08 第八章 植物种质资源保存

降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程
度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细
胞冰点起重要作用。
۩ 冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞 的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。
• 常用的冷冻防护剂
渗透型冷冻防护剂: 多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性 甘露醇、脯氨酸、乙二醇、丙二醇 非渗透型冰冻保护剂: 是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从 而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。 ▫ 常见的： 聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl pyrollidone, PVP) 葡聚糖(Dextrane) 聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG) 羟乙基淀粉(Hydroxyethyl starch, HES)
植物材料（培养物）的预处理 为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性， 还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与 分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞 抗寒力。 目前主要有3种预处理方式：
（1）低温锻炼 激活植物体内抗寒机制
（2）继代培养 增加有丝分裂细胞数目
（3）预培养 培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质
（3）预冷冻法 分步冰冻法
• 此法将快速和慢速2种冰冻方法结合起来。首先用较慢的速度
（0.5～4℃/min）使植物材料从0℃降至一定的预冷温度（一 般为-40℃）并停留一段时间（一般10min左右），使细胞进 行适当的保护性脱水，然后再浸入液氮冷冻。 逐级冰冻法
• 植物材料经过冷冻保护剂0℃预处理后，逐级通过-10，-15，
• 世界末日种子库（The Svalbard "Doomsday" Seed Vault）在距离北极点约1000 公里的挪威斯瓦尔巴群岛的 一处山洞中，具体处于斯匹 次卑尔根岛的朗伊尔城 （Longyearbyen），地理坐 标78°14′09″N 15°29′29″E[1] ，约1 亿粒世 界各地的农作物种子被保存 在零下18 摄氏度的地窖中。
植物材料（培养 物）的冷冻处理
冷冻的4种方法
降温冰冻方法是
影响超低温保存
快速冷冻法 慢速冷冻法
效果的关键因素
之一。
分步冷冻法 干燥冷冻法
（1）快速冰冻法 将材料从0℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度
在1000℃/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子
还未来得及形成结晶中心就降到了-196℃的安全温度， 从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱 水的材料，如种子等。 要求细胞体积小、细胞质浓厚、含水量低、液泡化程度 低的材料。
始材料。
植物种质资源的多样性由于自然灾害和人为活动
受到严重影响，作物品种资源日益匮乏
拥有妥善保存多种多样的种质资源成为人类十分
关注的问题
第一节 种质资源保存类型
种质资源的保存方式有两种，即原生境保存和 非原生境保存。 原生境保存（原地保存）：将植物的遗传材料保 存在它们的自然环境中。
云南国家级（17个，全国329个，截止 10年2月）
冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。
当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内 渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。
精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被
损伤而死亡。
溶液的玻璃化理论
溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足 够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形 成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度 足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长
（2）慢速冰冻法 将处于0℃或其他预处理温度的材料以1-2℃/min的降温速度 从起始温度降到-100℃，稳定1h后，投入到液氮保存或以此 降温速度连续降温至-196℃的方法。逐步降温过程可以使细
胞内水分有充足的时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内
水分含量减少到最低限度，达到良好的脱水效果，避免细胞 内结冰。 这种方法适合于液泡化程度较高的植物材料，如悬浮细胞、 原生质体等。
（一）低温保存
一种缓慢生长保存方法，是通过控制培养温度
（非冰冻低温）来限制培养物各种生长因子的作
用，使培养物生长减少到最低限度。
低温保存的植物离体材料类型：试管苗、愈伤组
织、花粉、茎尖等。
低温保存的基本特征是保存材料的定期继代培养， 不断繁殖更新； 基本措施是控制保存材料所处的温度和光照。 延缓保存材料生长速度的另一项措施是改变培养 基的成分，在培养基中添加生长延缓剂或生长抑 制剂，如ABA (脱落酸)、CCC (矮壮素)、PP333 (多 效唑)、B9 (比久)、MH (青鲜素)等。
第八章 植物种质资源保存
红河学院 生命科学与技术学院 陶宏征
三个问题
• 1 什么是种质资源的保存？ • 2 为什么要进行种质资源的保存？
• 3 怎样进行种质资源的保存？
• 种质(germplasm)是亲代通过生殖细胞或体细胞传
递给子代的遗传物质。
• 植物种质资源(plant germplasm resources)即为携
清华大学核能与新能源 技术研究院环境工程专 业博士研究生 香港大学博士研究生 大学生创业楷模
第二节 种质资源离体保存
• 自1975年Henshaw和Morel 首次提出离体保存
(conservation in vitro)植物种质的策略以来，该项
技术受到植物界的极度重视。
种质资源的离体保存(germplasm conservation in vitro)：是
带各种不同遗传物质的植物总称，又称遗传资源 或品种资源，包括栽培，野生及人工创造的各种 植物的品种或品系。
• 种质资源保存(germplasm conservation)是指在天
然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，
使其保持生命力与遗传性的技术。
种质资源保存的必要性：
种质资源或称基因库是选育新品种的最基本的原
2.种质资源超低温保存的原理
超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？
细胞冰冻结冰保护性脱水理论
溶液的玻璃化理论
细胞冰冻结冰保护性脱水理论
常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点 以下时，首先是细胞外溶液wk.baidu.com分“冻结”出冰；胞外溶液的浓 度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜 向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，
（二）超低温保存
1.种质资源超低温保存的发展概况
20世纪70年，Nag和Street首先证明胡萝卜悬浮培养细胞在
液氮中保存后能恢复生长。
植物超低温种质保存(cryopreservation)是指将植物的离体 材料包括茎尖（芽）、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、 悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温 （-196℃液氮）条件下进行保存的方法。
其中，茎尖、胚、幼苗等材料遗传性稳定、再生力强，对
冷冻和解冻过程中所产生的胁迫忍受能力强
极端低温温度下，活细胞内的物质代谢和生长
活动几乎完全停止。因此，细胞、组织和器官
在超低温保存过程中不会引起遗传性状的改变，
也不会丢失形态发生的潜能。同时，由于超低
温条件下，生物的代谢和衰老过程大大减慢， 甚至完全停止，因此可以长期保存植物材料。
指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等
材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理措施使之保存， 在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。 离体保存的意义 可使一些无性繁殖作物种质资源低温长期保存，避免资
源的丢失。
节省土地和劳力，方法简单，花费少并能在保存中脱毒。 一旦利用可快速繁殖；也利于种质交换。
解冻方法
a、快速解冻法
是指将液氮中保存的材料直接投入到37-40℃温水浴中进行解冻的方法。 解冻的升温速度为500-750℃/min，大多数植物材料可采用此种方法。
b、慢速解冻法
将液氮中保存的材料先臵于0℃低温下解冻，再逐渐升至室温下进行解 冻的方法。适宜细胞含水量较低的材料。如木本植物的冬芽。 化冻后的材料需立即进行洗涤， 以除去材料组织中高浓度的冷冻保护 剂，避免影响材料恢复和继续生长。最常用的洗涤方法是用含浓度为1.2 mol/L蔗糖的基本培养基25℃下处理10min，也有用浓度为1.5～2.0mol/L的 山梨醇的培养液进行保护剂成分的洗涤
增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。包括二甲亚砜（DMSO)、甘油、
3.超低温保存的基本程序
植物材料（培养物）的选取 材料的预处理 降温冷冻及超低温保存 解冻：分快速解冻、慢速解冻 再培养
超低温保存后细胞或组织活力检测
• 植物材料（培养物）的选取 物种、基因型、器官、抗寒性、年龄、生理状 态等。 植物细胞培养物的生理状态是决定冻后细胞 成活率的重要 因素。一般指数生长期和生长延 滞后期的细胞抗冻力强，存活率高。
中国科学院昆明植物研究所种质资源库
中国科学院昆明植物研究所种质资源库包括种子库、植物离体库、微生物库、动物种质资
源库、DNA库和信息中心等在内的‘资源库’建筑面积约7千平方米，目前共收集和保存
中国重要和国外部分野生生物种质资源13148种156799份（含重复保存部分），其中种子 7471种53344份、植物离体种质资源1200种12000份、总DNA2400种22000份、微生物 菌种980种2万株；还建立cDNA文库32个，种质资源圃保存活植株437种45980株（丛）。
红河阿姆山自然保护区 红河 县常绿阔叶林森林生态系统
非原生境保存（异地保存）： 将植物的遗传材料 保存在不是它们的自然生境的地方。 • 非原生境保存方式有植物园、种质圃、 种子(质) 库、试管苗库、超低温库等。 • 具体保存方法有四种：种植保存、贮藏保存、离 体保存和基因文库保存。
末日种子库
• • • • • • • • • • • • • • • • • 哀牢山国家级自然保护区 高黎贡山国家级自然保护区 大山包黑颈鹤国家级自然保护区 大围山国家级自然保护区 金平分水岭国家级自然保护区 黄连山国家级自然保护区 文山国家级自然保护区 无量山国家级自然保护区 西双版纳国家级自然保护区 西双版纳纳版河流域国家级自然保护区 苍山洱海国家级自然保护区 白马雪山国家级自然保护区 南滚河国家级自然保护区 长江上游珍稀、特有鱼类国家级自然保护区* 药山国家级自然保护区 会泽黑颈鹤国家级自然保护区 永德大雪山国家级自然保护区
缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是
一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此 与晶态不同。被称为玻璃态。此时的温度叫玻璃化形成温 度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤， 也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。
• 提高超低温冷冻保存的措施 借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。 • 冷冻防护剂防护机理： ۩ 在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果 使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下
• 植物材料（培养物）的冷冻贮藏 适宜温度下贮存冷冻材料也很重要。长期内贮 存在液氮内的材料，需合适的液氮容器。冷冻贮 存的茎尖随保存时间的延长，其生活力可能下降。
植物材料（培养物）的解冻处理 植物材料在超低温贮存过程中所发生的冻害是在 冷冻和解冻过程中产生的。 解冻过程中发生的冻害是由细胞内次生结冰造成 的。 解冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系造成破坏。
“‘资源库’中的巨型冷库占地680平方米，以零下20℃的低温使保存的种子处于‘半休
眠状态’，不会发霉或者遭受病虫害，幵且能在几十年乃至上百年内保持原有的遗传性和 发芽能力
《重要野生植物种质资源收集保存的标 准化及共享试点》（2004DKA30430）
红河学院参与 100份植物标本 种子 DNA材料
-25，-35，-40℃等，每个温度停留10 min左右，然后浸入 液氮。
（4）干燥冰冻法 将样品在含高浓度渗透性化合物（如甘油、糖类物 质等）培养基上培养一段时间，或者经硅胶、无菌 空气干燥脱水数小时，或者用褐藻酸钙液泡包裹样 品，无菌风进一步干燥，然后直接投入液氮； 或者用冷冻保护剂处理后吸除表面水分，密封于金 箔中进行慢冻。 只要脱水足够，细胞内溶液浓度即可达到较高水平 因而易进入玻璃化状态。这种方法对某些植物的愈 伤组织、体细胞胚、胚轴、胚、花粉、茎尖及试管 苗等较合适，但对大多数对脱水敏感的材料不适用。