRNA 用量参考”)。
lipo2000转染操作步骤72900复习过程
Stealth™ RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
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THE RNAi COMPANYRNAi 产品使用手册上海吉玛制药技术有限公司Shanghai GenePharma Co.,Ltd.Ⅰ. RNAi 简介 1A. RNAi 实验原理B. RNAi 实验流程C. RNAi 实验所需试剂D. 上海吉玛 RNAi 相关产品Ⅱ. siRNA设计7A. 哺乳动物siRNA设计B. 上海吉玛 siRNA 产品特性C. siRNA oligo 技术数据Ⅲ. siRNA 对照9A. 普通阴性对照B. 荧光标记的阴性对照C. siRNA阳性对照D. 转染试剂对照E. 避免off-target对照Ⅳ. siRNA 转染10A.siRNA 转染的方法B.Lipofectamin2000 转染试剂C.Lipofectamin2000适用的细胞类型D.转染前细胞培养E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例F.贴壁细胞转染程序G.悬浮细胞siRNA转染程序H.DNA和siRNA共转染细胞程序I. 体内siRNA导入方法J. siRNA转染常见问题与建议Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15A. siRNA细胞转染条件优化B. Real-Time PCR RNAi 效果检测C. Real-Time PCR 结果分析Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20A. western-blot原理B.western-blot操作步骤wC.estern-blot上样液的制备D.western-blot常用试剂的配制Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介A. RNAi实验原理RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。
细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。
B. RNAi实验流程C. RNAi实验所需试剂试剂种类试剂用途siRNA oligo 与您所要敲除靶基因的转录本（mRNA）完全互补转染试剂如脂质体法，lipofectamin2000(invitrogen)，上海吉玛的转染试剂Lipofectamin2000，电穿孔法等实验对照包括阴性和阳性及Mocking control基因表达的检测方法如mRNA水平检测用qRT-PCR；蛋白表达水平检测用western blotD. 上海吉玛 RNAi 相关产品普通siRNA Oligo上海吉玛 siRNA Oligo 是在ISO9000质量标准下生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高度稳定，以退火双链RNA 冻干粉的产品形式提交给用户。
化学修饰siRNA Oligo上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时与标准siRNA 作用时间相比，上海吉玛 化学修饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。
荧光标记siRNA Oligo荧光标记siRNA oligo 可用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观察siRNA 转染效率，优化转染条件；荧光标记的siRNA 还可用于siRNA 细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。
siRNA 阴性对照上海吉玛 RNAi negative control 与哺乳动物基因无同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，有利于优化转染条件。
荧光容易拍摄，它有很好的pH 耐受性，因而在活细胞中更稳定。
siRNA oligosiRNA 阳性对照上海吉玛 RNAi positive control 用于确定实验中转染、RNA 提取和检测方法的可靠性。
上海吉玛提供的阳性对照包括LaminA/C 、GFP22、Luciferase GL2、MAPK1、Beta-Actin 、Vimentin 、P53、GAPDH 、Cyclophilin B 等。
siRNA 转染RNAi 转染试剂RNAi 转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门用于转染，确保没有RNAse 活性，细胞毒性低。
适用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导siRNA 高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清培养基中也能表现高转染效率； 4℃下可长期保存。
RNAi 表达 载体法shRNA 表达载体上海吉玛 shRNA 表达载体的特点是：克隆载体具有两种形式的克隆酶切位点BamH1和Bbs1，可形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳定转染细胞系；GFP 报告基因帮助评价转染效率并指示RNAi 发生位点。
上海吉玛现可提供8种 shRNA 表达载体，详见公司总目录C-6页。
Ezol RNA ExtractionReagent Ezol 试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA 提取；无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg ）还是大量的细胞（107）或组织（>1g ）都可得到出色的结果；操作简便，可实现RNA 的快速抽提。
核酸 抽提Enzol RNA ExtractionReagentEnzol 试剂是用于哺乳动物基因组DNA 抽提的试剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNA 提取。
通常使用本试剂，从20毫克组织可以抽提到约40微克基因组DNA ，从106-107Hela 细胞可以抽提到约25微克基因组DNA ，是一种简单、快速、高效、经济的方法。
RNAi-Startup GAPDHControl Kit本试剂盒可以用来优化siRNA 转染条件，也可作为RNAi 实验的内参使用。
荧光标记的dsRNA 可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR 方法准确评价转染前后GAPDH 基因的RNAi 抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。
RNAi-Startup GAPDHBasic Control Kit荧光标记的dsRNA 可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照；应用Real-Time PCR 评价转染前后GAPDH 基因活性时,本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent （目录号QSG-070）。
RNAi Gene-KnockdownEasy Kit使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNA 及转染效率评价”到“实时RT-PCR 验证RNAi Knockdown 效果”的全部过程；荧光标记的dsRNA 可直观的观察细胞转染情况；内含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照及 PCR 扩增引物和探针，可应用定量PCR 方法直观评价转染效率及验证GAPDH 的RNAi 抑制效果；可作为RNAi 实验的阳性和阴性对照使用。
RNAi-Startup IFNResponse Basic Control Kit 哺乳动物细胞中长链的双链RNA （dsRNA ）能够诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。
如果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异性的IFN 效应，则可用本试剂盒进行验证；应用Real-Time PCR 检测非特异性IFN 效应时，本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent （目录号QSG-070）。
RNAi-Startup IFN Response Control Kit如果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异性的IFN 效应，则可用本试剂盒进行Realtime PCR 验证；同时检测PKR, OAS-1和 hStat1三个IFN 效应基因并提供GAPDH 管家基因对照；检测灵敏度高，结果直观且易于判断。
基因 表达 检测常备的RNAi 管家基因Control 试剂盒上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi 实验Control Kits ，以方便广大科研工作者开展RNAi 实验。
详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR 分册C8页。
Ⅱ. siRNA 设计A. 哺乳动物siRNA 设计哺乳动物siRNA 设计需要注意的几个方面1． 从转录本（mRNA ）的AUG 起始密码开始，寻找“AA ”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。
正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA 重复)来设计。
2． 避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。
基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因序列的选择。
目的序列可以随机选择也可以通过在目的基因的不同区域上测试不同的序列以决定何种序列是最有效的。
3． siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。
4． 在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions ，UTRs ），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。
5． 将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。
6． 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST （/BLAST/）。
7． 选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA ，以找到最有效的siRNA 序列。
8． 阴性对照:一个完整的siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA 应该和选中的siRNA 序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性。
通常的做法是将选中的siRNA 序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。
9．有结果显示，UU 结尾和dTdT 结尾的siRNA 在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。
合成siRNA 时可直接提供以AA 打头的21个碱基序列。
B. 上海吉玛 siRNA 产品特点上海吉玛 拥有处于国际领先水平的siRNA 化学合成的全部核心技术，包括RNA 单体合成、普通siRNA 合成、化学修饰siRNA 合成、荧光标记siRNA 合成等。