细胞培养概述2006级研
壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠_壳聚糖微胶囊性能的影响
Vol.27高等学校化学学报No.1 2006年1月 CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 182～186壳聚糖溶液pH对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响于炜婷1,刘袖洞1,李晓霞2,綦文涛1,任东文1,马小军1(1.中国科学院大连化学物理研究所生物医学材料工程组,大连116023;2.四川大学材料科学工程学院,成都610064)摘要 以激光共聚焦扫描显微镜为研究手段,原位直观地考察了在不同pH条件下聚电解质膜的络合程度和蛋白扩散情况.通过分析pH值对微胶囊膜性能的影响规律,并结合不同种类细胞对环境pH的敏感特性,确定了制备细胞培养用海藻酸钠2壳聚糖微胶囊的最佳pH值.结果表明,当壳聚糖溶液的pH值由3150增加到6150,微胶囊膜的络合深度呈现高2低2高的趋势,而微胶囊膜的膨胀性能呈现低2高2低的趋势,模型蛋白通过微囊膜的扩散呈现低2高2低的趋势,拐点均出现在pH=4100和5150处.结合动物细胞及微生物细胞对环境pH耐受能力的考察,确定制备微囊化动物细胞时,微胶囊成膜反应溶液的最佳pH值为5150;制备微囊化大肠杆菌时,反应溶液的最佳pH值为5100;制备微囊化酵母菌时,反应溶液的最佳pH值为4150.关键词 海藻酸钠;壳聚糖;pH;微胶囊;细胞培养中图分类号 O636;R318108 文献标识码 A 文章编号 025120790(2006)0120182205微胶囊通常是指外层为高分子膜,内部为三维网状结构的球囊.作为细胞的固定化载体,外层高分子膜的选择透过性能保证了微胶囊内外的物质交换,而内部空间结构提供了细胞贴壁的表面,在反应器中进行微囊化细胞培养时,外部搅拌可使其处于悬浮状态而剪切力不伤及细胞活性,从而将贴壁和悬浮培养的优点集于一身,因此,微胶囊在细胞大规模培养的基础研究和工业应用方面都得到广泛重视[1].我们曾利用天然多糖海藻酸钠和壳聚糖之间的聚电解质络合反应制备了海藻酸钠2壳聚糖(A lginate2chit osan,AC)微胶囊[2],其囊膜是由壳聚糖单体分子上质子化的氨基和海藻酸钠单体分子上的羧基间通过静电力或氢键形成的聚电解质复合膜[3],因此,壳聚糖溶液pH直接决定两种聚离子暴露的电荷基团及分子结构,从而对复合膜的形成、膨胀性能及通透性都有明显的影响.本文重点考察了反应溶液的pH值对复合膜的膜厚、膜的膨胀性能及蛋白扩散性能的影响规律.对于囊内细胞而言,由于细胞对制备微胶囊过程中环境的pH比较敏感,因此,在考察反应溶液pH值对细胞活性影响规律的前提下,选择适宜的反应溶液pH值,对制备用于动物细胞或微生物细胞培养的AC微胶囊具有明确的指导意义.1 实验部分1.1 试剂与仪器海藻酸钠(Sodiu m alginate,简写为alg,化学纯,青岛海藻工业公司);壳聚糖(Chit osan,简写为chi,M w=411×104,参照王勇等[4]方法改性);荧光素异硫氰酸酯(Fluorescein is othi ocyanate,简写F I TC,Sig ma产品);罗丹明异硫氰酸酯(Rhoda m ine B Is othi ocyanate,简写RB I TC,Sig ma产品);胰蛋白酶(Tryp sin,Sig ma产品);中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Ha m ster Ovary,简写CHO,本实验室保存);大肠杆菌(Escherichia coli DH5α,简写E.coli DH5α,本实验室保存),啤酒酵母菌(Saccha ro m yces cere2 visiae,简写S.cerevisiae,大连理工大学白凤武教授馈赠).收稿日期:2004212224.基金项目:国家自然科学基金(批准号:20236040)及国家“九七三”计划项目(批准号:2002CB713804)资助.联系人简介:马小军(1958年出生),男,研究员,博士生导师,从事生物医用材料工程学研究.E2mail:maxj@高压静电场发生器(中国科学院大连化学物理研究所自制[5]);激光共聚焦扫描显微镜(ConfocalLaser Scanning M icr oscope,简称CLS M ,德国Leica 公司,T CS 2SP2);激光粒度仪(美国Beckman 2Coulter 公司,LS 2100Q ).1.2 实验过程1.2.1 AC 微胶囊的制备及其膜厚的测量 参照文献[6]方法制备出海藻酸钙凝胶珠,将其与质量体积分数015%F I TC 标记后的壳聚糖溶液(pH 值分别为3150,4100,4150,5100,5150,6100,6150)成膜反应15m in,形成AC 微胶囊.CLS M 透射光和荧光(激发/发射:488/530nm )通道同时扫描,在不同显微镜视野下获取图像15幅,在10×10放大倍数下共获得微胶囊100～200个,选取透射光与反射光完全重叠且粒径均一的微胶囊,用CLS M 软件2Quantify/Pr of .分别读取40个微胶囊的膜厚,计算均值和标准差.1.2.2 微胶囊膜膨胀度的测定 将AC 微胶囊用55mmol/L 柠檬酸钠溶液液化后,用激光粒度仪测定各组微胶囊的平均粒径,参照文献[7]方法按照下列方程计算膨胀度:S w =D 3t -D 30D 30×100%式中,S w 为膨胀度,D t 为AC 微胶囊液化后的直径,D 0为海藻酸钙胶珠的直径.1.2.3 微胶囊膜通透性能的测定 以RB I T C 标记的Tryp sin 为模型蛋白,将AC 微胶囊按体积比为1∶20加入到标记好的蛋白溶液中,用CLS M 以xyt 模式扫描,每30s 扫描一幅图像,共21幅.扫描结果用软件Quantify /Quant 记录单个微胶囊内荧光量增加的动态曲线,记录3组数据,并取平均值.1.2.4 壳聚糖溶液pH 对动物细胞活性的影响 在96孔板中均匀接种CHO 细胞,生长过夜后,分别与pH 值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6150的壳聚糖溶液及生理盐水接触反应,15m in 后弃去溶液,用生理盐水洗涤3次后加入RP M I 21640培养液,培养过夜.以生理盐水作对照,用MTT 法计算各组细胞存活率,以8组重复数据取平均值.1.2.5 壳聚糖溶液pH 对微生物细胞活性的影响 同等条件下获得8组处于对数生长期的大肠杆菌E .coli DH5α,经离心获得菌体细胞,分别加入pH 值为3150,4100,4150,5100,5150,6100和6150的壳聚糖溶液和生理盐水,15m in 后,用稀释平板法获得各组残余活细胞数,以生理盐水反应组为对照,计算各组细胞的存活率,3组重复数据取平均值.用同样方法测定不同pH 壳聚糖溶液对酵母细胞S.cerevisiae 存活率的影响.F i g .1 M e m brane th i ckness and swelli n g degree of AC m i crocapsules a s a functi on of pH of ch itos an soluti on2 结果与讨论海藻酸盐分子链由甘露糖醛酸(Mannur onic acid,M )和古罗糖醛酸(Gulur onic acid,G )构成,其p K a 值分别为3138和3165[8],而壳聚糖的p K a 值为613[9].因此,当溶液pH 值发生变化时,海藻酸盐和壳聚糖的解离度、海藻酸盐分子链上的羧基和壳聚糖分子链上的伯氨基的电荷密度都会发生显著变化,从而对聚电解质成膜反应进行的程度和过程产生影响,最终对微胶囊膜性能产生影响.2.1 壳聚糖溶液pH 对壳聚糖分子成膜深度的影响当反应溶液的pH 值由3150增至4100时,pH值接近海藻酸钠的p K a 值,海藻酸盐链节中—COO -基团随pH 值的升高而增多,壳聚糖由于其p K =613,在低pH 值范围内—NH +3较多,因而成膜反应程度随着—COO -基团的增多而加深,表现为微胶囊膜厚增加.当pH 值从4100增加到5150,p K alg <pH <p K chi ,根据Le wis 酸碱平衡理论,在此区间,海藻酸盐链节中—COO -基团随pH 值381 No .1 于炜婷等:壳聚糖溶液pH 对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响的升高而继续增多,但壳聚糖分子中的—NH+3随pH值的升高而减少,与海藻酸钠的络合程度随之降低,表现为膜厚随pH的升高而减小.随着pH继续升高(从5150到6150),尤其在接近p Kchi时,壳聚糖分子发生了空间构象的改变,分子在空间的伸展最小而具有更高的分子扩散系数,能更深的进入海藻酸钙的凝胶网络,因此,表现为膜厚又有所增加(见图1).Skj…k2B r•k等[10]对海藻酸钙胶珠与壳聚糖分子反应的研究结果表明,当pH值从4到6尤其是从5到6时,壳聚糖成膜程度随pH值增加而加深.他们分析认为,pH增加,壳聚糖分子的电荷密度降低导致空间伸展变小而有更高的扩散系数,因而决定壳聚糖分子键合程度的主要因素是壳聚糖分子的空间结构与海藻酸钙凝胶网络孔径的匹配程度.但Skj…k2B r•k等的研究对象是通过引入反凝胶离子形成的结构均一的海藻酸钙凝胶网络.本文的研究对象是普通外部凝胶化获得的内部疏松表面致密[11]的非均匀凝胶网络.因此,结合实验结果我们认为,与非均匀海藻酸钠凝胶网络反应时,当壳聚糖溶液的pH<5150时,影响壳聚糖键合程度的主要因素是壳聚糖分子的电荷数量;当pH>5150时,尤其是接近其等电点时,影响壳聚糖键合程度的主要因素是壳聚糖分子的空间结构.2.2 壳聚糖溶液pH对微胶囊膜膨胀性能的影响规律微胶囊膜的膨胀性能直接影响微胶囊在应用过程中的稳定性.因为AC微胶囊的核心是海藻酸钙水凝胶,当其遇到氯化钠或柠檬酸钠等电解质溶液时会发生Na+与Ca2+之间的离子移变,导致凝胶由固态转为液态,并发生体积膨胀,通常称之为“液化”[12].AC微胶囊膜的膨胀性能与壳聚糖分子的键合程度和膜的致密程度有直接关系.当反应溶液pH值由4150增至5150时,p Kalg<pH<p K chi,海藻酸钠和壳聚糖分子都以伸展的结构存在,二者的键合程度主要由壳聚糖分子的电荷数量决定,形成的微胶囊膜比较致密,其膨胀度与壳聚糖分子的键合程度呈反比.当pH<4150时,由于接近海藻酸钠的p Ka,海藻酸钠界面上—COOH基团的浓度很高,与壳聚糖反应的—COO-基团很少,分子间的静电引力降低,膜强度降低,表现膨胀度随着pH值降低而增大.当pH>5150时,由于接近壳聚糖的p Ka,壳聚糖链节中以—NH2为主,只有极少量的—NH+3基团与海藻酸钠发生络合反应.这种由分子扩散进入凝胶网络所形成的膜,虽然表现出的膨胀度随膜厚的增加而略降低,但由于在此pH值范围内形成的络合膜缺乏分子间静电力的吸引作用,膜强度的整体水平较低(图1).2.3 壳聚糖溶液pH 对微胶囊膜通透性的影响规律F i g.2 The curves of trypsi n2RB I TC d i ffusi oni n to AC m i crocapsules F i g.3 Effect of pH of ch itos an soluti on on thed i ffusi on of trypsi n2RB I TC i n to ACm i crocapsulesAC微胶囊膜的通透性能主要与膜厚和膜的致密程度有关.当反应溶液pH值由4100增至6150时,其蛋白的扩散速率与微胶囊膜厚成反比,达到扩散平衡时,蛋白进入微胶囊内的含量随膜厚的增加而减少.当反应溶液pH<4100时,由于pH接近海藻酸钠的p Ka值,海藻酸钠在此条件下,其界面上—COOH基团的浓度很高,暴露的—COO-基团很少.而壳聚糖/海藻酸钠微胶囊膜的形成主要发生在海藻酸钠的—COO-和壳聚糖的NH3+之间.在pH=3150时,海藻酸钠中无法与壳聚糖络合的带有—COOH基团的单体分子会形成各种环状结构[8],使络合的微胶囊膜呈现明显缺陷,蛋白分子更易通过有缺陷的膜,表现为扩散曲线斜率较高(图2).我们将图2数据以反应溶液pH为横坐标,扩散平衡481高等学校化学学报 Vol.27 时扩散进微胶囊内的荧光量为纵坐标重新作图(图3),可以清晰地体现出蛋白扩散量随反应溶液pH 值改变的变化趋势.2.4 壳聚糖溶液pH 对动物细胞活性的影响中国仓鼠卵巢(Chinese ha m ster ovary,CHO )细胞是目前常用的用于基因工程的宿主细胞,考察微 F i g .4 Surv i va l ra te of CHO cells after trea t m en t of ch itos an soluti on w ith d i fferen t pH va lues,w ith 019%sod i u m chlor i de a s the con trol 胶囊膜反应溶液pH 值对CH O 细胞活性的影响规律对进一步指导微胶囊化CHO 细胞的制备及其规模化培养生产基因工程药物具有重要意义.结果表明(图4),壳聚糖溶液在5150≤pH ≤6150时,细胞存活率没有明显变化,这是因为尽管动物细胞对环境的pH 值比较敏感,但是由于细胞代谢过程通常会产生如乳酸等酸性物质,会降低周围环境的pH 值,因此,动物细胞在一定范围内能够耐受弱酸环境.但当pH ≤5100时,细胞存活率明显降低.2.5 壳聚糖溶液pH 对微生物细胞活性的影响微生物细胞由于细胞壁的存在比动物细胞更适应环境pH 值的改变.大肠杆菌DH5α和酵母菌S.cerevisiae 是目前应用得最广泛的基因工程宿主菌,因此,考察其对壳聚糖溶液p 值H 的耐受情况,对指导ACA 微囊化微生物细胞的制备具有重要意义.由图5看出,pH =415时大肠杆菌DH5α的细胞存活率降低一个数量级,当pH ≤410时,细胞存活率降低2个数量级以上;而酵母菌在pH =3150时已基本死亡,pH 值在4100～6150时都能保持50%以上的成活率.F i g .5 Surv i va l ra te of E.coli D H5α(A)and S.cerevisiae (B)after trea t m en t w ith d i fferen t ch itos an soluti on s,w ith 019%sod i u m chlor i de a s the con trol3 结 论通过研究AC 微胶囊制备过程中壳聚糖溶液pH 对微胶囊膜膨胀性能和蛋白扩散性能的影响规律,结合动物细胞及微生物细胞对环境pH 改变耐受能力的实验结果,确定了制备载细胞AC 微胶囊时,壳聚糖溶液的最佳pH 值.动物细胞由于没有细胞壁几乎不能耐受环境的剪切力,很难通过提高搅拌速度来提高传质,所以,应该优先考虑微胶囊膜的通透性能.因此,在动物细胞能够耐受的pH 值(5150～6150)区间,选择pH =5150,通过提高培养液中营养物质向微胶囊膜内的扩散能力,保证细胞及时充分的营养供应.微生物细胞由于细胞壁的存在,在很大程度上能耐受环境的剪切力,培养过程中可以通过反应器的高速搅拌来提高反应体系的传质,所以微胶囊膜的通透性能对其并没有突出的影响,而高速搅拌对微胶囊膜强度却有很高的要求,另外,微生物细胞生长迅速、繁殖快、代谢能力强,迅速生长的菌体极易将微胶囊胀破导致菌体泄漏,因此,应重点考虑微胶囊膜的强度.在大肠杆菌能够耐受的pH 区间(5100～6150),选择微胶囊膜强度最好点(pH =5100);在酵母菌能够耐受的pH 区间(4100～6150),选择pH =4150.581 No .1 于炜婷等:壳聚糖溶液pH 对载细胞海藻酸钠2壳聚糖微胶囊性能的影响681高等学校化学学报 Vol.27 参 考 文 献[1] Vandenberg G.W.,D r olet C.,Scott S.L.et al..Journal of Contr olled Release[J],2001,77:297—307[2] XUE W ei2M ing(薛伟明),Y U W ei2Ting(于炜婷),L I U Xiu2Dong(刘袖洞)et al..Che m.J.Chinese Universities(高等学校化学学报)[J],2004,25(7):1342—1346[3] Si m ek2Ege F. A.,Bond G.M.,Stringer J..Journal of App lied Poly mer Science[J],2003,88:346—351[4] WANG Yong,HE Yang,L I U Qun et al..Che m ical Journal on I nternet[J],2000,2(11):02b051ne[5] REN J i2Lun(任吉伦),MA Xiao2Jun(马小军),HE Yang(何 洋).Z L00253538.6[P],2000[6] WANG Yong(王 勇),X I E Yu2B ing(解玉冰),MA Xiao2Jun(马小军).Pr ogress in B i otechnol ogy(生物工程进展)[J],1999,19(2):13—15[7] MA Xiao2Jun(马小军),X I E Yu2B ing(解玉冰),ZHOU L i(周 丽)et al..The Chinese Journal of O rgan Trans p lantati on(中华器官移植杂志)[J],1995,16(4):156—157,189[8] HuguetM.L.,Gr oboill ot A.,Neufeld R.J.et al..Journal of App lied Poly mer Science[J],1994,51:1427—1432[9] Yal paniM.,Hall L. D..Macr omolecules[J],1984,17(3):272—281[10] G…ser d O.,S m idsr d O.,Skj…k2B r•k G..B i omaterials[J],1998,19:1815—1825[11] L iu X. D.,Yu W.Y.,Zhang Y.et al..J.M icr oencap sulati on[J],2002,19(6):775—782[12] L iu X. D.,Xue W.M.,L iu Q.et al..Carbohydrate Poly mers[J],2004,56(4):459—464Effect of pH of Ch itos an Soluti on on Properti es of Sod i u mA lg i n a te2Ch itos an M i crocapsules w ith CellsY U W ei2Ting1,L I U Xiu2Dong1,L I Xiao2Xia2,Q iW en2Tao1,RE N Dong2W en1,MA Xiao2Jun13(1.L aboratory of B io m edical M aterial Engineering,D alian Institute of Che m ical Physics,Chinese A cade m y of Sciences,D alian116023,China;2.College of M aterials Science Engineering,S ichuan U niversity,Chengdu610064,China)Abstract Sodiu m alginate2chit osan(AC)m icr ocap sules are often used as the i m mobilizati on carriers for cell culture.They are co mposed of por ous gel as the core facilitating cell adhesi on,and coated with polyelectr olyte comp lex me mbrane p r otecting cells and all owing selective mass transfer.Therefore,the regulati on and contr ol of me mbrane p r operties can directly affect the gr owth and metabolis m of cells in m icr ocap sules.Among many para meters,pH of chit osan s oluti on is the i m portant one.I n this paper,the f or mati on of polyelectr olyte me m2 brane,the degree of comp lex for mati on and p r otein diffusi on at different pH values were directly observed in situ by using a conf ocal laser scanning m icr oscope(CLS M).The effect of pH on the p r operties of AC m icr o2 cap sule me mbrane was discussed.The op ti m al pH was deter m ined in the p reparati on of AC m icr ocap sules with different cells(ani m al and m icr obial cells).It was de monstrated that the me mbrane thickness showed“high2 l o w2high”shape,the s welling behavi or of m icr ocap sules“l ow2high2l ow”shape and the p r otein diffusi on acr oss the me mbrane“l o w2high2l ow”shape as a functi on of pH,the inflecti on points all appeared at pH=4.00and bining with the sensitivity experi m ent of different kinds of cells t o envir on ment pH,it was suggested that the op ti m al pH of chit osan s oluti on f or AC m icr oencap sulated ani m al cells was5.50,AC m icr oencap sula2 ted E.coli cells5.00,and AC m icr oencap sulated yeast cells such as saccharo m yces cerevisiae(S.cere.)4.50,res pectively.Keywords Chit osan;A lginate;pH;M icr ocap sule;Cell culture(Ed.:Y,Z)。
呼出气体就像人的指纹一样是唯一的
呼出气体就像人的指纹一样是唯一的人体在吸入空气时，含氧的空气被带进肺中，由于生物体需要消耗氧气，产生二氧化碳，因此在呼气的时候，缺乏氧气和富含二氧化碳的空气被呼出。
人体通过呼吸作用来吸入空气中的氧气，排出体内产生的二氧化碳。
实验器材及试剂：Eislab400数字实验系统，数据采集器，氧气传感器，二氧化碳传感器，计算机，面包袋或小塑料袋，胶纸等。
实验步骤及数据分析：1.在塑料小袋底部开两个小口，各套在氧气传感器以及二氧化碳的探头上，用胶纸把塑料小袋和传感器器探头绑在一起，注意保持紧密不漏气.2.将氧气传感器和二氧化碳传感器接入数据采集器，然后进入配套的软件系统，选择“呼出气体的成分研究”模板，然后调节采集参数为1点/秒，采集时间为60秒。
3.向塑料小袋中吹气，然后把袋口握紧，使袋中有正常呼出的气体，观察氧气和二氧化碳传感器窗口的波形变化。
如下图疾病辅助诊断；【正文快照】日前，“利用电子鼻帮助诊断肺癌”的发起人之一、美国克里夫兰临床研究中心肺病专家瑟皮尔·厄祖鲁姆说“呼气时会产生各种各样的挥发性有机化合物，这些化合物是新陈代谢造成的。
癌症患者的新陈代谢会发生变化，呼出气体中的挥发性有机化合物也会随之变化。
利用电子鼻可以探?正文快照】意大利科研人员日前在罗马宣布，他们已成功研制出一种能“嗅”出肺癌独特气味的“电子鼻”。
迪纳塔莱介绍说，这种被称为“电子鼻”的仪器，由一个连接计算机的12厘米长的立方体和众多人体气味感应器组成。
当患者向连接“电子鼻”的一个?作者】；【正文快照】本报讯英国科学家目前在研制一种“生物电子鼻”，可以用来测量不同激素的水平，诊断疾病。
$$英国南安普敦大学的科学家发现，生物中有不同的分子组合可导致不同的电负荷，科学家利用这一点开发出可以感应这些电负荷变化的“感官”，从而判断出不同的分子组合类型。
$$?呼出气体可检病兆：1、肝昏迷有肝臭味；爆发性肝炎或肝功能损伤，由于甲基硫醇和二甲基二硫化物不能被肝代谢而发出的味道；2、酮症酸中毒有烂苹果味；3、消化道出血有血腥味；4、有机磷农药中毒呼吸有大蒜味；5、尿毒症有尿骚味；6、酪氨酸转化酶缺乏导致酪氨酸代谢障碍而潴留于血中，会发出烂白菜的味道；7、先天性隐形遗传病，人体缺乏三甲胺氧化酶，致使三甲胺在体内不能代谢，而发出鱼腥味；8、膀胱结肠瘘病人身体会有大粪味；9、染色体隐性遗传病（枫糖尿病）发出枫糖味即焦糖味；（智力低下）10、氨基酸代谢障碍病即高甘氨酸血症（智力低下、骨质疏松、白细胞和血小板减少，发出猫尿味；（一般说来，在一般膳食情况下，24小时排出的溶质为47～65克，其中一半为尿素。
细胞培养
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件： 37 ℃ 5％CO2
作用：维持培养液的 PH值 7.2~7.4范围
NaHCO3+H2O Na+ + OH - + H2O + CO2↑
CO2培养箱使用时注意的问题
用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。
为了保持箱内湿度,需放置3000毫升蒸 馏 水于槽中, 以避免培养液蒸发。
组织培养：从生物体内取出活的组织块，大小在（O.5 ～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）在体外进行培 养的方法。
器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器官 (一般指胚胎器官)在体外进行培养的方法。
细胞培养的基本概念
原代培养 primary culture : 指从供体取得组织，分
离所得到的细胞接种于培养瓶,进行首次 培养称为原代培养（初代培养）。
原
代
取 鼠
细
胚胞
组 织
培
养
机 械 解 离 细 胞 法
消 化 培 养 法
制成细胞悬液
培养细胞贴壁过程
血清中有促使细胞贴壁的纤维连接素LETS、胶 原、糖蛋白（生长基质）等，这些带正电荷的糖 蛋白是促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞的 表面蛋白参与贴附过程。
每代贴附生长细胞的生长过程
游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期）
系(永生细胞系)。
正常细胞、永生细胞和肿瘤细胞的性状区别
正常细胞
永生细胞
肿瘤细胞
接触抑制
有
有
无
永生性
无
有
有
克隆形成率
无
弱
强
核型改变
无
常有
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
细胞培养方法
细胞培养方法
细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以提供大量的细胞用于实验研究。
正确的细胞培养方法对于细胞的生长、增殖和实验结果的准确性都至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法及注意事项。
首先，准备培养基。
培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长因子的混合物。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据不同细胞类型的要求选择适当的培养基。
在制备培养基时，需要注意无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
其次，处理细胞。
从细胞库中取出细胞后，需要进行细胞的处理和传代。
处理细胞时，要注意细胞的密度和活性，避免细胞凝集和死亡。
传代时，要根据细胞的生长状态和密度进行适当的稀释，以保证细胞的健康生长。
接着，进行细胞的接种和培养。
将处理好的细胞按照一定的比例接种到预先涂有培养基的培养皿中，然后将培养皿放入培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，避免细胞过度生长或死亡。
最后，进行实验。
当细胞达到所需的数量和状态后，就可以进行相关的实验。
在实验过程中，需要注意培养皿的无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
同时，要注意细胞的处理和操作方法，避免对细胞造成损伤。
总之，正确的细胞培养方法对于细胞的生长和实验结果至关重要。
只有严格遵守操作规程，做好无菌操作，才能得到可靠的实验结果。
希望本文介绍的细胞培养方法能够对大家有所帮助。
细胞培养中常见的问题
细胞培养中常见的问题2006-11-23 15:53细胞中的颗粒到底是怎么回事？我的细胞总有颗粒，开始是细胞中有，后来细胞之间也好像有许多颗粒。
好像是细胞碎片一样。
是什么东西啊？是支原体污染吗？这可是我刚买回来的细胞啊!我们实验室也有这种情况，是不是黑的小碎片，有人说是细胞代谢产物，后来拿到高倍镜下看还会动，就怀疑是污染了，也想问问大家到底是什么是黑色的小碎片。
我没注意到它会动，只是觉得不像是活的微生物。
我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差，裂解出的东西。
但是，是什么东西不清楚。
的确很常见在以前帖子见到说是“黑焦虫”。
长时间培养的很容易出现，我根据自己的经验估计是一种污染，因为随着黑点增多，本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。
而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现，我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。
不过增加换液次数的情况下，好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。
以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题，可以有条件换进口血清试试，或者离心一下也可能能解决问题。
那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊？有谁知道？我培养的细胞也出现过此中问题，放到高倍镜下看时有东西在动，但培养液不混浊，估计不是细菌污染，可能是血清问题，是支原体污染。
我培养的细胞也出现过这样的问题，我个人认为是一种支原体污染。
国产血清是罪魁祸首，因为只要将细胞饥饿一下，不超过24小时，这种东西就会疯长我培养的细胞也有出现这中情况。
但是并不影响细胞生长。
应该不是支原体污染最近，我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西，尽管我用的是GIBCO的FBS，后来，每天换液之前洗几遍后，就慢慢变少，现在没了细胞培养的细菌污染我们新建的细胞室。
每周都会做清洁，用0。
2%新洁尔灭消毒，照紫外。
实验前也会照至少30分钟。
培养基中加青霉素，链霉素。
可是培养细胞时还是常有细菌污染，有时甚至分析不出原因。
用培养瓶还好一点，用多孔板或平皿就更凄惨。
细胞培养
实验人员的无菌准备
每次进入细胞间，做细胞实验前的准备： 1.用肥皂洗手。 2.换好拖鞋、穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩 、 手套（用无粉一次性橡胶手套）。 3.用75%酒精棉球擦拭双手。 注意：在做细胞实验时，禁止玩手机、聊天等。
火焰灭菌
在超净台内操作时，首先要点燃酒精灯，原因是酒 精灯火焰的温度能够使气流形成负压，在酒精灯周 围10cm处形成一个无菌区，操作在此范围内进行。 以后一切操作，如打开或封闭瓶口等时，都需在火 焰近处并经过烧灼后进行（简称过火）。 过火的操作要领：将瓶口迅速在酒精灯外焰处重复 旋转2-3次即可，过火时间不要太长，避免将实验 用品烧软或烧焦。
K562细胞 人慢性红白血病细胞株
细胞传代
定义---原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一 定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营 养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培 养，即传代或称为传代培养。
细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到 新的培养器皿中。
细胞传代的方法
贴壁细胞传代步骤
常用的细胞培养用液
水 平衡盐溶液 培养基 血清 （胎牛血清） 双抗（青霉素和链霉素的混合液） 消化液（常用的是胰蛋白酶）
合成培养基
合成培养基
根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人 工方法模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、 碳水化合物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、 M199、MEM等 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使 细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培 养基（如血清）。
细胞培养基本技术
cell culture
细胞是生命活动的基本单位
2006年度省级精品课程教秘高200653 号2007年度省级精品课程
柯道平 省级一般
2004 年度省级精品课程（教秘高〔2004〕70 号）
课程名称 药理学 流行病学 皮肤性病学 妇幼保健学 病原生物学
课程负责人 陈志武 叶冬青 张学军 陶芳标 沈继龙
2005 年度省级精品课程（教秘高〔2005〕66 号）
课程名称 临床药理学 卫生管理学
课程负责人 李俊 胡志
1.3 校级项目列表
朱梅福
医学院校马克思主义基本原理教学内容及体系的建设与改革
王兆良
人文 论据式法律教育研究与实践
杨芳
学院 医学院校硕士研究生自然辩证法课程内容体系调整研究与多媒体教学软件制作 樊嘉禄
医学院校暑期实践教育模式创新研究
程孝文
医学生实践教学立体管理研究
陈宏凯
学教互评系统的设计和软件实现
张蔚
网上选修课程系统的研发与应用 职能
JXYJ2008049 JXYJ2008050 JXYJ2008051 JXYJ2008052 JXYJ2008053 JXYJ2008054 JXYJ2008055 JXYJ2008056 JXYJ2008057 JXYJ2008058 JXYJ2008059 JXYJ2008060 JXYJ2008061 JXYJ2008062
JXYJ2008013
组织胚胎学网络辅助教学的构建及应用
JXYJ2008014
以临床病例为中心的教学模式在基础药理教学中应用研究
JXYJ2008015
我省普通医学高等学校学风建设的思考与实践
JXYJ2008016
妇幼保健医学开放式实验教学体系的构建与实践
JXYJ2008017
毕业生追踪调查优化妇幼卫生专业教育的实践探索
础 《药理学》双语教学的构建与多媒体运用
细胞培养技术3篇
细胞培养技术第一篇：细胞培养技术的基本概念细胞培养技术是指在体外人工培养生物细胞的一种技术，该技术主要应用于生命科学、医学研究、生物制药等领域。
细胞培养技术的基本概念主要包括：细胞培养的类型、培养基、细胞的消耗物质、细胞培养的设备和细胞培养的步骤等，下面就逐一进行介绍。
一、细胞培养的类型细胞培养主要分为原代细胞培养和继代细胞培养两种类型。
1.原代细胞培养原代细胞培养是指直接从体组织中分离出来的生物细胞进行培养。
该类型的细胞培养在实验室中很少用到，因为从体组织中分离细胞的方法很繁琐，而且这种方法得到的细胞数量和品质不能保证。
2.继代细胞培养继代细胞培养是指从已经培养的细胞中分离出来的细胞进行培养。
这种类型的细胞培养方法非常常见，因为可以在实验室中轻松实现。
二、培养基培养基是指用来提供细胞分裂和生长所需营养物质的一种物质。
培养基通常由肝素、胰岛素和细胞因子等多种不同的化合物构成，以满足不同类型的细胞对营养物质的需求。
三、细胞的消耗物质细胞培养期间需要提供物种很多，其中主要包括以下几种：1.抗生素：用来防止在培养细胞中出现感染。
2.气体：氧气和二氧化碳是保证细胞正常生长的重要物质。
3.酸碱指示剂：用来检测培养基的酸碱度，以保证细胞处于适宜的pH值下。
四、细胞培养设备1.培养箱：用于控制培养环境中的温度、湿度和氧气等因素。
2.显微镜：用来观察细胞的形态和生长情况。
若无显微镜，还需要检测仪器，用来检测培养细胞的生长情况。
3.细胞培养板：用来培养细胞和收集细胞。
五、细胞培养的步骤细胞培养的步骤一般可以分为以下几个：1.细胞分离：从样品中分离出单个的细胞。
2.细胞传代：选取健康的细胞将其转移至新的培养基中，继续增殖，以获得更多的细胞。
3.细胞计数：测量细胞数量以确定下一步操作所需的细胞量。
4.细胞培养：将细胞加入新的培养基中，进行培养。
根据细胞培养的不同类型，上述步骤会稍有不同。
总之，细胞培养技术对于生命科学、医学研究、生物制药等领域都具有重要的应用价值，它通过人工培养细胞，为科学家们提供了一种研究生物学的新途径。
细胞培养概述
注意事项
• 1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫 及无菌操作台(laminarflow) 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以 外灯照射30-60分钟灭菌， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 照射30 分钟灭菌 面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操 并开启无菌操作台风扇运转10分钟后， 10分钟后 作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不 每次操作只处理一株细胞株， 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后 ，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 将实验物品带出工作台， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后， 10分钟以上后 下一个细胞株之操作。 下一个细胞株之操作。
• 2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞， 必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸 管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完 即应移出，以利于气流之流通。实验用品 以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内 。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿 在边缘之非无菌区域操作。
• 3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污 小心取用无菌之实验物品， 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦 不要在打开之容器正上方操作实验。容器 不要在打开之容器正上方操作实验。 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜 45°角取用， 约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放 置桌面。 置桌面。
(5)水
细胞培养技术概述
细胞培养技术概述一、概念⏹细胞培养技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。
⏹细胞系原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。
也指可长期连续传代的培养细胞。
类型：有限细胞系（Finite Cell Line）、连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）、肿瘤细胞系或株。
⏹原代培养定义：直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。
优点：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。
⏹传代原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。
二、目的与用途⏹1、科学研究药物研究与开发新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。
疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。
细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。
单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。
基础研究：药物作用机理、基因功能疾病、发生机理⏹2、生物制药疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等诊断用和药用单克隆抗体生产细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等三、细胞培养技术的主要优点研究的对象是活的细胞研究的条件可以人为的控制研究的样本，可以达到比较均一性研究的内容便于观察、检测和记录研究的范围比较广泛研究的费用相对较经济。
四、细胞培养技术的主要缺点⏹人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同：当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化.⏹与体内主要不同：相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响⏹主要表现：失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显,细胞趋向单一化；⏹提示：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
第1章细胞培养的基本知识-10页word资料
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养概述
对象广：
各种动物：低等动物--高等动物--人类 一种动物：不同年龄-不同组织-正常或异常（肿瘤--）
优点
4.较经济：
可提供大量、同时、重复性好的、
生物学性状相似的实验对象
细胞培养的缺点
现人工模拟体内环境的技术已经很高,
但, 人工所模拟的条件与体内实际情况
仍不完全相同.
当细胞被置于体外培养后,
细胞培养
概述
体外培养
Tissue culture in vitro
从动物活体体内取出组织，
于模拟体内生理环境等特定的条件下，
进行孵育培养，使之生存并增殖
细胞培养
把取得组织用机械或消化方法分散成单亇细胞 悬液，然后进行培养、增殖。
组织[块]培养
把活体的小片组织置于底物上孵育， 细胞自其周围移出并增殖
很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
成纤维样
转化后
可成上皮样
注意细胞鉴定
悬浮生长型
概念
培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长
或以机械方法使保持悬浮状态下生长
来源
自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞
癌肿细胞也可能
特点
在悬浮中生长良好
细胞圆形，单个或小细胞团
优点
生存空间大，提供数量大
传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点
观察不方便
性质：正常？肿瘤？-阶段：
可控制-调节条件：各种因素
物理、化学、生物等因素
优点
2.
可控制：
可控制-利用方法：
采用各种研究技术、记录方法：
研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、
电子显微镜、流式细胞术、激光共焦 显微镜、免疫组织化学、原位杂交、 同位素标记-记录：摄影照片、缩时电影、电视--
细胞培养技术简介09.5.22
为何要进行细胞培养
细胞培养是很多实验的基础。 在细胞生物学研究中，细胞是研究的对象； 在分子生物学的功能研究中，细胞是研究分子功 能的载体。 细胞培养技术非常基础，是实验操作的基本功之 一，所以很重要。
怎样进行细胞培养
1 准备工作 包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配 准备工作: 包括器皿的清洗、干燥与消毒， 分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒， 制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他 仪器的检查与调试。 仪器的检查与调试。 2 取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞，经过一定的处理 取材: 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞， 如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中， （如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为 取材。 取材。 3 培养 将组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。细胞培 培养: 将组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。 养应先进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示） 养应先进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示） 接入含培养基的培养器皿。 接入含培养基的培养器皿。
Subculturing: Protocol: Cultures can be maintained by the addition of fresh medium or replacement of medium. Alternatively, cultures can be established by centrifugation with subsequent resuspension at 2-4 X 10(4) viable cells/ml. Subcultutre when cell concentration reaches 8X105) cells/ml.Do not allow the cell concentration to exceed 1 X 10(6) cells/ml. Medium Renewal: Every 2 to 3 days
某工业大学生物工程学院《细胞生物学》考试试卷(58)
某工业大学生物工程学院《细胞生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（50分，每题5分）1. 胆固醇使得脂质在双层中堆积更紧密，但它并没有降低膜的流动性。
（）[复旦大学2019研]答案：正确解析：胆固醇使得凝结脂质在双层中堆积更为紧密，但它并没有降低膜脂的资金流动性，在大部分动物细胞膜中高浓度的胆固醇还可以碳氢链聚合以及结晶态的形成。
2. 溶酶体只消化由细胞胞吞作用吞入细胞的物质。
（）答案：错误解析：溶酶体也可清除体内无用的生物大分子、衰老的胞器及损伤衰老损伤和死亡的细胞。
3. 叶绿体的核酮糖二磷酸羧化酶是由16个亚基组成的聚合体，其中8个大亚基是核基因编码的。
（）答案：错误解析：叶绿体的核酮糖二磷酸羧化酶的8个小亚基由核性状编码。
4. 人的每条染色体上都有一个核仁组织区，参与形成核仁。
（）答案：错误解析：不是每条染色体都有核糖体组织区，人只有5条染色体上具有核仁组织区。
核仁组织区位于染色体的次缢痕部位，是核糖体RNA基因所在的部位，可组织形成核仁。
5. 肽如何正确折叠，以及是否进一步加工或组装成寡聚体的信号都存在于蛋白质的一级结构中，或者说这些信息仅存在于编码该蛋白质的基因本身。
（）[武汉大学2009研]答案：正确解析：蛋白质一级结构决定了其四级结构。
6. 在内质网，脂质合成的部位和催化糖基化的部位都位于内质网腔面的一侧。
（）答案：错误解析：脂质合成发生在细胞质脂质化学合成侧，糖基化修饰发生在内质网前面一侧。
7. 经流式细胞仪分离出的细胞可继续培养。
（）[上海交通大学2007研]答案：正确解析：催化活性只要染色过程不影响细胞活性，那么分离出来的细胞还可以继续培养。
8. 细胞外信号都是通过细胞表面受体来进行跨膜信号传递的。
（）[南开大学2007研]答案：错误解析：有的脂溶性的信号分子可以跨膜进入细胞与胞内受体结合。
细胞培养技术
细胞培养技术一、细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境, 在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下, 使期生长繁殖, 并维持其结构和功能的一种培养技术。
细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。
外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可反复取材等优点, 它在临床染色体分析中使用最广泛。
体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化, 成为永久细胞系, 也可直接建成永久细胞系, 永久细胞系能在体外无取制的传代和生长。
永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特性。
但细胞克隆的细胞系其这一特性可以不明显。
二、细胞培养的环境细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。
1.无污染环境培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。
当细胞放置于体外培养时, 与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力, 一旦被污染或自身代谢物质积累等, 可导致细胞死亡。
因此在进行培养中, 保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等, 是维持细胞生存的基本条件。
2.恒定的温度维持培养细胞旺盛生长, 必须有恒定适宜的温度。
人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃, 偏离这一温度范围, 细胞的正常代谢会受到影响, 甚至死亡。
培养细胞对低温的耐受力较对高温强, 温度上升不超过39℃时, 细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时, 即能受到一定损伤, 但仍有也许恢复；在40-41℃1小时, 细胞会普遍受到损伤, 仅小半数有也许恢复；41-42℃1小时, 细胞受到严重损伤, 大部分细胞死亡, 个别细胞仍有恢复也许；当温度在43℃以上1小时, 细胞所有死亡。
3.气体环境气体是人体细胞培养生存必需条件之一, 所需气体重要有氧气和二氧化碳。
氧气参与三羧酸循环, 产生供应细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。
细胞培养讲义
细胞培养一．概述生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（in vivo）的功能活动是非常困难的。
实际工作中，人们常常从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，称为体外培养，体外(in vitro)培养是在体外进行的生物过程的实验，与体内(in vivo)相对，也称为组织培养。
通过组织培养可以方便地在体外观察研究细胞的生长发育、细胞形态和功能。
根据体外培养物种类不同，严格意义上，体外培养可分为组织培养（从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法）、器官培养（生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法）、细胞培养（将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法）。
1.组织培养(tissue culture) 指组织在体外条件下维持生长，组织仍可分化并维持其结构和／或功能。
2.器官培养(organ culture) 器官为原基、整个器官或器官的一部分，在体外条件下维持生长或分化并保持结构和／或功能。
3.细胞培养(cell culture) 是将机体内的组织取出分散(机械或酶消化)成为单个细胞，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制及细胞衰老过程等生命现象。
在细胞培养中，细胞不再形成组织。
需要说明的是，进行组织培养时，不论采用什么方法和条件，被培养组织的主要成分仍然是细胞；细胞在生长过程中总有移动和其他变化，这将使得培养的组织难以长期维持其特有的结构和功能。
培养时间越长，发生变动的可能性就越大。
结果常使单一类型的细胞保存下来，最终也成了细胞培养。
另外，所谓细胞并不意味着细胞彼此是独立的，细胞之间仍然相互依存，呈现一定组织的特性。
所以，组织培养和细胞培养无严格区别，两者在一定程度上可看作是同义语。
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Ⅳ
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II级A型生物安全柜
一种既能使操作造成无菌、无 尘的局部空气环境，保证检验、检 测不受污染，又能保证被研究的对 象（如病菌、细菌等）不外溢，保 护周围环境及操作人员的安全隔离 设备。 该设备可广泛应用于低、中等 危险度（病原体1--3，DNA重组P1-P3）的临床细菌学，病毒学、微生 物学、组织培养、生物学及生命科 学的研究，加工、检验部门。
细胞培养用液的配制
水：新鲜配臵的三蒸水或去离子水
平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或
盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖 配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。 配液时注意：（1）用水；配制先后顺序；称量，要看清药品的规 格、纯度、结晶水的数量等。（2）物质的纯度，常用的纯度有优 级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种。（3）物质的 可溶性，避免沉淀析出。（4）物质的稳定性，如葡萄糖只能在10 磅下维持15～20分钟。（5）贮存液 通常先配制成10倍或100倍的 一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。 常用的缓冲液：生理盐水、PB、PBS(注意有无钙镁离子)、 Hanks液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红）
清洁液的配制
组成 强度 弱 液 重铬酸钾 （克） 100 120 63 浓硫酸 （ml） 100 200 1000 蒸馏水 （ml） 1000 1000 200
次强酸
强 液
一、玻璃器材（各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管 等） 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、清洁液处理（24小时）、流水冲洗、 蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干包装杀菌。一般用121℃磅高压蒸气灭菌 20分钟。
HEPA 过滤的空气
負压的污染空气
紫外灯
紫外线消毒。 主要用于培养室空气、
操作台、塑料培养皿和
培养板等表面消毒
电热干燥箱
干热消毒（160℃ ，2小时）,主要用于玻璃器皿消毒
滤 器
Zeiss滤器(过滤除菌)：
大多数培养用液，如人工 合成培养基、血清、酶液
等均采用滤过法除菌。
湿热灭菌装置
大容量高压灭菌器 全自动手提式灭菌器
传递窗
该装置是一种洁净室的 辅助设备，主要用于洁净区 与洁净区，洁净区与非洁净 区之间小件物品的传递，以 减少洁净室的开门次数，把 对洁净区的污染降低到最低 程度。
高效过滤器
高效过滤器是用超细玻璃纤维纸作 滤料，胶板纸作分隔板，可与铝合金 框、木框及镀锌钢板框组合而成。 特点：具有低阻高效、轻质、容尘
量大等特点，层高的要求，缩小净化 设备静压箱体积等优点。 适用于常温常压常湿条件下环境空 气的净化，尤其适用于需要高效空气 过滤器覆盖率高的净化厂房。
技术性能参数：
洁净层流罩
(1)净化等级：100级(美国联邦标准209E)
(2)平均风速：0.25～0.45m/s(可调) (3)噪音：≤62dB(A)
细胞培养总论
刘 梅 南通大学神经再生重点实验室与神经科学系
liumei@
一、细胞培养的基本条件
无菌/灭菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯， 电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器， 高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全： 生物实验室安全，P1, P2, P3 实验室安全
pH调节液
(1) 碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用 双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，
密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%浓度的安瓿封装品，使用也很方
便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或 以CO2调节。
(2) Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的
尘粒最大允许数
浮游菌/立方 5 100 500 NA 沉降菌/皿 1 3 10 15
细胞培养室
风淋室
风淋室是生物洁净室的理想配 套设备，它不仅可以清除人体和物 品表面附着的尘埃，减少带入洁净 室的灰尘量，而且兼有气闸室的功 能，可防止非洁净空气的侵入。风 淋室的板壁采用轻质隔热夹芯钢板， 吹淋板采用进口不锈钢制作，吹淋 口方向可调，风淋时间可在30-99 秒间的调整。风淋室可以配合加热 器，冬天可以加热，温度可调，一 般控制温度在30-35℃较为适宜。
层流罩是可提供局部高洁净 环境的空气净化设备。它主要 由箱体、风机。初效空气过滤 器、高效空气过滤器、阻尼层、 灯具等组成，外壳为不锈钢或 彩钢板。 洁净层流罩是将空气经风 机以一定的风压通过高效空气 过滤器后，由阻尼层均压，使 洁净空气呈垂直层流型气流送 入工作区，从而保证了工作区 内达到工艺所需的高洁净度。
二、塑料器材（多孔培养板、培养皿、培养瓶及吸嘴 等） 塑料器皿若反复使用：使用后，先用自来水浸泡冲洗、晾干，再用 3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，双蒸水冲洗， 晾干。采用紫外线直接照射或辐照灭菌办法。清洗时要防止产生划痕。
三、橡皮器材
选择质软、耐高温、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品) 。新购臵的自来 水冲洗去，5%氢氧化钠煮沸15分钟，自来水冲洗，4%盐酸煮沸15分钟， 自来水冲洗，单蒸水冲洗，双蒸水(或去离子水)冲洗，晾干后包装或臵 于铝盒内，用121℃高压蒸气灭菌20分钟。
细胞培养用水装置
自动双重纯水蒸馏器 纯水仪
培养板与培养瓶
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃，100%湿度，5％CO2 。
使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
① 用螺旋口瓶培养细胞时， 需将瓶盖微松，以保证通气。 ② 保持培养箱内空气干净。 定期消毒（90 ℃，14 h)。
③ 箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水 以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。
4.出入制度
层流净化细胞培养室共有两个缓冲间，进入每个缓冲间必须更换指定 消毒的拖鞋； 穿戴好消毒的鞋、帽、口罩后不得逆行离开层流净化室； 人员流动：原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的 门关闭后才允许打开下一个门，出入线路绝对不能逆行，使缓冲间起到 应有的作用。 物品流动：所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行； 物品进入层流净化细胞培养室时，应先打开传递窗外侧门，将物品放入 传递窗，关闭传递窗外侧门，打开紫外灯照射15分钟；人员进入层流净 化细胞培养室后，关闭紫外灯，打开传递窗内侧门，取出物品；物品出 室次序与以上进室次序相反，但不需紫外线照射。
净化工作室
------ 我国药品生产洁净室（区）空气洁净度标准 -------
洁净度 级别 100 10,000 100,000 300,000
尘粒最大允许数/立方米
≥0.5um 3,500 350,000 3,500,000 10,500,000 ≥5um 0 2,000 20,000 60,000
3.卫生消毒制度
一般情况下细胞间每日消毒一次（包括缓冲间），方法为紫 外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10％乳酸
在紧闭门窗下熏蒸30分钟； 实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁； 及时清洗所用隔离衣，并高压灭菌后存放于指定位臵； 除实验必须的用品外，其它物品不得带入净化室； 层流净化室内所用仪器及附属设备均应在指定范围内使用， 不得随意转移地点，以便他人顺利使用； 层流净化室实施值日生负责制，值班人员负责检查室内是否 保持清洁整齐，督促违反规定者改正错误。
超净工作台
超净工作台的工作原理 是利用鼓风机驱动空气遁过 高效滤器除去空气中的尘埃 颗粒，使空气得到净化。净
化空气徐徐通过工作台面，
使工作台内构成无菌环境。
生物安全柜的选择
适用性能 适用范围 净 I A1 IIA A2 IIB B1 B2 III
保 护 对 象
实 验 室
人
环 样
+
+
+ -
+
+ +
培养基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液， 分天然培养基和合成培养基。
A2型生物安全柜
100 fpm 吸风量 70%气体循环使用 . 30%气体排出，既可以接管 道外排，也可以不接管道直 接排放在实验室
环境空气
污染的空气
HEPA 过滤的空气 负压的污染空气
B2 型生物安全柜
“全排”
100 fpm吸气量
0% 气体循环利用. 100% 气体外排，适用于P3实验室 环境空气 污染的空气
氢离子缓冲剂。通常使用浓度为10～15mmol/L。配制时，称取所需的 Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分 装小瓶中，4℃冰箱保存。
消化液
胰蛋白酶溶液 一种黄白色粉末，易受潮，应密封放臵阴暗干燥处。它 的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱 落并使细胞游离分散开来。常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶。 EDTA(乙烯二胺与乙酸或Versene)溶液 EDTA是一种化学螯合剂，毒性 小，对贴壁细胞有离散作用。一般使用浓度为0.02%。 称0.1g 溶解 于500ml无钙镁离子磷酸缓冲液中，15磅30分钟高压灭菌，4℃或室 温保存。 胰蛋白酶－EDTA溶液 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4ml，无钙 镁离子缓冲液100ml。