表观遗传学
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DNMT1： 催化子链DNA半甲基化位点甲基化，维持复 制过程中甲基化位点的遗传稳定性． DNMT3a和 DNMT3b
催化从头甲基化，以非甲基化的DNA为模板， 催化新的甲基化位点形成．
DNA复制后甲基化的维持
CH3 CH3 CH3 DNA 复制酶 DNA甲基 转移酶1 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CpG岛的分析 • Gardiner-Garden and frommer 定义 （http://www.bio-soft.net/sms/index.html）
长度大于200 bp、
GC含量大于50％、 CpG含量与期望含量之比大于0.6的区域。 该定义将一些重复片段也包含其中。
Gardiner-Garden and frommer 方法（1987）
优点： 可同时检测多个CG 位点，实验结果易解释，成 本低廉。 缺点： • CG 不仅存在CCGG 序列中，非CCGG的CG 将 被忽略； • 需要样本量大， • 存在酶消化不完全引起的假阳性的问题； • 不适用于混合样本
2）基于亚硫酸氢盐修饰的方法 重亚硫酸盐作用： CG中未甲基化的C脱氨基转变成U，甲基 化的C保持不变。
• 1987年霍利德(Holliday) ：2个层面研究基因 第一个层面：基因世代间传递的规律，基因结 构中遗传信息的变化，即遗传学。 第二个层面：生物从受精卵到成体的个体发育 过程中基因活性的变化，这是表观遗传学。 基因组印迹： genomic imprinting X染色体失活：X-Chromosome inactivation
Model for methylation-dependent gene silencing
Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, converting the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery.
学分支学科。
表观遗传研究进一步促进了遗传学和基因
组学的研究。
表观基因组学和人类表观基因组计划
表观基因组学（epigenomics）： 在基因组水平上，研究表观遗传学的变化。 人类表观基因组计划（1999年12月） （Human Epigenome Project， HEP)： 研究人类基因组中表观遗传信息及其与疾病的关系 首先绘制不同组织类型和疾病状态下的人类基因组
• Takai D、Jones PA 定义： （http://cpgislands.usc.edu/） 长度大于500 bp、 GC含量大于55％、
CpG含量与期望含量之比不小于0.65的区域。
• 50％ 的基因的启动子区含有CpG岛。
Takai D、Jones PA方法 （2002）
（二）DNA甲基化转移酶 （DNA methyltransferases，DNMT）
NH2
O
N
NH
NH
O
NH
O
胞嘧啶(cytosine, C)
尿嘧啶(uracil, U)
U
PCR产物测序： 用PCR，扩增后U转化成T，PCR产物 测序，判断CG 位点是否发生甲基化。
优缺点：
可靠性、精确度高，能确定每一个CG 位
点的甲基化状态，是甲基化测定的金标准。
需大量测序，操作过程繁琐费用昂贵。
MS-MLPA 直接基因组测序 MS-DGGE MS-SSCA Methylight MS-MCA MS-DHPLC
新甲基化 位点的寻找
MS-AP-PCR MSRF DMH MCA-RDA RLGS AIMS MBD柱层法
MethylQuant
MSO
MS-DBA Compare-MS MBD柱层法
Compare-MS
相同的基因型
不同表型
Agouti基因 甲基化/叶酸
• 表观遗传学概述 • 表观遗传改变及其分子基础
• 表观遗传修饰与疾病关系
概 述
1942年沃丁顿（Waddingtong）第1次提出 表观遗传学：epigenetics 表观遗传现象： • 基因型未发生变化，表型发生可遗传的改变。 • DNA序列无变化，基因表达发生可遗传改变。 • 这种改变是由于细胞内除遗传信息以外的其他 可遗传物质发生改变。
甲基化分析是理想的检测或诊断对象 甲基化型能反映有关基因功能状态及其相关联
的多种疾病信息，
具有简单的“二元化”性质，即令甲基化为 “0”，非甲基化为“1”，就可以进行数字化处理，
荷兰的一项队列研究表明，叶酸摄入过低 可导致甲基化状态紊乱，导致神经管畸形、癌 症和动脉硬化。这种变化可被过量饮酒加剧。 Waterland RA等发现断奶后的饮食，影响 IGF2基因的甲基化状态，当饮食中缺乏叶酸、 维生素Ｂ12等甲基供体时可导致成年后IGF2的 印记丢失。
（四）DNA甲基化抑制基因转录的机制
CH CH3
新甲基化 位点形成
Maintenance DNA methyltransferase
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
(DNMT1)
CH3 CH3
（三）甲基来源：S-腺苷蛋氨酸，一碳单位
饮食、激素以及药物等外界环境因素 Ｓ－腺苷蛋氨酸：胞嘧啶甲基化供体。 蛋氨酸是必需氨基酸 叶酸：参与一碳单位代谢，间接提供甲基 补充Ｓ－腺苷蛋氨酸。 叶酸摄入不足时可导致DNA低甲基化。
常用甲基化敏感的限制性内切酶： HpaⅡ-MspⅠ：识别序列CCGG， BstUⅠ：CGCG SmaⅠ、XmaⅠ：识别序列CCCGGG， SmaⅠ、XmaⅠ识别碱基数目相对较多， DNA中出现概率相对较低， BstUⅠ 、HpaⅡ-MspⅠ更为常用。
BstUⅠ CGCG
MseⅠ:TTAA
随机引物
• 经典遗传学：基因型的遗传 遗传的分子基础是核酸，碱基序列的改变引 起生物体表现型的改变，这种改变可以从上 一代传递到下一代。 • 表观遗传学：表型的遗传 研究基因序列没有发生改变的情况下，基因 表达过程发生可遗传的变化，导致表型变化 的遗传学分支学科。
表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基 石的经典遗传学和分子遗传学母体中孕育的、 专门研究基因功能实现的一种特殊机制的遗传
催化子链DNA半甲基化位点甲基化
DNA甲基化
DNA methylation reactions
Demethylase
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
De novo methyltransferase 3
DNA replication
CH3 CH3 CH3
CH3 CH3
CpG岛CpG甲基化与基因表达抑制相关。
CpG岛分类
转录起始点附近的CpG岛（TSS–CGIs）：
（CpG islands proximal to the transcription start site of genes）
正常组织：TSS–CGIs是非甲基化的， 肿瘤组织：TSS–CGIs发生甲基化，与转录抑制相关。 转录起始点外的CpG岛（non-TSS CpG）: non-TSS–CGIs 多数位于高度重复序列的附近。 正常组织：通常呈高度的甲基化。 肿瘤组织：甲基化程度降低， 降低程度与癌症的严重程度相关。 DNA稳定性降低，发生断裂等。
2. 分离甲基化的DNA：
1）甲基化敏感的限制性内切酶法
2） 亚硫酸氢盐修饰的方法 3.）甲基化DNA特异性抗体免疫沉淀法
1）甲基化敏感的限制性内切酶法
甲基化敏感性限制性内切酶：（methylation
sensitive restriction endonuclease，MSRE）
对甲基化区DNA不切割，将DNA消化 为不同大小的片段后再进行分析。已发现 320种MSRE 。
甲基化可变位点图谱。
人类表观基因组协会（2003年10月成立）
Epigenetics： 常见译成： 表观遗传学、表现遗传学、 后生遗传学、外因遗传学、 表遗传学、 外区遗传学
表观遗传改变及其分子基础
染色质DNA或蛋白质的各种修饰
（染色质水平的基因表达调控）
DNA修饰：DNA甲基化
组蛋白修饰：甲基化、乙酰化
表观遗传现象： 基因组印迹：两个等位基因的差异性甲基 化型造成一个等位基因沉默，另一个等位 基因保持单等位基因活性。
X染色体失活：雌性哺乳动物体细胞的两 条X染色体中会有一条发生随机失活。
1994年，Holliday 第三层面：基因表达活性的变化，发生在生 物体已分化的细胞中；基因表达的变化可通 过有丝分裂的细胞遗传下去。 表观遗传与疾病相关。 1999年，Wollfe 表观遗传学定义：研究没有DNA序列变化 的、可遗传的基因表达的改变。
表观遗传学与疾病
生物化学与分子生物学系 林德馨
• 遗传学（Genetics）： 研究生物的遗传与变异的科学。 即研究基因的结构、功能及其变异、传递和 表达规律的学科 。
• 遗传的分子结构基础是核酸，碱基序列的改 变引起生物体表现型的改变，这种改变可以 从上一代传递到下一代。
没有DNA序列的变化，可发生生物体表现 型的可遗传的改变——表观遗传学
Prevent the binding of transcription factors
TF
2. 间接抑制基因表达：
非启动子区CpG序列甲基化，被甲基结合蛋 白家族（MBD）识别结合，影响组蛋白修饰 后者募集：
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和
组蛋白甲基化转移酶（HMT）等，
修饰组蛋白改变染色质活性。
（五）DNA甲基化的检测方法
1. 概述
分离甲基化的DNA： 甲基化敏感的限制性内切酶法 亚硫酸氢盐修饰的方法
基于甲基化DNA的特异性抗体免疫沉淀法
甲基化位点的定位和定量测定： PCR、基因测序、基因芯片、 Mass Arry、 高压液相等。
检测方法组合 • 亚硫酸氢钠+测序 • 亚硫酸氢钠+基因芯片 • 酶切+基因芯片 • 甲基化抗体+基因芯片
RNA干扰：RNA识别结合同源互补核苷酸序列。
基因组印迹：
X染色体失活：
一、DNA甲基化（DNA methylation）：
最重要的表观遗传修饰形式，研究最清楚。
甲基化位点： CpG中胞嘧啶第5位碳原子
DNA甲基转移酶：
甲基来源：一碳单位；
S-腺苷蛋氨酸； 环境和饮食因素：叶酸、B12
（一）甲基化位点： 5’-CpG-3’中胞嘧啶第5位碳原子
甲基化Βιβλιοθήκη Baidu法概况
基因组整体水 平甲基化分析
HPLC SeeI甲基转移酶法 免疫化学法 HPCE 氯乙醛法
特异位点的甲基化分析 单CpG 位点分析
MS-RE-Southern MS-RE-PCR 直接基因组测序 甲基化特异性PCR （MSP） COBRA Ms-SnuPE Methylight
多CpG 位点分析
非甲基化(non-methylated)：
与基因活化(gene activation)相关联。
DNA甲基化：
与基因沉默(gene silence)相关联。
去甲基化(demethylation)：
与沉默基因重新激活(reactivation)相关联。
1. 直接抑制基因表达：
启动子区CpG序列甲基化， 影响转录激活因子与启动子识别结合。
Gardiner-Garden and frommer 方法（1987）
Length=8205-7974+1=232； GC%=(59+59)/232=0.509；（G=59、C=59） CpG含量与期望含量之比： Obs /ExpCpG ObsCpG= 9 ExpCpG = (number of C's * number of G's) / length =(59*59)/232=15 Obs /ExpCpG =9/15=0.601
5
4
CH3
S-A-Met
DNMT
dCMP (~CG~)
dmCMP (~mCG~)
1. 基因组DNA CpG： 70％～80％甲基化状态
CpG甲基化与基因组稳定性相关。
2. CpG岛CpG：
CpG岛：CpG双核苷酸局部聚集，形成GC 含量较高、CpG双核苷酸相对集中的区域。 CpG岛CpG多为非甲基化状态
催化从头甲基化，以非甲基化的DNA为模板， 催化新的甲基化位点形成．
DNA复制后甲基化的维持
CH3 CH3 CH3 DNA 复制酶 DNA甲基 转移酶1 CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CpG岛的分析 • Gardiner-Garden and frommer 定义 （http://www.bio-soft.net/sms/index.html）
长度大于200 bp、
GC含量大于50％、 CpG含量与期望含量之比大于0.6的区域。 该定义将一些重复片段也包含其中。
Gardiner-Garden and frommer 方法（1987）
优点： 可同时检测多个CG 位点，实验结果易解释，成 本低廉。 缺点： • CG 不仅存在CCGG 序列中，非CCGG的CG 将 被忽略； • 需要样本量大， • 存在酶消化不完全引起的假阳性的问题； • 不适用于混合样本
2）基于亚硫酸氢盐修饰的方法 重亚硫酸盐作用： CG中未甲基化的C脱氨基转变成U，甲基 化的C保持不变。
• 1987年霍利德(Holliday) ：2个层面研究基因 第一个层面：基因世代间传递的规律，基因结 构中遗传信息的变化，即遗传学。 第二个层面：生物从受精卵到成体的个体发育 过程中基因活性的变化，这是表观遗传学。 基因组印迹： genomic imprinting X染色体失活：X-Chromosome inactivation
Model for methylation-dependent gene silencing
Methylated cytosines are recognized by methyl-CpG-binding proteins (MBDs), which in turn recruit histone deacetylases (HDACs) to the site of methylation, converting the chromatin into a closed structure that can no longer be accessed by the transcriptional machinery.
学分支学科。
表观遗传研究进一步促进了遗传学和基因
组学的研究。
表观基因组学和人类表观基因组计划
表观基因组学（epigenomics）： 在基因组水平上，研究表观遗传学的变化。 人类表观基因组计划（1999年12月） （Human Epigenome Project， HEP)： 研究人类基因组中表观遗传信息及其与疾病的关系 首先绘制不同组织类型和疾病状态下的人类基因组
• Takai D、Jones PA 定义： （http://cpgislands.usc.edu/） 长度大于500 bp、 GC含量大于55％、
CpG含量与期望含量之比不小于0.65的区域。
• 50％ 的基因的启动子区含有CpG岛。
Takai D、Jones PA方法 （2002）
（二）DNA甲基化转移酶 （DNA methyltransferases，DNMT）
NH2
O
N
NH
NH
O
NH
O
胞嘧啶(cytosine, C)
尿嘧啶(uracil, U)
U
PCR产物测序： 用PCR，扩增后U转化成T，PCR产物 测序，判断CG 位点是否发生甲基化。
优缺点：
可靠性、精确度高，能确定每一个CG 位
点的甲基化状态，是甲基化测定的金标准。
需大量测序，操作过程繁琐费用昂贵。
MS-MLPA 直接基因组测序 MS-DGGE MS-SSCA Methylight MS-MCA MS-DHPLC
新甲基化 位点的寻找
MS-AP-PCR MSRF DMH MCA-RDA RLGS AIMS MBD柱层法
MethylQuant
MSO
MS-DBA Compare-MS MBD柱层法
Compare-MS
相同的基因型
不同表型
Agouti基因 甲基化/叶酸
• 表观遗传学概述 • 表观遗传改变及其分子基础
• 表观遗传修饰与疾病关系
概 述
1942年沃丁顿（Waddingtong）第1次提出 表观遗传学：epigenetics 表观遗传现象： • 基因型未发生变化，表型发生可遗传的改变。 • DNA序列无变化，基因表达发生可遗传改变。 • 这种改变是由于细胞内除遗传信息以外的其他 可遗传物质发生改变。
甲基化分析是理想的检测或诊断对象 甲基化型能反映有关基因功能状态及其相关联
的多种疾病信息，
具有简单的“二元化”性质，即令甲基化为 “0”，非甲基化为“1”，就可以进行数字化处理，
荷兰的一项队列研究表明，叶酸摄入过低 可导致甲基化状态紊乱，导致神经管畸形、癌 症和动脉硬化。这种变化可被过量饮酒加剧。 Waterland RA等发现断奶后的饮食，影响 IGF2基因的甲基化状态，当饮食中缺乏叶酸、 维生素Ｂ12等甲基供体时可导致成年后IGF2的 印记丢失。
（四）DNA甲基化抑制基因转录的机制
CH CH3
新甲基化 位点形成
Maintenance DNA methyltransferase
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
(DNMT1)
CH3 CH3
（三）甲基来源：S-腺苷蛋氨酸，一碳单位
饮食、激素以及药物等外界环境因素 Ｓ－腺苷蛋氨酸：胞嘧啶甲基化供体。 蛋氨酸是必需氨基酸 叶酸：参与一碳单位代谢，间接提供甲基 补充Ｓ－腺苷蛋氨酸。 叶酸摄入不足时可导致DNA低甲基化。
常用甲基化敏感的限制性内切酶： HpaⅡ-MspⅠ：识别序列CCGG， BstUⅠ：CGCG SmaⅠ、XmaⅠ：识别序列CCCGGG， SmaⅠ、XmaⅠ识别碱基数目相对较多， DNA中出现概率相对较低， BstUⅠ 、HpaⅡ-MspⅠ更为常用。
BstUⅠ CGCG
MseⅠ:TTAA
随机引物
• 经典遗传学：基因型的遗传 遗传的分子基础是核酸，碱基序列的改变引 起生物体表现型的改变，这种改变可以从上 一代传递到下一代。 • 表观遗传学：表型的遗传 研究基因序列没有发生改变的情况下，基因 表达过程发生可遗传的变化，导致表型变化 的遗传学分支学科。
表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基 石的经典遗传学和分子遗传学母体中孕育的、 专门研究基因功能实现的一种特殊机制的遗传
催化子链DNA半甲基化位点甲基化
DNA甲基化
DNA methylation reactions
Demethylase
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
De novo methyltransferase 3
DNA replication
CH3 CH3 CH3
CH3 CH3
CpG岛CpG甲基化与基因表达抑制相关。
CpG岛分类
转录起始点附近的CpG岛（TSS–CGIs）：
（CpG islands proximal to the transcription start site of genes）
正常组织：TSS–CGIs是非甲基化的， 肿瘤组织：TSS–CGIs发生甲基化，与转录抑制相关。 转录起始点外的CpG岛（non-TSS CpG）: non-TSS–CGIs 多数位于高度重复序列的附近。 正常组织：通常呈高度的甲基化。 肿瘤组织：甲基化程度降低， 降低程度与癌症的严重程度相关。 DNA稳定性降低，发生断裂等。
2. 分离甲基化的DNA：
1）甲基化敏感的限制性内切酶法
2） 亚硫酸氢盐修饰的方法 3.）甲基化DNA特异性抗体免疫沉淀法
1）甲基化敏感的限制性内切酶法
甲基化敏感性限制性内切酶：（methylation
sensitive restriction endonuclease，MSRE）
对甲基化区DNA不切割，将DNA消化 为不同大小的片段后再进行分析。已发现 320种MSRE 。
甲基化可变位点图谱。
人类表观基因组协会（2003年10月成立）
Epigenetics： 常见译成： 表观遗传学、表现遗传学、 后生遗传学、外因遗传学、 表遗传学、 外区遗传学
表观遗传改变及其分子基础
染色质DNA或蛋白质的各种修饰
（染色质水平的基因表达调控）
DNA修饰：DNA甲基化
组蛋白修饰：甲基化、乙酰化
表观遗传现象： 基因组印迹：两个等位基因的差异性甲基 化型造成一个等位基因沉默，另一个等位 基因保持单等位基因活性。
X染色体失活：雌性哺乳动物体细胞的两 条X染色体中会有一条发生随机失活。
1994年，Holliday 第三层面：基因表达活性的变化，发生在生 物体已分化的细胞中；基因表达的变化可通 过有丝分裂的细胞遗传下去。 表观遗传与疾病相关。 1999年，Wollfe 表观遗传学定义：研究没有DNA序列变化 的、可遗传的基因表达的改变。
表观遗传学与疾病
生物化学与分子生物学系 林德馨
• 遗传学（Genetics）： 研究生物的遗传与变异的科学。 即研究基因的结构、功能及其变异、传递和 表达规律的学科 。
• 遗传的分子结构基础是核酸，碱基序列的改 变引起生物体表现型的改变，这种改变可以 从上一代传递到下一代。
没有DNA序列的变化，可发生生物体表现 型的可遗传的改变——表观遗传学
Prevent the binding of transcription factors
TF
2. 间接抑制基因表达：
非启动子区CpG序列甲基化，被甲基结合蛋 白家族（MBD）识别结合，影响组蛋白修饰 后者募集：
组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和
组蛋白甲基化转移酶（HMT）等，
修饰组蛋白改变染色质活性。
（五）DNA甲基化的检测方法
1. 概述
分离甲基化的DNA： 甲基化敏感的限制性内切酶法 亚硫酸氢盐修饰的方法
基于甲基化DNA的特异性抗体免疫沉淀法
甲基化位点的定位和定量测定： PCR、基因测序、基因芯片、 Mass Arry、 高压液相等。
检测方法组合 • 亚硫酸氢钠+测序 • 亚硫酸氢钠+基因芯片 • 酶切+基因芯片 • 甲基化抗体+基因芯片
RNA干扰：RNA识别结合同源互补核苷酸序列。
基因组印迹：
X染色体失活：
一、DNA甲基化（DNA methylation）：
最重要的表观遗传修饰形式，研究最清楚。
甲基化位点： CpG中胞嘧啶第5位碳原子
DNA甲基转移酶：
甲基来源：一碳单位；
S-腺苷蛋氨酸； 环境和饮食因素：叶酸、B12
（一）甲基化位点： 5’-CpG-3’中胞嘧啶第5位碳原子
甲基化Βιβλιοθήκη Baidu法概况
基因组整体水 平甲基化分析
HPLC SeeI甲基转移酶法 免疫化学法 HPCE 氯乙醛法
特异位点的甲基化分析 单CpG 位点分析
MS-RE-Southern MS-RE-PCR 直接基因组测序 甲基化特异性PCR （MSP） COBRA Ms-SnuPE Methylight
多CpG 位点分析
非甲基化(non-methylated)：
与基因活化(gene activation)相关联。
DNA甲基化：
与基因沉默(gene silence)相关联。
去甲基化(demethylation)：
与沉默基因重新激活(reactivation)相关联。
1. 直接抑制基因表达：
启动子区CpG序列甲基化， 影响转录激活因子与启动子识别结合。
Gardiner-Garden and frommer 方法（1987）
Length=8205-7974+1=232； GC%=(59+59)/232=0.509；（G=59、C=59） CpG含量与期望含量之比： Obs /ExpCpG ObsCpG= 9 ExpCpG = (number of C's * number of G's) / length =(59*59)/232=15 Obs /ExpCpG =9/15=0.601
5
4
CH3
S-A-Met
DNMT
dCMP (~CG~)
dmCMP (~mCG~)
1. 基因组DNA CpG： 70％～80％甲基化状态
CpG甲基化与基因组稳定性相关。
2. CpG岛CpG：
CpG岛：CpG双核苷酸局部聚集，形成GC 含量较高、CpG双核苷酸相对集中的区域。 CpG岛CpG多为非甲基化状态