转基因玉米59122品系的特异性检测
玉米中转基因成分的筛查检测策略
玉米中转基因成分的筛查检测策略作者：王培珍来源：《农民致富之友》2020年第24期玉米作为禾本科一年生的草本植物，其营养成分丰富，提供大量的碳水化合物。
转基因的玉米具有较强的耐寒性、耐旱性、耐贫瘠性等优良性质，容易种植。
但转基因玉米也存在着一定安全隐患，转基因检验受到广大消费者的重视。
基于此，本文将主要论述玉米中转基因成分的筛查检验策略。
一、玉米中转基因成分的筛查检测的重要性转基因成分检验技术是转基因生物研究和安全管理的基础，检验人员通过技术手段判断目的基因导入到玉米受体细胞中，并检验玉米受体细胞是否成功表达相关性状。
目前已经有65个国家和地区对转基因产品采取强制的标志性管理，2015年10月开始实行的中华人民共和国安全法第69条中明确规定了转基因食品应该明确标注。
转基因检验行业快速发展，因此建立一个迅速准确的基因检验方法，是当前检测技术所面临的关键问题。
截止到2018年中国玉米产量25733万吨，中国的转基因玉米转化事件有16个，转基因玉米种类过多，同时存在变异亚种，检验人员应该综合DNA序列分析，选取合适的基因元件，确定转基因玉米的筛查方法。
二、玉米中转基因成分的筛查检测技术1、PCR检验技术PCR检验技术是一种灵敏度高，目前发展较为成熟的转基因检验方法，根据特异性主要分为筛查基因特异性、翻译产物特异性等。
PCR检验的主要基因包括调控基因、标记基因、及导入到玉米细胞中的目的基因。
其中调控基因主要包括基因中前端和后端的启动子与终止子，标记基因主要包括抗草丁膦基因、抗卡那霉素基因。
PCR技术在玉米转基因成分检验中有很大的应用，但由于转基因玉米中含有多个目的基因，往往需要多重PCR进行检验，其快速提高检验效率，同时保证玉米中转基因成分的特异性。
2、环介导等温扩增检验技术环介导等温扩增检验技术作为一种新兴的DNA扩增方法，这种技术主要利用了特异性的核糖核苷酸引物，综合应用DNA聚合酶，促进DNA在常温下快速增殖，完成核酸的快速扩增。
国家质量监督检验检疫总局关于发布2014年第一批230项出入境检验检疫行业标准的通知
国家质量监督检验检疫总局关于发布2014年第一批230项出入境检验检疫行业标准的通知
文章属性
•【制定机关】国家质量监督检验检疫总局(已撤销)
•【公布日期】2014.01.13
•【文号】国质检认[2014]23号
•【施行日期】2014.08.01
•【效力等级】部门规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】标准化
正文
国家质量监督检验检疫总局关于发布2014年第一批230项出
入境检验检疫行业标准的通知
（国质检认[2014]23号2014年1月13日）各直属检验检疫局，标准法规中心、中国检验检疫科学研究院：：
经审查，现将《出口食品中虫酰肼残留量的测定》等230项出入境检验检疫行业标准予以发布.标准编号、标准名称、代替标准及实施日期见附件。
代替标准自本批标准实施之日起废止。
附件。
用于筛选转基因玉米的高通量多重串联PCR测定法
用于筛选转基因玉米的高通量多重串联PCR测定法摘要转基因生物（GMO）越来越被接受，这导致了对高通量检测方法的需求日益增加。
这项研究描述了一个高通量和低成本的多重串联PCR（MT-PCR）检测方法，此方法使用SYBR Green I进行定量分析，用于筛选包含7个转基因（GM）共有的筛选元素，6个转基因玉米和一个玉米参考基因共14个靶标。
这14个目标的高通量多重串联PCR分析成功地扩增了单一事件样本中转基因玉米DNA含量小于0.001 ng的产物，并显示出高度特异性。
该测定可有效地用于筛选食物和饲料中的GM玉米。
引言近几十年来，许多国家的市场上都有大量的转基因生物。
根据国际农业生物技术应用服务处的统计，到2016年，全世界已经有29种转基因品种被开发和商业化。
值得注意的是，玉米获得了世界范围内最大的认可，有29个国家批准了229个转基因品种。
有几个国家对来自欧盟成员国等转基因植物的食品实行强制性标签，规定含有超过0.9％转基因材料的产品必须按照现行法规加贴标签。
然而，未经授权的转基因生物（UGM）偶尔会被释放到市场中。
为了保护消费者的权益，有必要采用大容量监测方法检测转基因玉米。
GMO检测是基于发现插入的外源基因（含有插入连接序列）或在转基因植物中特异性表达的蛋白质。
基于蛋白质的方法是费力和不太敏感的，通常不适用于可能引起蛋白质变性的加工产物。
相比之下，基于DNA的PCR方法更为广泛的应用。
近年来，已经描述了高通量的基于DNA的GMO检测方法的许多策略。
其中，一次反应可同时扩增多个DNA目标的多重PCR是监测多个GM含量的基本策略。
Shrestha等人已开发出一种多重PCR用于同时检测八个转基因玉米品系，但是由于PCR产物需要进一步的琼脂糖电泳分析以确认结果，所以耗时且限制了产量。
为了提高多重PCR的能力，开发了结合多重PCR 的新策略，如毛细管凝胶电泳（CGE）或微阵列杂交。
但是，这种改进也受到单管多重PCR能力的限制。
转基因农产品检测
转基因农产品检测转基因食品如今已经在世界上多个国家成了环境和健康的中心议题。
转基因农产品具有可以提高农作物产量，改善农产品品质；减少农药使用，避免环境污染等诸多优势。
但是目前国际上关于转基因食品对人体健康、生态环境和动物、微生物安全的影响尚无定论。
中国目前采用最严格的定性标识方法，即食品产品中只要含有转基因成分，就一定要在包装上标明“转基因标识”。
科标生物检测中心拥有国际先进的分子生物检测设备及专业的检测团队，对农产品、食品、饲料等中的转基因(GMO)成分进行分子水平的定性和定量检测。
【检测对象】大豆、玉米、马铃薯、番茄、木瓜、青椒、食用菌、小麦、烟草、水稻及其产品、油菜籽、棉花、植物性饲料、调味品、食用油脂、食品成品及半成品、植物及其加工产品等。
【检测项目】定性测试MDL=0.1%玉米(CaMV 35S, NOS, Bar 或大豆(CaMV 35S, NOS, Cp4-EPSPS)NPTII 或PAT )马铃薯(CaMV 35S, NOS,番茄(CaMV 35S, NOS, NPTII )FMV35S或NPTII)木瓜(CaMV 35S, NOS, NPTII )青椒(CaMV 35S, NOS, NPTII)食用菌(NOS, Bar, NPTII)小麦(NOS, Bar )烟草(CaMV 35S, NOS, NPTII )水稻及其产品(CaMV 35S, NOS, Bt )油菜籽(CaMV 35S, NOS, FMV棉花(CaMV 35S, NOS, NPTII )35S 和NPTII )植物性饲料( CaMV 35S, NOS )。
玉米转基因检测标准
玉米转基因检测标准
1. PCR检测方法，PCR（聚合酶链式反应）是目前最常用的转基因检测方法之一。
检测标准通常会规定PCR反应的条件、引物设计、阳性对照、负性对照等内容，以确保检测的准确性和可靠性。
2. 适用范围，检测标准会明确适用于哪些类型的转基因玉米，比如Bt玉米、抗除草剂玉米等，以及不同的转基因基因型。
3. 检测灵敏度和特异性，标准通常会规定检测方法的灵敏度和特异性要求，确保可以检测到极低水平的转基因成分，并且不会对非转基因玉米产生误检。
4. 样品处理和前处理，标准通常会包括样品的处理方法，比如样品的提取、纯化等，以及前处理步骤，确保样品中的转基因成分可以被有效地检测出来。
5. 质控要求，检测标准通常会包括质控要求，比如实验室的质控体系、质控样品的使用、实验人员的技术要求等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
此外，国际上也有一些相关的组织和机构发布了转基因玉米检测标准，比如国际标准化组织（ISO）和美国食品药品监督管理局（FDA）等。
这些标准通常会受到各国法律法规的影响和认可，对于确保转基因玉米产品的安全性和合规性起着重要作用。
总的来说，玉米转基因检测标准涉及到多个方面，包括检测方法、适用范围、灵敏度和特异性、样品处理和前处理、质控要求等内容，以确保转基因玉米产品的质量和安全。
这些标准的制定和执行对于保障食品安全和消费者权益具有重要意义。
转基因玉米的检测手段分析
※农业科学农业与技术2018, V ol.38, No.2031转基因玉米的检测手段分析赵彦涛（哈尔滨市农产品质量安全检验检测中心，黑龙江哈尔滨 150000）摘 要：近年来转基因生物技术快速发展，对农作物产量及品质的提高等方面起到非常重要的作用。
但是转基因食品的安全性目前还处于模拟两可的状态，尚未有确切的定论，因此有必要加大对转基因食品检测手段方面的分析研究。
文中总结了目前国内外在转基因玉米检测方面应用较多的几种检测手段，并对其未来发展趋势进行了展望。
关键词：转基因玉米；检测手段；展望中图分类号：S513 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20181033022转基因玉米是当前应用最广泛的转基因作物之一。
目前我国转基因玉米种植的面积在转基因作物种植的总面积中占比达到20%以上，虽然目前对转基因玉米是否有害尚无确切的证据，但是在定论之前做好转基因玉米的检测工作是非常有必要的。
目前国内外在转基因玉米检测方面应用的技术手段较多，转基因玉米产品的种类不同、或者检测的目的不同，采取的检测技术也不同，现简单总结几种常用的检测手段。
1基于蛋白质的检测方法转基因作物中外源蛋白的检测可以利用ELISA（酶联免疫吸附法）、Western杂交等方法，具体是将需要检测的转基因作物中的目的蛋白的基质通过一定的步骤抽提出来，再利用抗体、目的蛋白之间可以产生特异性结合的特点，进而通过产生的信号进行检测。
1.1 酶联免疫吸附法此种方法具有以下特点：抗原抗体的免疫反应在固体的表面发生；蛋白质检测的标记物为某种特定的酶。
转基因作物表达的外源蛋白的抗体可以结合待检测样品的外源蛋白，再通过酶标反应、酶促反应等表现出颜色反应，进而做出判断。
此种检测方法可以定量，优点是需要较少的样品即可，操作标准，可对大批样品进行检测，缺点是其他因素容易影响检测的结果，造成假阳性。
1.2 Western杂交法此种杂交方法是将抗体与抗原在硝酸纤维素膜上实现特异性结合，从而对外源基因进行检测的目的。
多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增
多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增多抗草甘膦转基因玉米是一种经过基因编辑技术改良的农作物，具有抗草甘膦的能力。
为了区分不同种类的多抗草甘膦转基因玉米，科学家们利用筛查点扩增技术进行区分和鉴定。
本文将详细介绍多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增的原理、步骤和应用。
多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增的原理是基于PCR（聚合酶链式反应）技术。
PCR技术是一种通过在体外模拟DNA复制过程扩增特定DNA片段的方法。
筛查点扩增技术利用PCR技术扩增与多抗草甘膦转基因玉米相关的特定DNA片段，通过检测扩增产物的大小和特异性来鉴定不同种类的多抗草甘膦转基因玉米。
多抗草甘膦转基因玉米的筛查点通常选取转基因序列与非转基因序列之间存在差异的区域作为扩增靶点。
在筛查点扩增过程中，需要设计特异性引物对该区域进行扩增，并选择合适的PCR条件进行反应。
扩增产物经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，根据扩增产物的大小和明显性差异，可以判断样品是否为多抗草甘膦转基因玉米，以及不同种类的转基因玉米之间的差异。
筛查点扩增技术在多抗草甘膦转基因玉米检测中起到重要的作用。
首先，它能够快速鉴定多抗草甘膦转基因玉米的存在与否，避免非转基因玉米被误判为转基因玉米。
其次，筛查点扩增技术可在短时间内同时检测多个样品，并准确判断不同种类的多抗草甘膦转基因玉米。
这对于种植、销售和监管转基因玉米具有重要的意义。
在多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增的应用中，科学家们通常采用了多种分子生物学技术来验证扩增产物的特异性和准确性。
例如，通过DNA测序技术验证扩增产物的序列，并与已知的多抗草甘膦转基因玉米序列进行比对，确保鉴定结果的可靠性。
此外，还可以利用草甘膦抗性检测试纸进行快速初步筛查，将阳性样品再进行筛查点扩增确认。
尽管多抗草甘膦转基因玉米不同种类筛查点扩增技术已在实际应用中取得了较好的效果，但仍然存在一些潜在的技术挑战和限制。
首先，扩增产物的大小差异可能较小，需要选取合适的引物和PCR条件来保证特异性。
转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片测试方法的研制
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(8): 1432−1438/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由山东省农业科学院创新基金(200711)和山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(2007BS06023)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 孙红炜, E-mail: hongweisun@Received(收稿日期): 2008-12-08; Accepted(接受日期): 2009-03-20.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01432转基因玉米转化体特异性寡核苷酸芯片检测方法的研制路兴波1 武海斌1,2 王 敏2 李宝笃2 杨崇良1 孙红炜1,*1山东省农业科学院植物保护研究所, 山东济南 250100; 2青岛农业大学植物保护学院, 山东青岛 266109摘 要: 根据7种转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mo n 863、TC1507、GA21和NK603的重组DNA 结构, 利用Primer premier 5.0引物设计软件分别设计转化体特异性引物, 优化PCR 反应条件, 对引物特异性及灵敏度进行验证。
结果表明, 所设计引物特异性强, 灵敏度达0.1%。
在植物基因组与外源基因的连接区域, 利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0软件分别设计和筛选7种转基因玉米40mer Oligo 转化体特异性探针, 制备转基因玉米的寡核苷酸芯片, 并对芯片检测的特异性、重复性及检测灵敏度进行检验。
证明所设计探针特异性强, 灵敏度达0.01%。
与PCR 检测方法相比, 基因芯片检测法灵敏度高、特异性强, 可有效检测及鉴定多种转基因玉米, 大大提高检测的准确率和效率。
关键词: 转基因玉米; 转化体特异性; 寡核苷酸芯片; Oligo 探针; 灵敏度Developing a Method of Oligonucleotide Microarray for Event Specific Detec-tion of Transgenic Maize (Zea mays )LU Xing-Bo 1, WU Hai-Bin 1,2, WANG Min 2, LI Bao-Du 2, YANG Chong-Liang 1, and SUN Hong-Wei 1,*1Plant Protection Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China; 2 College of Plant Protection, QingdaoAgricultural University, Qingdao 266109, ChinaAbstract: With the spread of genetically modified organism (GMO), the food and environment securities related to GMO has attracted great attention to the public. Genetically modified maize (Zea mays L.) is one of the most popular GMO varieties, which accounts for 22.5% of total planting area of transgenic crops. Currently, more than 40 countries and regions govern GMO food products with a compulsory tagging policy. Thus, techniques for testing transgenic plants is of great importance, such as screening, gene specific, construct specific, event specific detection method, which have become a mainstay of GMOs detection. Event spe-cific microarray shows a prosperous application due to its advantages of high specificity, high sensitivity, automation, and high efficiency. In this study, on the base of integrated DNA constructs of seven genetically modified maize varieties, Bt11, Bt176, Mon810, Mon863, TC1507, GA21, and NK603, event specific primers were designed for polymerase chain reaction (PCR) using Primer Premier 5.0, and the PCR system and program were optimized. The results indicated that the sensitivity of PCR detection was 0.1%. In addition, based on unique and specific integration junction sequences between the host plant genome DNA and the in-tegrated gene, a 40mer event specific Oligo probe with high specificity was designed for each variety using Primer Premier 5.0 and Oligo 6.0. All the event specific probes were developed in one microarray. To ensure the reliability of microarray detection, we used different kinds of positive and negative controls in oligonucleotide microarray. The results indicate that the sensitivity of microar-ray detection (0.01%) and the event specific oligonucleotide probes meet the requirements of sensitivity and specificity for de-tecting and identifying genetically modified maize so as to enhance the testing accuracy and efficiency. Keywords: Transgenic maize; Event specific; Oligonucletide microarray; Oligo probe; Sensitivity随着转基因技术的日渐成熟, 转基因作物产业化已呈现出较好的发展势头。
玉米成分转基因检测知识
玉米成分转基因检测知识转基因玉米就是利用现代分子生物技术，把种属关系十分遥远且有用植物的基因导入需要改良的玉米遗传物质中，并使其后代体现出人们所追求的具有稳定遗传性状的玉米。
转基因食品有很多优点：增加作物产量、降低生产成本；增强作物抗虫害、抗病毒等的能力；提高农产品耐贮性。
但转基因食品作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定：可能通过基因漂流影响其他物种；转基因食品可能会引起过敏等等。
比如说水果玉米，就是那种吃起来带甜味的。
颗粒大小差不多，金黄色栗粒的，一般路边烧烤的那种玉米。
彩色玉米，就是栗粒有紫色白色黄色的哪种，这是最原始的转基因玉米了。
下列是对于其它相关转基因成分物质：◆大豆◆马铃薯◆木瓜◆青椒◆食用菌◆小麦◆烟草◆油菜籽◆棉花◆植物性饲料◆调味品◆食用油脂◆食品半成品、食品成品◆水稻及其产品◆植物及其加工产品下面我们来看一下实时荧光PCR反应体系：试剂名称终浓度ЧL/反应10×PCR反应缓冲液1× 5MgCl2（25m mol/L） 2.5 m mol/L 5dATP(10 m mol/L) 200 n mol/L 1dGTP(10 m mol/L) 200 n mol/L 1dCTP（10 m mol/L）200 n mol/L 1dTTP(10 m mol/L) 100 n mol/L 0.5dUTP(10 m mol/L) 200 n mol/L 1UNG酶（1 U/чL）0.5U 0.5上游引物（10чmol/L）200 n mol/L 1下游引物（10чmol/L）200 n mol/L 1探针（5 чmol/L）100 n mol/L 1Taq酶（5U/чL） 2.5U 0.5DNA模板（40 ng/чL~50ng/чL）- 5补水至- 50注：表中DNA模板为原料的模板量，加工产品可视加工程度适当增加模板量；也可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。
用复合PCR方法对6种转基因玉米中的外源DNA进行特异性检测
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2005,13(5):562~567*基金项目：国家高技术研究与发展计划(863)项目（No.2004AA212222）和“十五”科技攻关计划项目（No.2004BA713B09-01）资助。
金芜军:男，1972年生，博士。
E-mail:<jinwujun1218@>. **通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<jiasr@>. 收稿日期：2005-05-11接受日期：2005-06-08·研究论文· 用复合PCR 方法检测6种转基因玉米中外源DNA 的特异性*金芜军1郝旸1程红梅1路兴波2彭于发3贾士荣1**(1.中国农业科学院生物技术研究所，北京100081；2.山东省农业科学院植物保护研究所，济南250100；3.中国农业科学院植物保护研究所，北京100094)摘要：利用本实验室研制的植物DNA 提取试剂盒，从玉米()种子中提取符合PCR 检测要求的DNA 。
根据不同转基因玉米中重组DNA 的结构，分别设计引物，可对Bt11、Event176、T25、MON810、GA21和NK603等6种转基因玉米进行特异性PCR 检测。
在此基础上建立了针对6种转基因玉米的特异性DNA 片段和玉米内参照基因()的复合PCR 检测方法，能同时对7对引物进行扩增，通过产物的长度差异对不同的转基因玉米进行辨别，实现了在同一个PCR 反应管中同时对6种不同转基因玉米的特异性检测。
关键词：转基因玉米；PCR 检测；复合PCR ；检测方法Specific Detection of Alien DNA Sequences in SixTransgenic Maize by Using Multiplex PCR MethodJIN Wu-Jun 1HAO Yang 1CHENG Hong-Mei 1LU Xing-Bo 2PENG Yu-Fa 3JIA Shi-Rong 1**Genomic DNAs with high quality suitable for PCR detection were extracted from seeds of maize ()using aplant DNA extraction kit developed in our laboratory.Based on the vector structures used for six transgenic events,Bt11,Event176,T25,MON810,GA21and NK603,specific primers were designed and target DNA sequence specific to each event could be detected by PCR.In addition,a multiplex PCR method was developed by which specific fragments with different length in a DNA sample mix-ture isolated from six transgenic maize could be amplified simultaneously in one PCR reaction,meanwhile,one fragment of maize en-dogenous reference gene zein could also be detected.transgenic maize;PCR detection;multiplex PCR;detection method在转基因作物迅猛发展的同时，国际社会引发了有关转基因作物环境和食品安全性的激烈争论(贾士荣和金芜军，2003)，影响到国际贸易和公众对转基因产品的接受程度。
转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究
转基因玉米转化体特异性PCR检测技术研究武海斌;路兴波;孙红炜;杨崇良;李天玉;李宝笃【期刊名称】《玉米科学》【年(卷),期】2009(17)1【摘要】根据不同转基因玉米中重组DNA结构,分别对转基因玉米Bt11、Bt176、Mon810、Mon863、TC1507、GA21和NK603设计转化体特异性引物进行PCR检测。
在此基础上分别以玉米内参照基因(ZSSIIb)作对照,对Bt11、Mon810、TC1507和GA21、NK603、Bt176分别作两对四重PCR反应,实现在同一个PCR 反应管中同时对3种转基因玉米及内参照基因的特异性检测。
【总页数】6页(P65-70)【关键词】转基因玉米;转化体特异性检测;PCR检测技术【作者】武海斌;路兴波;孙红炜;杨崇良;李天玉;李宝笃【作者单位】青岛农业大学植物保护学院,山东青岛266109;山东省农业科学院植物保护研究所,济南250100;新泰市农业局,山东泰安271000【正文语种】中文【中图分类】S513【相关文献】1.转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测 [J], 李飞武;李葱葱;董立明;邢珍娟;张明2.5种转基因油菜转化体特异性多重PCR检测方法 [J], 鲁军;李刚;赵建宁;杨殿林;修伟明3.转基因棉花MON757转化体特异性PCR检测方法及应用 [J], 杨阳;王叶;范金杰;谢家建;彭于发4.转基因大豆MON89788转化体特异性定性PCR检测（摘要）（英文） [J], 李飞武;李葱葱;董立明;邢珍娟;张明5.转基因玉米双抗12-5转化体特异性PCR方法验证结果分析 [J], 王颢潜; 肖芳; 杨蕾; 缪青梅; 张旭冬; 张秀杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
实时荧光定量PCR检测转基因玉米59122的方法建立及测量不确定度评估
实时荧光定量PCR检测转基因玉米59122的方法建立及测量不确定度评估宋君;郭灵安;雷绍荣;王东;尹全;张富丽;刘文娟;常丽娟【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2014(035)024【摘要】为了准确定量检测非故意扩散的转基因玉米59122,建立转基因玉米59122及产品的实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,并用特异性、准确度、灵敏度以及测量不确定度等指标评价该方法.结果显示,利用该方法只能检出转基因玉米59122;16次重复测量含量为1％的转基因玉米59122样品,平均测量值(0.9％)接近真实值(1％),相对误差为10％,测试回收率为90％,测量不确定度为0.002;能检测到最低含量为2拷贝的59122分子片段;除去3次偏离平均值较大的测量值外,13次重复测量值的变异系数为0.05.因此,实验建立的转基因玉米59122实时荧光定量PCR方法具有较高的特异性、准确度、灵敏度、精密度,较低的测量不确定度.【总页数】6页(P259-264)【作者】宋君;郭灵安;雷绍荣;王东;尹全;张富丽;刘文娟;常丽娟【作者单位】四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都 610066;四川省农业科学院农产品质量标准研究所,四川成都610066【正文语种】中文【中图分类】Q03【相关文献】1.实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度 [J], 宋君;雷绍荣;刘勇;向冰;王东;尹全;张富丽;刘文娟;常丽娟2.实时荧光定量PCR检测转基因玉米MON863结构特异基因的测量不确定度 [J], 宋君;雷绍荣;刘勇;王东;尹全;张富丽;刘文娟;常丽娟3.用蒙特卡洛方法评定转基因玉米59122的测量不确定度 [J], 宋君;刘月悦;王东;张富丽;李洁4.实时荧光定量PCR检测转基因玉米NK603品系特异片段的测量不确定度 [J], 宋君;雷绍荣;郭灵安;王东;叶先林;刘文娟;尹全;张富丽;常丽娟5.实时荧光定量PCR检测转基因玉米NK603结构特异基因的测量不确定度研究[J], 宋君;雷绍荣;刘勇;王东;刘文娟;尹全;张富丽;常丽娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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右边界
PCR assay is applicable to detect genetically modified maize and its derivates accurately, fast and efficiently, and can serve to
verify routine PCR qualitative detection.
Abstract：We report the cloning of two flanking sequence of the integrated gene construct of genetically modified maize 59122
by inverse PCR method and the design of even-specific primers based on the left flanking sequence with the aim of developing
DU 640 核酸蛋白分析仪 美国 Beckman Coulter 公 司；UV-2450 紫外分光光度计 日本岛津公司；GelDocIt 紫外凝胶成像仪 美国 UVP 公司。 1.2 制备不同转基因含量的 59122 玉米样品
将转基因玉米59122和其非转基因亲本按质量比相混 合，制成 6 个不同转基因含量(10%、5%、1%、0.5%、 0 . 1 % 、0 . 0 5 % ) 的样品。 1.3 基因组 DNA 的提取[3]
1.4.1 总 DNA 的酶切与酶切片段的环化 取约 1μg 基因组 DNA 加入 1 ×缓冲液和 10U 限制
性内切酶形成 60μL 的反应体系，选择在 ubiquitin 内含 子内部没有酶切位点的常用限制性内切酶 Sac Ⅰ和BamH Ⅰ 以及在 pat 基因序列中没有酶切位点的常用限制性内切 酶 Hind Ⅲ和 EcoRⅠ，分别于 37℃消化玉米基因组 3h， 接着用酚 - 氯仿 / 异戊醇(Tris- 饱和酚:氯仿:异戊醇的体积 比为 25:24:1)抽提法纯化 DNA(除去由限制性内切酶释放 的短的寡聚核苷酸) ，最后将基因组 D N A 溶于 2 5μL ddH2O 中。此后向含约 16ng 经过消化的基因组 DNA 中 加入 1 ×缓冲液，6U T4 连接酶形成 50μL 反应体系，在 T4 连接酶的作用下于 4℃过夜连接成环。于 75℃处理 15min 后洗涤沉淀溶于 20μL ddH2O 中。
转基因玉米转化的主要改良性状为抗虫和耐除草剂 等[1,8]，转基因玉米 59122 兼具抗虫害及耐除草剂两种特 异性转化事件，是通过农杆菌介导技术将质粒载体 PHP17662导入玉米转化事件Hi-Ⅱ基因组筛选得到的基因 改造玉米。PHP17662 包含选自 Bacillus thuringiensis strain PS149B1 的 cry34Ab1 与 cry35Ab1(delta-endotoxin) 抗虫基因以及抗除草剂 pat(phosphinothric in-N acetyltransferase，膦酸乙酰转移酶)基因。
Event-specific Transgenic Detection of Genetically Modified Maize 59122 with Flanking Sequence
XU Wen-tao1,2，YANG Rong2，LU Jiao1，ZHANG Nan1,2，LUO Yun-bo1，HE Jing1,2，HUANG Kun-lun1,2,* (1. Food Safety Laboratory, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University,
This assay has been successfully applied to detect genetically modified maizes 59122, MON863, MON810, GA21, NK603,
genetically modified Roundup Ready soybeans and genetically modified oilseed rape GT73, with high specificity. The optimum
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 转基因玉米 59122 及其非转基因亲本 美国 DuPont
公司；转基因玉米 M O N 8 63、M O N 8 10、G A 2 1 、 NK603、转基因大豆 Roundup Ready、转基因油菜 GT73 孟山都公司；限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、dNTP 大连宝生物工程有限公司；Hind Ⅲ限 制性内切酶 美国 Promega 公司；RNase A 酶、DNA Marker DL 2000、CTAB、Tris、EDTA、IPTG、氨 苄青霉素等 美国 Sigma 公司；蛋白胨、酵母粉等制 备细菌培养基试剂 鼎国公司；DNA 回收试剂盒 北京 佰亿新创科技有限公司。
称取 100mg 于液氮中研磨成粉末状的种子材料，按 CTAB 法提取样品总 DNA。提取的总 DNA 溶于 30～50μL ddH2O 中，经核酸蛋白分析仪测定其浓度，最终稀释 成 100ng/μL 和 50ng/μL 备用。用紫外分光光度计测定 DNA 溶液的 OD260 与 OD280，并计算 OD260/OD280 的比值 来评价提取的质量，本研究中所用 DNA 其 OD 比值均在 1.6～1.9 范围。 1.4 反向PCR(I-PCR)
中图分类号：Q789；S513
文献标识码：A
文章编号：1002-6630(2011)04-0139-04
随着转基因作物的不断商业化，新型转基因食品的 安全性问题逐渐成为公众关注的焦点。为此，各国都 加强了管理[1]。除了向公众公布相关信息、增加透明度 外，关键问题是建立相应的科学检测方法来分析鉴别转
Key words：genetically modified crop；event-specific transgenic detection；semi-nested polymerase chain reaction；
inverse polymerase chain reaction；duplex polymerase chain reaction
本实验根据 GeneBank 中获得的 ubiquitin 启动子(登 录号 CS165465)和 pat(登录号 DQ156557)基因序列，利用 反向聚合酶链式反应(inverse polymerase chain reaction， I-PCR)来确定转基因玉米 59122 的侧翼序列。随后，在 侧翼序列相邻的 T-DNA(转基因载体)和玉米基因组上各 设计一条引物，此对引物就可以对该转基因玉米 59122 进行转化事件特异性检测。建立定性检测体系，并验 证该检测方法的特异性和灵敏度。
基因产品。 目前，转基因产品的检测技术[2]很多，分为基于核
酸水平的检测技术、基于蛋白水平的检测技术以及其他 检测技术。在定性检测中基于蛋白水平的检测[3]不能区
收稿日期：2010-03-13 基金项目：国家“8 6 3 ”计划项目( 2 0 0 6 A A 1 0 Z 4 4 0 )；国家自然科学基金项目( 3 0 8 0 0 7 7 0 )；
concentration of linear DNA in a connection system for detecting genetically modified maize 59122 by this assay was around 1 ng/μL, which exhibited a limit of detection of 0.1% and a sensitivity of 38 copies of haploid genome. Therefore, the developed
摘 要：使用反向聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了转基因玉米 59122 的外源基因与玉米基因组之间的两段侧翼序 列，并据其左侧侧翼序列设计了具品系特异性的引物，运用半巢式 PCR 技术建立了 59122 的品系特异性二重 PCR 检测方法，扩增片段 100bp，横跨 pat 终止子与转基因玉米侧翼基因之间。以转基因玉米 59122、MON863、 MON810、GA21、NK603，转基因大豆 Roundup Ready 和转基因油菜 GT73 等为材料，证明本方法与其他转基 因作物具有高特异性。本方法在检测 59122 时，确定出连接体系中线性 DNA 的最佳质量浓度为 1ng/μL 左右，检 出限达到 0.1%，灵敏度为 38 个单倍体基因组拷贝数。因此可准确、快速、高效地检测转基因玉米及其产品，或 作为常规 PCR 定性检测后的验证方法。 关键词：转基因作物；品系特异性检测；半巢式聚合酶链式反应；反向聚合酶链式反应；二重聚合酶链式反应
of a duplex PCR assay for the event-specific transgenic detection of genetically modified maize 59122 using semi-nested PCR,
result ing in an amplification fragment of 100 bp in length stretching from the terminator of the pat gene to the 59122 flanking genes.
Beijing 100083, China ；2. Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Organisms (Beijing), Ministry of Agriculture, Beijing 100083, China)