《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建
基因工程试验指导
《基因工程》实验指导湖南师范大学生命科学学院遗传与发育生物学系2009年5月基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。
在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。
二、实验原理转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。
三、材料限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品；3. 2菌株及细胞系DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃；3. 3 质粒与表达载体系统3. 3.1 pEGFP-N1载体pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。
含有人类巨细胞病毒（CMV）启图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是现代生物技术的重要组成部分，通过改变生物体的基因组，使其具有新的特性或功能。
斑马鱼作为一种常见的实验动物模型，被广泛应用于生物学研究中。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖技巧，帮助研究者顺利进行相关实验。
一、斑马鱼胚胎的获取斑马鱼胚胎的获取是进行转基因实验的第一步。
通常情况下，斑马鱼胚胎可以通过自然产卵或人工授精获得。
为了提高产卵的效率，可以将斑马鱼置于特定的环境条件下，如适宜的水温和光照条件。
此外，还可以使用药物刺激促进斑马鱼产卵。
对于人工授精，可以将雄性和雌性斑马鱼分别放入相同的容器中，利用它们的自然产卵和受精过程来获得胚胎。
二、胚胎的培养获得斑马鱼胚胎后，需要进行胚胎的培养。
首先，将胚胎转移到培养皿中，添加适宜的培养液，如E3培养液。
E3培养液中含有必需的营养物质，可以为斑马鱼胚胎提供所需的营养。
同时，保持培养皿中的水温和光照条件也非常重要，通常将其保持在28-30摄氏度，并提供适量的光照。
三、转基因技术的应用在斑马鱼胚胎培养的基础上，可以进行转基因技术的应用。
目前，常用的转基因技术包括转基因敲除和转基因过表达。
转基因敲除是通过将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其失去特定基因的功能。
而转基因过表达是将外源基因导入斑马鱼胚胎，使其在特定生理条件下过度表达。
这些转基因技术可以帮助研究者研究特定基因的功能和调控机制。
四、转基因斑马鱼胚胎的鉴定进行转基因实验后，需要对转基因斑马鱼胚胎进行鉴定。
常用的鉴定方法包括PCR、荧光显微镜观察和基因测序等。
PCR是一种常用的分子生物学技术，可以通过检测特定基因的存在来鉴定转基因斑马鱼胚胎。
荧光显微镜观察则是通过检测转基因斑马鱼是否发出特定颜色的荧光来鉴定。
基因测序则可以直接确定转基因斑马鱼胚胎中特定基因的序列，从而进行准确的鉴定。
五、转基因斑马鱼胚胎的进一步研究鉴定转基因斑马鱼胚胎后，可以进行进一步的研究。
例如，可以观察转基因斑马鱼胚胎在不同生理条件下的表型变化。
斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达
p53 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 成 功 表 达 ，表 达 的 p53 融 合 蛋 白 分 子 量 大 约 为 53kD，透 析 复 性 后 获 得 了 高 纯 度
可溶性的 p53 蛋白。
关键词：p53 基因；斑马鱼；原核表达
中 图 分 类 号 ：Q786
文 献 标 识 码 ：A
文 章 编 号 ：0439－8114 （2010）03－0526-03
胞。 挑取单克隆菌落接种于 LB 培养基中，37℃摇荡 过夜， 转接扩大培养至菌液 OD600 达 0．5～0．8 时，加 入 终 浓 度 为 1 mmol ／ L 的 IPTG，37℃ 诱 导 1、3、5h 后，分别取样进行 SDS－PAGE 分析，5 h 后收集菌体 溶 于 溶 菌 缓 冲 液 （50 mmol ／ L NaH2PO4，300 mmol ／ L NaCl，10 mmol ／ L 咪唑，pH 值 8．0） 中， 超声破碎菌 体 ，12 000 r ／ min 离 心 20 min， 分 别 取 上 清 和 沉 淀 进行 SDS－PAGE 分析。 1．2．6 p53 蛋 白 的 变 性 纯 化 及 复 性 参 照 Qiagen 镍柱蛋白纯化操作步骤，在变性条件下纯化以包涵 体形式表达的 p53 蛋白。 采用尿素梯度透析法对纯 化的 p53 蛋白进行复性，尿素浓度梯度分别为 8、6、 4、2，0M。 首先将变性纯化的 p53 蛋白用变性结合缓 冲 液 （8 mol ／ L 尿 素 ，100 mmol ／ L NaH2PO4，100mM Tris－HCl， pH 值 8．0）稀释 5 倍后装入透析袋中，放 置在透析液中 （100 mmol ／ L Tris－HCl，100 mmol ／ L NaH2PO4，1 mmol ／ L EDTA，2 mmol ／ L 还原型谷胱甘 肽，0．2 mmol ／ L 氧化型谷胱甘肽，20％丙三醇，1％甘 氨酸，pH 值 8．0），4℃磁力搅拌透析 12 h， 每隔 12 h 更换含低浓度尿素的透析液，其他成分不变，最后 将 p53 透析至水中，离心去除沉淀，复性的 p53 蛋 白 冷 冻 干 燥 后 经 12％ SDS－PAGE 电 泳 检 测 后 于－ 80℃保存。
将制作转基因斑马鱼的实验引入本科生基因工程实验课教学的探索与实践
Ｋｅ ｙｗｏｒ ｄ ｓ： ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ； ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｚ ｅ ｂ ｒ ａ ｉｓ ｆ ｈ ； ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ； ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｔ ｅ ａ ｃ ｈ ｉ ｎ ｇ
ＤｏＩ ： １ ０ ． ３ ７ ２ ４ ／ Ｓ Ｐ ． Ｊ ． １ ０ ０ ５ ． ２ ０ １ ３． ０ １ ３ ２ ７
遗传学教学
将 制作转 基 因斑 马鱼 的实验 引入本科 生基 因工程 实验
课教 学 的探索 与实 践
袁 婺洲，邓 云
湖 南 师 范大 学 生 命 科 学 学 院 ，长 沙 ４ １ ０ ０ ８ １
基 因工 程 是生 物技 术 的核心 ，涉 及 基 因片段 的 获取 、基 因克 隆 、基 因转 化 、基 因 的体外 修饰 、转 基 因技术 、基 因表达 及表 达产 物 下游 的大 规模 生产 等 。基 因工程 作 为一 门 实践性 和 技术 性都 很 强 的课
程 ，已经 成 为 国 内外 高校 生物 技术 、生物 工 程及 相
Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅｏ ｆ Ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ， Ｈｕ ｎ ａ ｎＮ ｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｓ ｈ ａ４ １ ０ ０ ８ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ Ａｂｓ ｔ ｒａ ｃ ｔ ： Ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｔ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ｉ ｓ ｏ ｎ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｒ ｅ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ ｃ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｃ ｈ ｉ ｅ ｖ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｎ ｇ ｉ －
斑马鱼原位杂交试验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（力situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年，Nusslein-Volhard等将Cox 建立的RNA原位杂交技术进行了改进，用地高辛（digoxin）标记的RNA在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008年，Bernard Thisse等将该技术进一步优化，使之更敏感，也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 - 69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
一种新型转基因斑马鱼毒物检测系统的建立
绿 色 荧 光 蛋 白 （ ｅ ｎｆ ｏｅｃ ｎ ｒｔｉ， Ｆ ） Ｇｒｅ ｌ ｒｓｅ ｔｐ ｏｅ Ｇ Ｐ ｕ ｎ
１ １ １ 质粒 和菌 株 ．．
芳 香烃 反应元 件 ＡＨＲ ｋ和 ｐ Ｒ Ｄｔ Ｆ Ｍｗｇ ｌｓ ｄ ＋ｐａｍｉ
载体 ， 自行收 藏 。Ｄ ａ感受 态细胞 ， 大泰 克 。 Ｈ５ 博
１ １ ２ 斑 马 鱼 ．．
野 生 型 斑 马 鱼 购 自青 岛 水 族 商 店 ， 实 验 室 于 在 ２ 淡 水 中培 养 ， 节 １ ８Ｃ ０ 调 ２ｈ明／ ２ｈ暗 的光 照 周 期 ， １
亿 亏 与 生 物 Ｚ 程 ２１，ｏ２ Ｎ． ００ＶＩ７ ｏ ． ９
Ｃ ｅ ｓ ｒ ＆ Ｂｉ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉｇ ｈ ｍｉｔｙ ｏ ｎ ｉｅ ｒ ｎ
Байду номын сангаас
一
种 新 型 转 基 因斑 马 鱼 毒 物 检 测 系统 的 建 立
纪喜文 ， 雪。徐殿胜 田 ，
（ ． 东理 工 大 学 生物 反应 器 工程 国 家重 点 实验 室 ， 海 ２ ０ ３ ； １华 上 ０ ２ ７
２ 上海 南方模 式 生物研 究 中心 ， 海 ２１ １ ） ． 上 ０ ２ ０
摘 要 ： 用 转 基 因技 术 成 功 建 立 一 套 绿 色 荧 光 蛋 白（ Ｆ ） 基 因 斑 马 鱼 毒 物 检 测 系 统 。 选 用 芳 香 烃 反 应 元 件 利 Ｇ Ｐ转
ＡＨＲＤｔ ｋ片段 和 ｐ ＲＭｗｇ ｐａｍｉ Ｆ ＋ ｌｓ ｄ载体 ， 通过 酶 切 、 接 和 Ｐ Ｒ 鉴 定等 程 序 成 功 构 建 载 体 ＤＮＡ， 后 通 过 显 微 注射 转 入 连 Ｃ 然
转基因斑马鱼实验
转基因动物（transgenic animal）是指基因组中整合有外源基因的一类动物，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
嵌合体动物（chimera mosaic animal）是只有部分组织细胞的基因组中整合有外源基因的动物，称为嵌合体动物（chimera mosaic animal）。
这类动物只有当外源基因整合入的“部分组织细胞”恰为生殖细胞时，才能将其携带的外源基因遗传给子代，一般用胚胎干细胞法或逆转录病毒载体法制备的第一代转基因动物均为嵌合体动物，而显微注射法得到的第一代转基因动物中，也有20％为嵌合体动物。
转基因动物是指动物所有细胞均整合有外源基因，则具有将外源基因遗传给子代的能力，通常被称为转基因动物。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，而且随着转基因动物技术的发展，转基因产品将会广泛渗透到医疗、卫生、农产品和食品中。
转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。
鱼类是脊椎动物中最丰富多样性的类群，估计达30000 种。
这种多样性反映在诸如形态、行为、生殖、发育、世代时间和对环境的耐受等各种特征的广泛差异，从而使各种转基因鱼模型的常规制作既是挑战，又是机遇。
有的鱼类的卵是透明的，能直接对发育进行监察，有的情况下对活体内报告基因的表达进行判断。
有些鱼的种类还可能进行其他的遗传操作来诱导单倍体、三倍体和纯合子产雌品系。
尽管鱼的种类很多，但作研究用的却要少的多。
因为野生种群的持续减少，为帮助满足高质量蛋白质需要，水产养殖较常用鱼是鲶鱼、虹鳟鱼、罗非鱼、大西洋鲑和鲤鱼。
人BAFF转基因斑马鱼的构建及早期免疫基因表达检测
建立 人 Ｂ Ａ Ｆ Ｆ转基 因斑 马鱼模 型 ， 探 讨其在 自身免疫 性疾病 发病 中的作用 。方法 Ｒ Ｔ ． Ｐ Ｃ Ｒ
法 由 人 淋 巴 瘤 细 胞 克 隆 了人 Ｂ Ａ Ｆ Ｆ基 因 全 长 ８ ５ ５ ｂ ｐ蛋 白 编 码 区 域 ， 构建表 达人 Ｂ Ａ Ｆ Ｆ重 组 质 粒 Ｔ ｏ １ ２ 一 ｈ Ｂ Ａ Ｆ Ｆ ， 体 外
ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ａ ｕ ｔ ｏ ｉ ｍ ｍｕ ｎｅ ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｓ ． Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄｓ ８ ５ ５ ｂ ｐ ＢＡＦ Ｆ ｃ ＤＮＡ ｗａ ｓ ｃ ｌ ｏ ｍ ｈｕ ｍａ ｎ ｌ ｙ ｍｐｈ ｏ ｍａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎｅ ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｔ ｈｅ ＢＡＦＦ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏｎ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ Ｔｏ １ ２・ ｈＢＡＦＦ． Ｔｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｈｅ Ｌ ａ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｂｙ
张力 ，周 昕 ，谢 英 ，刘 超 ，徐 增年 ，刘 树 锋
（ １ ．河 北 医 科 大 学 实 验 动 物 学 部 、 河北省实验动物实验室 ， 石家庄
２ ．河 北 医 科 大 学 第 三 医 院检 验 科 ， 石家庄 ０ ５ ０ ０ ５ １ ）
０ ５ ０ ０ １ ７ ；
【 摘要 】 目的
【 Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】 ０ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ａ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｚ ｅ ｂ ｒ ａ ｉ ￣ ｈ ｍ ｏ ｄ ｅ ｌ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ ｈ ｕ ｍａ ｎ Ｂ Ａ Ｆ Ｆ ，ａ ｎ ｄ ｓ ｔ ｕ ｄ ｙ ｔ ｈ ｅ ｐ ａ ｔ ｈ ｏ —
转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型
转基因系构建斑马鱼胰岛β-细胞发育模型夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【期刊名称】《贵阳中医学院学报》【年(卷),期】2009(031)005【摘要】目的:斑马鱼的发育周期短和胚胎透明等特点使其已经迅速成为研究脊椎动物器官发育和人类痰病的模式生物之一.为研究斑马鱼的胰岛β细胞的发育,构建了胰岛素生殖系转基因斑马鱼系.方法:构建了斑马鱼胰岛素(insulin,INS)启动子与增强型绿色荧光蛋白(eGFP)组成的表达栽体,命名为INS:eGFP.通过显微注射的方法将INS:eGFP注射到斑马鱼1-细胞期内的细胞质中,荧光筛选获得生殖系胰岛素转基因斑马鱼,并稳定表达传代.结果:建立生殖系胰岛素转基因斑马鱼,活体动态研究胰岛β细胞发育,原位杂交证实eGFP对胰岛β细胞可靠的示踪性.结论:通过胰岛素转基因斑马鱼的构建.可以直观判断胰岛的发育情况,为研究胰岛的损伤和修复提供了一个简便和直观的新型工具.【总页数】5页(P18-22)【作者】夏铭;潘雪;王和生;邓敏;金怡;陈漪;李敏燕;孔德明【作者单位】贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;上海健康科学研究所;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;上海瑞金医院血液学研究所,上海,200025;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001;贵阳中医学院,贵州贵阳,550001【正文语种】中文【中图分类】R965.8;Q578【相关文献】1.新型的动物模型-可示踪胰岛β细胞发育的转基因斑马鱼 [J], 夏铭;潘雪;邓敏;金怡;陈漪;王和生;孔德明2.构建甲硝唑诱导转基因斑马鱼胰岛β细胞的破坏模型 [J], 孔德明;秦帅;李珊珊3.转基因斑马鱼分析胰岛β-细胞发育情况 [J], 夏铭;潘雪;李敏燕;邓敏;张勇;金怡;陈漪;王和生;孔德明4.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨; 郏建新; 康琪; 吴志强; 李明玉5.斑马鱼胰岛α细胞细胞核特异表达mCherry转基因模型的构建 [J], 林春雨;郏建新;康琪;吴志强;李明玉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建
基因工程课程综合实验转基因斑马鱼的构建基因工程是一项对生物的基因进行精确调整的技术。
通过使用基因工程技术，人们可以设计出更加优良的生命体，并为生命体的研究提供更加有力的工具。
此前，学生们在课堂上只是通过书本等介质来学习基因工程的相关知识，而课程实验则更多的停留在理论层面，无法给学生们带来更加深刻的印象。
针对以上问题，一些高校开设了基因工程课程综合实验。
通过此课程，学生们可以在实验室中亲手操作各种基因工程实验，并更好的掌握相关的基因工程实验技术。
本文以某高校为例，介绍一项基因工程课程综合实验——转基因斑马鱼的构建，并从实验的背景、实验步骤和实验意义三个方面来进行详细剖析。
一、实验背景斑马鱼是一种热带淡水鱼，其生长发育周期短，幼鱼透明，移植简便等优点使它成为了许多生物学门类研究的模型生物。
斑马鱼表层神经细胞活动强烈，非常适合用来研究感知、运动和认知的神经环路。
因此，斑马鱼成为神经科学研究、药物筛选、疾病诊断等领域的重要模型生物。
转基因斑马鱼的构建是一项基因工程研究中的重要课题。
通过向斑马鱼中植入人类基因或与斑马鱼有关的基因，可以使得斑马鱼显示出人类疾病的症状，从而更好的研究这些疾病的发生和发展机制。
例如，植入人类神经退行性疾病相关基因的斑马鱼，可以展现出某些神经退行症的症状，可以更好地研究这些疾病的病理涅槃。
二、实验步骤1、设计转基因构和转基因斑马鱼的构建需要进行基因克隆，制备转基因构建质粒。
课程设计中的实验制备的是pPtre-3xFlag-Nf1（Nf1:神经母细胞瘤），这是一种携带3xFlag标签的神经母细胞瘤基因，可用于斑马鱼的转基因实验。
2、制备大量转基因质粒使用大肠杆菌进行转基因质粒大量制备，获得足够多的质粒进行后续操作。
Ptre-3xFlag-Nf1质粒用水切割得到15Kb和6.3Kb的两个DNA段，经过凝胶电泳后得到目标DNA。
3、定量测序分析对转基因质粒进行定量测序分析，保证重要区域为正确序列。
转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建
Construction of Red Fluorescence Protein Transgenic Zebrafish JIAN Qing, BAI Jun-jie, YE Xing, XIA Shi-ling, LAO Hai-hua, LUO Jian-ren（Key Laboratory of Tropical & Subtropical Fish Breeding & Cultivation, CAFS. Pearl River Fishery Research Institute,CAFS. Guangzhou 510380,China）Abstract The cloned myosin light chain 2 promoter was modified by PCR method and was inserted into the vector(pDSRed2) to construct the red fluorescence protein expression vector. The linlinearized expression vector was delivered into one or two cells stage embryo zebrafish by micro-injection. Under fluorescence microscope, red fluorescence had been observed in muscle tissue as early as embryo blood-circling stage, and red fluorescence intends to increase with the growth of the fish. After hatching, almost all the trunk of the red fluorescence transgenic zebrafish was covered with red fluorescence. Keywords: Danio rerio, red fluorescence protein, transgenic, myosin, promoter转红色荧光蛋白基因斑马鱼的构建简清*, 白俊杰, 叶星, 夏仕玲, 劳海华, 罗建仁（中国水产科学研究院珠江水产研究所，中国水产科学研究院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室，广东广州510380）摘要: 采用PCR方法，改造肌球蛋白轻链2启动子，使其适合定向插入红色荧光蛋白载体的多克隆位点，构建成肌肉特异性表达的红色荧光载体。
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧
转基因斑马鱼胚胎养殖技巧引言：转基因技术是一种重要的生物技术手段，通过改变生物体的基因组，可以为人类提供很多益处。
斑马鱼作为一种常用的实验动物模型，其胚胎养殖技巧对于转基因研究具有重要意义。
本文将介绍转基因斑马鱼胚胎养殖的技巧，包括胚胎收集、胚胎培养和胚胎转染等方面。
一、胚胎收集在进行转基因斑马鱼胚胎养殖之前，首先需要从成年斑马鱼体内收集受精卵和早期胚胎。
收集受精卵的方法可以通过自然产卵或人工授精来实现。
自然产卵时，将雌雄斑马鱼放入产卵器中，提供适宜的环境条件，如温度和水质等，等待斑马鱼自行产卵。
人工授精时，将雄性斑马鱼和雌性斑马鱼分别收集到不同的容器中，然后用玻璃棒轻轻按压雄性斑马鱼的腹部，使其释放精子，再将精子加入雌性斑马鱼容器中进行授精。
收集到的受精卵可以放置在含有适宜培养液的培养皿中，继续进行后续的胚胎培养。
二、胚胎培养胚胎培养是转基因斑马鱼胚胎养殖的重要环节。
在胚胎培养过程中，需要控制适宜的温度、光照和培养液等因素，以促进斑马鱼胚胎的正常发育。
通常情况下，将受精卵或早期胚胎转移到含有适宜培养液的培养皿中，然后放置在恒温箱中进行孵化。
在孵化过程中，可以根据需要，调整温度和光照条件，以模拟自然环境。
此外，还可以添加适量的抗生素和抗菌剂，以防止细菌和真菌的污染。
胚胎培养的时间可以根据实验需要进行调整，通常为24小时至72小时不等。
三、胚胎转染胚胎转染是转基因斑马鱼胚胎养殖的关键步骤，通过该步骤可以将外源基因导入斑马鱼胚胎中，实现基因的转移和表达。
常用的转染方法包括注射法和电穿孔法。
注射法是将含有目标基因的DNA溶液注射到斑马鱼胚胎的细胞中，通常选取胚胎早期发育阶段进行注射，以确保外源基因的有效转染。
电穿孔法是通过应用电脉冲来增加细胞膜的通透性，使得外源基因能够更容易地进入斑马鱼胚胎细胞中。
无论采用哪种方法，转染后的斑马鱼胚胎需要经过进一步培养和筛选，才能确定是否成功转染和表达。
结论：转基因斑马鱼胚胎养殖技巧是进行转基因研究的重要环节。
转基因斑马鱼构建技术
转基因斑马鱼构建技术
斑马鱼是一种近年来发展非常迅速的模式动物，在生物医学研究领域有越来越多的应用。
斑马鱼和人类的基因同源性85%以上，疾病信号转导通路高度保守，某些疾病相关基因与人类基因保守性高达99%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，利用高效的ToI2转座酶系统可构建转基因斑马鱼。
斑马鱼作为模式动物，还具有以下的优点：
1、与人类同属于脊椎动物
2、个体较小，因此养殖需要的场地空间较小
3、繁殖力强，可进行高通量筛选
4、体外受精，便于繁育
5、药物用量小
6、早期透明，早期发育迅速，受精后24h主要器官已建成，受精后七天内部器官清晰可见，可以活体进行荧光观察斑马鱼可以用于研究基因表达调控、基因功能域发育、分化、形态发生的关系，也可以用于研究发病机理，也可以用于药物筛选。
[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版
![[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版](https://img.taocdn.com/s3/m/639dd4c214791711cd791766.png)
[宝典]转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达打印版转基因斑马鱼构建与果蝇幼虫荧光基因的瞬时表达蒋驭天(生命科学学院 2008级生物技术 2008300113)同组人:王诗婕吕晓霞刘楚怡一.摘要:本实验对斑马鱼和果蝇幼虫分别导入含EGFP和DFP的质粒，观察其在2中动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察的绿色荧光;在果蝇幼虫体内，才3-4小时时也能观察到红色荧光蛋白基因的瞬时表达。
关键字:转基因斑马鱼果蝇幼虫二.实验器材与试剂:仪器:试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸;42?恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱，超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒。
试剂:EGFP绿色荧光蛋白基因 DFP红色荧光蛋白基因 pEGFP-N2载体 E coli三.实验步骤:转基因斑马鱼构建:1.转染细菌的培养(1)培养基的制备:称取胰蛋白胨3 g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，于一500 mL的三角瓶中，加入蒸馏水至300 mL溶解.若配制固体培养基，则需加入4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用NaOH调pH至7.5。
分装于3个250 mL的三角瓶中，加塞，包扎。
(2)培养基的灭菌与消毒: 在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。
当压力升至0.05 MPa时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到0时，关闭放汽阀，当压力升至1.034 MPa时保持15-30分钟后，停止加热，压力降为0时，打开放汽阀排汽取物。
(3)含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60?左右，加入Amp(氨苄青霉素)储存液,使终浓度为50 μg/mL,摇匀后铺板。
(4)接种加甘油保存的分别含质粒的E coli.，每管接种体积为10 微升(5)37 ?摇床过夜培养24h.2.质粒的小量提取提取步骤:(1). 样本处理:收集已培养12,16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。
过表达Baff转基因斑马鱼的构建
过表达Baff转基因斑马鱼的构建张力;谢英;刘树锋【摘要】Objective To construct pEGFP-Cl-baff, pEGFP-N1 -baff, and pIRES2-EGFP-baff recombinant plasmids, and establish a SLE disease model of Baff overexpressed zebrafish by microinjection and fluorescence screening . The aim is to evaluate the meaning of Baff over expression zebrafish in study of SLE mechanism and drug selection . Methods We cloned baff full length cDNA encoded by 807 bp nuclear acid using spleens RNA of zebrafish by RT-PCR and constructed 3 types of baff overexpression plasmids : pEGFP-Cl -baff, pEGFP-N1-baff- and pIRES2-EGFP-baff. Baff protein expression was estimated by in -vitro cell transfection and Western blotting. Results 3 types of baff overexpression plasmids were examined by agarose gel electrophoresis . Western blotting and in-vitro transfection confirmed the expression of Baff-GFP fusion protein. We also obtained the baff over expression zebrafish by microinjection and fluorescence screening. Conclusion All the plasmid we constructed in our research have been estimated and could be used to generate the disease model of baff overexpression zebrafish which can be manipulated for immune -disease research.%目的体外克隆斑马鱼baff基因并分别构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒,通过胚胎显微注射获得过表达baff的转基因斑马鱼,以探讨其作为人类SLE模型和用于SLE药物筛选的意义.方法通过RT-PCR法由斑马鱼脾脏克隆出斑马鱼baff基因全长807 bp蛋白编码区域,分别构建baff过表达载体pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff 及 pIRES2-EGFP-baff重组质粒,体外细胞转染并通过免疫印迹法验证蛋白表达后,通过胚胎显微注射过表达载体,GFP荧光跟踪并筛选阳性鱼.结果通过体外细胞转染实验与免疫印迹法验证了pEGFP-C1-baff,pEGFP-N1-baff转染后细胞Baff-GFP融合蛋白的成功表达,通过胚胎显微注射与GFP荧光筛选,成功获得过表达baff的转基因斑马鱼.结论本研究所构建pEGFP-C1-baff、pEGFP-N1-baff、pIRES2-EGFP-baff重组质粒均可通过显微注射获得过表达baff的阳性转基因斑马鱼,为进一步探讨其作为人类SLE疾病模型的意义及Baff拮抗药物的筛选奠定基础.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2012(022)011【总页数】5页(P46-49,后插4)【关键词】系统性红斑狼疮;B细胞活化因子;斑马鱼;转基因【作者】张力;谢英;刘树锋【作者单位】河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017;河北医科大学,河北省实验动物重点实验室,石家庄,050017【正文语种】中文【中图分类】R332斑马鱼具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖，可针对治疗药物进行高通量筛选等诸多特点，使其成为后基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一［1，2］。
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《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建
实施方案
《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标
《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学计划中占有极为重要的地位。
《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，已经有10余年的开课历史。
全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。
湖南师范大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础， 2008年《基因工程》建设成为了湖南省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。
基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性很强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却发展十分迅速的学科，对探索生命的本质、推动整个生物学科的发展起着巨大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。
通过《基因工程》的学习，使学生掌握基因工程的基本原理、基本方法和最新发展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的基本操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲
课程名称：基因工程（实践课程部分）
课程编号：
面向专业：生物技术、生物科学、基地班
课程总学时：理论51学时，实验34学时_
实验学时：34_
课程学分：理论3学分，实践2学分
一、实验目的
本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理
和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生基因工程基本实验操作、实验设计、
实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素质和实践能力的培养。
二、实验内容、学时分配与组织
三、教学管理模式与注意事项
1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。
2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。
3．实验小组人数为4人，由学生独立操作。
每个实验的时间根据实验流程本身决定，长短不一，但需要集中的时间。
4．要求学生掌握基本的操作方法，如实逐项记录数据，独立完成实验报告，并当天上交。
四、成绩评定与占课程总成绩的比例
1．指导教师对实验报告应认真批改，记录每一次的实验成绩。
2．根据平时实验操作成绩，给出实验操作考试成绩，以占课程总成绩30%的比例纳入课程的总成绩。
五、设备与器材配置（每组）
1．试管、试管架、可调式微量加样器等；
2．电泳仪、电泳槽、染色缸；42℃恒温水浴箱、冰浴；
3．恒温振荡箱，超静工作台。
4．手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管。
5．倒置显微镜、摄像系统（CCD），发圈。
6．自动水循环系统一套，孵化水槽。
六、实验指导与参考资料
1．基因工程实验指导，转基因斑马鱼的构建，湖南师范大学生命科学院遗传与发育生物学系自编，，2009年
2. 盛小禹. 基因工程实验技术教程复旦大学出版社。
3．彭秀玲.袁汉英.谢毅.王洪海. 基因工程实验技术湖南科学技术出版社。
《基因工程》课程综合实验教学可行性分析
一、转基因动物简介
转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。
转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。
转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。
同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。
转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。
二、斑马鱼具有实验动物诸多优点
斑马鱼实验室繁殖与操控技术斑马鱼原产于印度、孟加拉等国,属鲤科。
是一种亚热带淡水观赏经济鱼类,成鱼体长大约5cm，呈黄褐色,体表从头到尾覆盖着水平方向的蓝紫色条纹,故又称蓝条鱼。
雄性皮肤偏柠檬色,雌性皮肤偏银灰色,鳍条宽大,发达。
斑马鱼具有繁殖能力强，一年四季都可产卵，产卵可达300～1000 粒，成活率高；卵大、卵径1～1.5mm，体外受精和发育，胚胎透明；性成熟周期短，繁殖周期短，一般7 天左右；个体小易养殖，饲养成本低等诸多优点。
1.斑马鱼受精卵可在实验室获取。
受精前将亲鱼公、母分开饲喂2～3 天(相互之间能够看到,可在饲养箱中加一玻璃隔板,将公、母分开)，繁殖时将公、母按1～2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。
2. 斑马鱼的卵的孵育快而方便
人工孵化受精结束后获得的受精卵要及时捞出，剔除异物。
然后将受精卵移入培养箱中进行孵化，温度为25～28℃，温差不能够超过0.5℃。
这期间可在解剖镜下观察胚胎的发育状况。
大约经过2 天孵化，小鱼就可出膜。
3. 斑马鱼孵化后的喂养容易操纵
孵化时应注意：①虹吸出产卵池底的受精卵时要用直径1cm左右的皮软管,如果用硬质的吸管, 有可对受精卵造成损伤。
②孵化用水、清洗用水，水质要好，水温相差不宜过大，要保持相对恒定，对受精卵来说，剧烈的温度变化会引起胚胎死亡。
③孵化期间每天要及时清除败育卵，勤换水。
刚孵出的仔鱼呈淡黄色，在解剖镜下可见到跳动的心脏，流动的血液，腹部有一很大的、未吸收的卵黄囊。
头2～3 天仔鱼静卧于水底,，此时不需要饲喂。
注意及时将卵膜和白色的死卵捞出，每天更换新水，将鱼苗置于温室内，温度为25℃(可放在空调房间内)。
3～4日龄时仔鱼可自由游泳(平游)并开始觅食，此时可用绢网取少许蛋黄在水中轻轻地搅动，至水微呈淡黄色。
适当加喂钙素母片、复方ＶＢ液、土霉素等，以提高鱼苗的成活率。
喂要少量多餐，日喂3～4 次。
7～10 日龄时加喂草履虫，啤酒酵母等，3 周龄投喂卤虫的无节幼体,并逐渐添喂配合饲料。
在饲喂过程中要注意水质的变化，勤换水，少喂勤添，以确保鱼苗
健康生长。
三、斑马鱼基因移植的方法可靠
基因移植的方法包括细胞质的显微注射，发生泡的显微注射，胚胎或精子的电转移，逆转录病毒感染及颗粒枪攻击等。
其中显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核)，注入特定的外源基因，即为基因显微注射法。
此法的优点是，在一定设备和经验条件下，实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直接导入原核内，导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合，其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，妨碍其表达的正常调节。
用拉制的毛细血管针往刚受精的乱的细胞质注射DNA是制作转基因鱼的最可靠方法，其生殖系遗传和转基因表达的效率皆令人满意。
因此，显微注射法仍然是将DNA导入与基因组的最常用方法。
往细胞质进行DNA显微注射产生转基因鱼的一般的步骤是：①准备育种种群；②收集受精卵；③向1-细胞胚胎细胞质注射DNA；④鉴定携带转基因的鱼；
⑤将首代动物与野生型鱼交配确证通过生殖系遗传。
为提高胚胎的存活率和获得转基因首代动物的总效率，需要用保证DNA 最佳纯度的标准方法制备DNA 构件。
转基因整合的效率取决于注射的DNA 浓度，而卵的存活能力与DNA 浓度则呈相反的关系。
控制注射到细胞的DNA量是通过DNA 浓度而不是注射DNA 溶液的体积来调节。
为代偿注射到大体积的细胞质导致DNA 的稀释，为使注射的DNA 进入细胞核达到适当的概率，而同时也使注射后的胚胎维持令人满意存活率（50％），注射时所用DNA的浓度应配成50～200ng/ml（约大于104～106转基因靠拷贝）。
四、转基因鱼实验方法可行
1．转基因鱼制备
（1）材料
斑马鱼1细胞期受精卵
（2）仪器、用具手动显微注射器、体式显微镜、倒置显微镜、眼科镊、摄像系统（CCD）、注射针、发圈、小酒精灯、数码相机、硼硅酸玻璃毛细管（3）试剂
准备好的重组目的片段的质粒。
（表达载体构建是本综合实验的重要组成部
分，由于实验中心分子生物学实验室已具备表达载体构建条件及相应的技术平台，在本讨论稿中不再提出有关分子操作的实验细则）
（4）方法
①注射外源DNA的处理，注射时所用的DNA浓度应配成0.15μg/μl。
② DNA(5μl)填装入注射针，不要引入气泡，以免干扰注射。
③将成批分选和洗净的卵移到有琼脂糖的表面皿中。
④一边轻轻地用眼科镊将卵固定，将卵定位在视野中心，使动物极方向向
上。
⑤注射前小心将显微注射针定位，将针垂直定位到卵表面是穿透坚硬的卵
壳注射成功的关键。
⑥然后推动注射针，使其刺入受精卵的动物极一细胞中，将DNA注入(约
2nl) 。
⑦注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入装有水的培养皿中，使其恢
复。
一般50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。
2．转基因鱼的孵化。
斑马鱼在干净的水中孵化注射后的卵，及时清除死去的卵，并记录正常发育和死亡的卵数。