实验二 免疫球蛋白的提取
生化实验技术-综合设计性大实验
思考题（课前设疑）
1.如何保持生化物质的生物活性？一般生化物 质在碱性条件下容易变性，还是在酸性条件 下容易变性？
原料选择和预处理
选什么样的原材料应视生产目的而定。 一般要注意以下几个方面:
1．要选择有效成分含量高的新鲜材料； 2．来源丰富易得； 3．制造工艺简单易行； 4．成本比较低； 5．经济效果要好。
如蛋白质原料的选择
蛋白质类生化产品的原料来源有动植 物组织和微生物等，原则是要选择富含所 需蛋白质多肽成分的、易于获得和易于提 取的无害生物材料。
实验实施要求：平时按各组计划时间分 别进行实验，组长有义务指导下组相关 实验内容，每次实验必须登记。
全班交流：实验结束安排课堂讨论交流， 每组准备一人汇报，一人记录；要求用 PPT总结汇报项目实施、实验创新、疑难 点，其他组学生质疑，教师点评。
指导教师：汪财生、斯越秀
实验项目训练目标
12实验目标?掌握免疫球蛋白igg的原理和方法?掌握利用紫外法单向免疫扩散法等测定igg含量的方法?掌握sdspage电泳法鉴定蛋白质纯度及测定分子量方法?掌握层析透析膜分离电泳等生化分离鉴定技术的应用及操作13实验要求掌握的技术柱层析分离技术sephadexg25分子筛层析deaecellulose离子交换层析蛋白质提取技术硫酸铵盐析透析膜分离技术等蛋白质含量测定消光系数法folin酚法测定igg蛋白质含量蛋白质分子量纯度活性测定sdspage电泳法检测单向免疫扩散法猪脾脏dna提取及含量鉴定实验二21内容提要为了研究dna分子在生命代谢中的作用常常需要从不同的生物材料中提取dna
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-1血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于 2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃ 烘箱烤干（若超过150 ℃ 则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
免疫学实验 免疫比浊(免疫球蛋白的测定)
3 免疫胶乳比浊法
原理
选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗 粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则 发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之 内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则 使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝 集成正比，与抗原量成正比。
（a）带抗体的胶乳在波长之内可透过光线； （b）结合后，则形成光线衰减
2. 海德堡（heidelberger）曲线理 论
2 抗体的质量
（1）特异性高 （2）效价高 （3）亲和力高 （4）抗血清来源
3 抗原抗体反应的溶液
• pH 6.5~8.5
• 电解质 离子强度、种类（磷酸盐缓冲液）
4 增浊剂的使用
• PEG、tween-20等非离子型亲水 剂
• 作用：消除蛋白质分子周围的电子 云和水化层，促进抗原、抗体分子 靠近，结合形成大分子复合物。
（二）类型
1. 透射免疫比浊法 2. 散射免疫比浊法 3. 免疫胶乳比浊法
1 透射免疫比浊法
原理：
抗原抗体在一定缓冲液中形成免疫复合物 (IC)，当光线透过反应溶液时，由于溶液内复 合物粒子对光线的反射和吸收，引起透射光减 少，免疫复合物量越多，透射光越少，即光线 吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和复合物 的量成正比，当抗体量固定时，与待检抗原量 成正比。用抗原标准品建立标准曲线，可测出 待检抗原含量。
•
样本管吸光度
• 浓度＝————————×校准液浓度（g/L）
•
校管吸光度
• 结果及讨论
– 检测报告 – 检测意义
实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测
实验步骤见说明书 IgG9.77g/L IgA1.72g/L IgM1.37g/L
沉淀反应
微生物与免疫教研室
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
实验二电泳
信号放大作用
间接检测法：
a.二级抗体可测定多种多样的一级
抗体从而避免了逐一标记一级抗体; b. 一抗通常能与几个二抗分子结合， 从而起了信号放大的作用。Western 印迹法检测蛋白的敏感 性为1-5ng。 缺点：是一抗可能会与二抗发生交 叉反应，产生非特异性条带；检测 过程增加了额外的温育步骤。
床上轻轻摇动50min。
(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。
加入封闭液后的塑料袋
一抗反应
二抗反应
3、与酶标第二抗体结合 (1)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇 动50min。 (2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除 Tween-20。
二、实验目的
通过蛋白质标准曲线求出IgG重链的分子量 检测人体患病状态下IgG蛋白含量的差异
三、实验步骤
两个胶条分别处理
宽 胶 条 窄 胶 条
考马斯亮蓝R250染色
标人 准血 蛋清 白
人 血 清
转印后免疫染色
染色、脱色
•
将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水
清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250
染色液染色1小时左右，然后换成脱色液
临床免疫和免疫检验实验指导
临床免疫和免疫检验实验指导（一）免疫血清的制备与鉴定实验一、免疫血清的制备机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产生体液免疫（抗体）和细胞免疫（致敏的T淋巴细胞及其产物多种淋巴因子）的过程。
一种抗原能否引起免疫反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的抗原决定簇。
另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。
上述条件具备时，抗原经合适途径，选择合适剂量及次数，进入机体内，经过一段潜伏期，抗体水平就逐渐升高，维持高峰，既高效价抗体。
利用此原理可制备血清学试验所需的抗血清、各种免疫球蛋白及溶血素等。
制备优质的免疫血清除需要纯化抗原外，还需注意选择合适的动物及注射的途径，抗原剂量、注射次数等有密切关系。
（一）抗原制备和动物的选择1．抗原的制备：为了制备特异性强、亲和力高和效价满意的抗血清，首先要选择合适的抗原。
抗原的特异性除与其分子量大小有关外，还与其分子表面上决定簇性质、位置、立体构型有密切的关系。
抗原种类可分为天然抗原、人工抗原及合成抗原。
在天然抗原中又可分为可溶性抗原（如血清、毒素、组织浸出液等）、颗粒性抗原（如细菌、红细胞等）及半抗原（本身无免疫原性，必须与载体结合才有免疫原性）。
2．动物的选择：实验室多选用家兔、豚鼠（或鸡），商品性生产多用马、羊，特殊情况选用猴。
在免疫前应预先测定体内有无存在低滴度交叉反应的天然抗体。
（二）抗原的注射途径和剂量1．注射抗原的途径：通常可采用静脉、腹腔或皮下途径，皮内或肌肉途径较少采用。
近期发展在局部淋巴结或足等部位注射抗原。
不同途径，抗原在体内代谢速度不同，因而产生抗体的水平不同。
在皮下组织中能长期贮留的抗原，特别是与佐剂相混合的抗原，可以从皮下组织内缓慢释放出来，有利于抗体的产生。
2．抗原剂量及注射次数：应随抗原的性质而异。
3．每次注射间隔时间：不同抗原和不同免疫方法，可从数日到数周，一般无佐剂抗原为2~4天。
加佐剂抗原为10~15天。
（三）佐剂的作用原理及种类：1．原理：佐剂又称免疫增强剂。
实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白
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四肽链结构 所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重
链（H）和两条轻链（L）。
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三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
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2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
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6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
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三、试剂与器材
1、膜转移缓冲液
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2、TBST缓冲液
3、封闭液 含有5%脱脂奶粉的TBST液。
4、DAB显色
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实验器材
半干转移槽 PVDF (聚偏氟乙烯)膜 两张厚的滤纸 刀片 塑料盒
2、应用Western Blotting技术鉴定经 SDS-PAGE分离后的目标蛋白。
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二、原理
Western Blotting简称蛋白质印迹法。蛋白质 样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋 白质区带通过电泳方法转移、固定到载体 （如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价 键的形式与蛋白质结合，从而固定蛋白质； 以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一 抗体起免疫反应，再和酶标记的第二抗体反 应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置 含底物的溶液中温育，即可检测出样品中的 特异蛋白质组分。
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7、分离胶缓冲液（PH8.8）
36.3g Tris,48ml 1mol/L HCl, 加水至100ml.
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8、5xSDS凝胶上样缓冲液
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四、实验步骤：
1、聚丙烯酰胺凝胶的制备
根据目的蛋白质的相对分子质量大小确定凝胶使用浓度，浓缩胶一般为3%~5%
分离胶浓度与蛋白质分子质量的关系
ApoB及其抗体制备综合性实验
ApoB及其抗体制备综合性实验200631800112 温生超抗原免疫动物产生的抗体是血清γ-球蛋白的一部分。
γ-球蛋白是一组结构相似，但又有差异的蛋白质，通称为免疫球蛋白，按其结构和免疫化学性质的差异，又可分为五类，分别称为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE, 抗体以IgG最为稳定。
因蛋白在体液中含量不同以及分离纯化的难易的差别，可分别采用多克隆抗体制备法和单克隆抗体制备法。
一、目的本试验主要以临床检验应用为目的，培养学生的综合分析和实际操作能力。
二. 蛋白质提取纯化 (纯化ApoB为例)1, 提取采人外周血液(不抗凝)，离心得血清，用半饱和硫酸铵沉淀球蛋白，弃上清，留沉淀（球蛋白部分）2,纯化上柱层析，分部收集，浓缩，冰冻干燥，－80℃保存3,鉴定(1) 电泳，观察每组份电泳带，若为单一带即为免疫纯。
(2) 估价分子量，通过SDS-PAGE估价分子量(3) pI测定，通过等电技术测定pI(4) 氨基末端分析（C-末端，N-末端）(5) 已知ApoB抗体进行免疫鉴定三. 抗体的制备1．多克隆抗体的制备(1)抗原:目前所知的载脂蛋白进入异种机体后，能致敏淋巴细胞，与抗体产生特异性结合复合物，即具备有抗原性。
抗原性包括免疫原性和抗原特异性两方面的含义。
载脂蛋白因具备抗原特异性和免疫原性，因此可称为完全抗原，大多数动物的免疫系统是非常敏感的，用于免疫的抗原仅需要极微量。
抗原应该是纯化品，该纯品在12.5％的PAG 电泳后，仅出现一条区带，即认为可用于免疫抗原纯品。
先用大白兔,为批量生产，以采用山羊或绵羊(2) 佐剂：佐剂是指与抗原混合注入机体后，能增加抗原的免疫性或者能改变免疫反应类型的一种物质。
人们公认的佐剂是福氏佐剂(Freund’adjuvant)，具有明显的免疫刺激作用。
福氏佐剂又可分为两种，即不完全佐剂和完全佐剂，属于一种油包水的乳剂，由羊毛脂或甘露糖醇单油酸酯为乳剂。
油包水乳化剂有助于促进免疫反应的进行，还可起部分保护不稳定抗原的作用，使抗原在体内的吸收期延长，从而减少加强注射的次数。
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-2
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定-2二、组织样品在生化实验中，经常利用离体组织研究各种物质代谢途径和酶系的作用。
或者从组织中分离、纯化核酸、酶以及某些有意义的代谢物质进行研究。
但是，在生物组织中，因含有大量的催化活性物质，离体组织的采集必需在冰冷条件下进行，并日需尽快完成测定。
否则其所含物质的量和生物活性都将发生变化。
一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出所需脏器或组织，除去脂肪和结缔组织，用冰冷生理盐水洗去血液，再用滤纸吸干，称重后，按试验要求制成匀浆或者组织糜。
组织糜：迅速将组织剪碎，用捣碎机绞成糜状，或加入少量砂于乳钵中，研磨至糊状。
组织匀浆：取一定量新鲜组织剪碎，加入适量匀浆制备液，用高速电动匀浆器或者玻璃匀浆器磨碎组织。
由于匀浆器的柞头在高速运转中会产生热量，因此在制备匀浆时，需将匀浆器置于冰水中。
常用的匀浆制备液有生理盐水、缓冲液和0 .25mol/L 的蔗糖液等，可根据实验的要求，加以选择。
组织浸出液：上述组织匀浆液再经过离心分离出的上清液就是组织浸出液。
II 蛋白质的沉淀反应1．实验原理在水溶液中，蛋白质分子表面结合大量的水分子，形成水化膜，同时蛋白质分子本身带有电荷，与溶液的反离子作用，形成双电层，因而每个蛋白质分子可形成一个稳定的胶粒。
整个蛋白质溶液就形成稳定的亲水溶胶体系。
当某些物理化学因素导致蛋白质分子失去水化膜或失去电荷，甚至变性时，它就丧失了稳定因素，以固态形式从溶液中析出，这就是蛋白质的沉淀作用。
蛋白质的沉淀作用分为两类：1）可逆沉淀作用在发生沉淀作用时，虽然蛋白质已经沉淀析出，然而其分子内部结构并没发生明显的改变，仍保持原有的结构和性质。
如除去沉淀因素，蛋白质可重新溶解在原来的溶剂中。
因此，这种沉淀作用称为可逆沉淀作用。
属于此类的有盐析作用，低温下丙酮、乙醇使蛋白质沉淀的作用，以及利用等电点的沉淀。
盐析作用：用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程。
在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子的水化膜被剥夺。
免疫球蛋白的制备方法及在畜禽生产中的应用
（一）在家禽和水产中的应用
口服Ig可使禽类对相应病原体引起的胃肠道感染性炎 症有被动免疫保护作用。徐奇友等(2003)将Ig用于预 防和治疗禽类的胃肠道感染性炎症和腹泻取得满意结 果。 Ig用于禽类疫病防治方面的研究报道较多，且已 有产品应用于生产中，如用于紧急预防和治疗传染性 法氏囊病(IBD)、新城疫(ND)等疫病的Ig，效果很好 (那红等，1997)。在水产动物方面，Otake等(1991) 报道通过给日本鳗鱼口服特异性Ig，可降低死亡率， 清除肠道病原菌，从而减少对肝和肾的侵害。郭本恒 等(1993)报道，给感染前或感染后的鳕鱼口服Ig，可 显著降低死亡率和肠道感染率。虹鳟鱼若在感染前4h 腹腔内注射Ig，则可获得相同的被动免疫作用。
节过程中起着重要作用，是动物体 内的免疫系统最为关键的物质之一。 大量的研究表明，Ig对许多病原微 生物和毒素有抑制作用。其生物学 功能主要表现为与相应抗原特异性 结合、激活补体、结合细胞产生多 种生物学表达、通过胎盘传递免疫 力等。
免疫球蛋白的性质
免疫球蛋白具有所有蛋白质的通性，它的活性受 到热、酸、碱等的影响。因此，在分离制备时， 应保障其在分离制备条件下的稳定性。其粗品的 免疫活力在低于57℃时，几乎没有变化，但从 57℃开始降低，将近80~C时基本失活；过酸或过 碱都会造成免疫球蛋白变性失活。杨严峻等(1996) 研究发现，免疫球蛋白的耐热性与其纯度有关， 纯度越高，其耐热性就越差。因此在分离制备Ig 时不仅要考虑温度对Ig活力的影响，纯度也是要 重点考虑的因素，而且对纯度的要求也越来越高。
猪免疫球蛋白在禽病防治中的应用效果分析
动物生产的加重，还可能会出现走路失调、翅膀无力、停止进食、逐渐消瘦的现象，并且鸡的嗉囊内会充满液体，鸡冠呈白色。
如果是幼鸡患上此病，通常情况下都会在1周左右时间死亡。
对病鸡进行剖检会发现盲肠的肠管会肿大，并且在肠管中会出现比较明显的糜烂，并伴有暗红色血液凝块。
鸡的其他脏器不会发现异常。
1.3 诊断方法结合病鸡出现的症状以及剖检结果可以做出初步诊断，进行最终确诊还需进行实验室检查。
可以用病变肠段黏液制成涂片，然后使用生理盐水调匀，通过镜检可以发现大量球星裂殖体，由此可初步判定为鸡球虫病。
也可以采取鸡的血便，加入饱和盐水搅匀，经60目铜丝网或尼龙网过滤，防治15分钟后用金属纹圈蘸取上层液膜通过显微镜检查，若发现大量的球虫卵囊，由此可以进一步判定为鸡虫球病。
2 鸡球虫病的综合防治建议2.1 防治方法可以用磺胺嘧啶以0.4%的比例拌入饲料之中进行喂食，连续喂食3天，然后隔2天再喂食3天，可以起到有效的防治效果。
也可以用磺胺氯吡嗪按0.03%混入饮用水中进行喂食，需要连续喂食3天，也可以起到比较理想的治疗效果。
除此之外，在日常的养殖过程中，还需要做好饲料的管理工作，注重鸡舍的清洁。
为了避免外部传染源进入鸡舍，要对外来人员以及外来车辆等加强控制，严格消毒，避免给鸡造成传染。
病鸡要及时进行隔离治疗，病死鸡要进行烧毁或者深埋处理，以免造成更大范围的传染。
尤其要重视幼鸡的预防，应从幼鸡出生便开始使用药物进行预防。
2.2 免疫预防虽然药物预防的效果比较明显，但药物预防会在一定程度上提升养殖成本，并且长时间用药会使球虫产生耐药性，导致药物预防效果变弱。
虽然交替使用抗球虫药物能够降低球虫的抗药性，但这种方式一方面操作比较复杂，另一方面如果用药不当，也会导致预防效果不理想。
因此现阶段最理想的防治手段应为疫苗防治。
可以通过喷雾的方式将疫苗喷洒在孵化房、育雏箱，甚至是饲料中，也可以直接将疫苗注入引用水中进行喂食。
以上措施均可以起到良好的预防效果，能够有效降低球虫病的发病几率。
免疫球蛋白的制备和应用
免疫球蛋白的制备和应用免疫球蛋白是人体免疫系统中一种重要的蛋白质，能够识别并结合不同种类的病原体，协助清除体内的病菌、病毒等有害物质。
在人类历史上，免疫球蛋白一直扮演着重要的作用。
如今，随着科技的进步，人们已经能够通过生物工程技术制备大量的免疫球蛋白，用于医疗、科研等领域。
一、免疫球蛋白的制备免疫球蛋白的制备涉及到多个环节，包括病原体的制备、动物免疫、免疫球蛋白的纯化等。
下面我们分别介绍这些环节的具体情况。
1. 病原体的制备在制备免疫球蛋白之前，需要先选定一个具有代表性的病原体，例如流感病毒、肝炎病毒等。
然后，通过分离、培养等手段，获得病原体的复制体。
2. 动物免疫在病原体制备完成后，需要将其注入到动物体内，诱导其免疫反应。
常用的实验动物包括小鼠、兔子、猴子等。
注射一定量的病原体，能够刺激动物体内的免疫系统产生免疫球蛋白。
3. 免疫球蛋白的纯化通过动物免疫后，就可以从动物血浆中提取免疫球蛋白。
提取的过程中，需要利用一些化学和物理手段将血浆和其他成分分离开来。
这部分是免疫球蛋白制备中最为关键的一步，其条件需要严格控制以确保免疫球蛋白的纯度和活性。
二、免疫球蛋白的应用由于免疫球蛋白具有高度的特异性和亲和力，因而被广泛应用于医疗、科研、解毒等领域。
下面我们分别介绍一些常见的应用情况。
1. 医疗免疫球蛋白是预防和治疗某些疾病的有效手段。
例如，乙肝疫苗就是通过免疫球蛋白的制备和应用得到的，该疫苗已成为预防乙型肝炎的有效手段之一。
此外，在治疗某些疾病时，将免疫球蛋白注射到人体中，能够增强患者免疫系统的能力，提高治愈率。
2. 科研免疫球蛋白不仅在治疗上有应用，还被广泛用于科研领域。
例如，在细胞分子生物学实验中，免疫球蛋白能够识别并结合不同种类的蛋白质，便于研究蛋白质结构和功能等。
此外，免疫球蛋白也广泛用于生物制药等领域，成为了制药工业中不可缺少的分子工具。
3. 解毒在某些急性毒性的中毒情况下，免疫球蛋白也被广泛运用。
免疫学检验教案
免疫学检验教案一、教学目标1、让学生了解免疫学检验的基本概念、原理和方法。
2、使学生掌握常见的免疫学检验技术，如免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
3、培养学生运用免疫学检验知识解决实际问题的能力。
4、引导学生树立严谨的科学态度和实验操作规范意识。
二、教学重难点1、重点（1）免疫学检验的基本原理和常见技术的操作流程。
（2）免疫球蛋白、补体、细胞因子等免疫物质的检测方法。
2、难点（1）免疫学检验结果的分析和解读。
（2）不同免疫学检验技术的优缺点及适用范围。
三、教学方法1、讲授法：讲解免疫学检验的基本概念、原理和方法。
2、演示法：通过多媒体展示实验操作过程和结果，增强学生的直观感受。
3、实验法：安排学生进行简单的免疫学实验，提高学生的动手能力和实践操作水平。
四、教学过程1、课程导入（约 10 分钟）通过介绍一些常见的免疫相关疾病，如过敏、自身免疫性疾病等，引出免疫学检验的重要性和应用领域。
提问学生对免疫学的初步认识，激发学生的学习兴趣。
2、基础知识讲解（约 30 分钟）（1）免疫学检验的定义和范畴。
（2）免疫系统的组成和功能，包括免疫器官、免疫细胞和免疫分子。
（3）抗原和抗体的基本概念，以及它们之间的相互作用原理。
3、常见免疫学检验技术（约 60 分钟）（1）免疫荧光技术原理：利用荧光标记的抗体与抗原特异性结合，在荧光显微镜下观察荧光信号。
操作步骤：标本制备、荧光抗体染色、观察结果。
应用：检测病原体、自身抗体等。
（2）酶联免疫吸附试验（ELISA）原理：将抗原或抗体固定在固相载体上，通过酶标记的抗体或抗原与之反应，最后通过显色反应检测结果。
操作步骤：包被、封闭、加样、孵育、洗涤、显色、测定。
应用：广泛用于检测各种生物标志物，如激素、肿瘤标志物等。
（3）免疫印迹法（Western blotting）原理：通过电泳将蛋白质分离，然后转移到膜上，用特异性抗体检测目标蛋白。
操作步骤：蛋白提取、电泳、转膜、封闭、抗体孵育、显色。
实验二免疫球蛋白的粗提
•
盐析物血清 • 2．硫酸铵饱和溶液 硫酸铵 800g~850g H2O 1 000ml • 加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室 温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调 pH值也可以）。 • 注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量 重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重 金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过， 加热蒸发H2S即可。
⑴ 区带电泳 ⑵ 琼脂双相双扩散鉴定 ⑶ 免疫电泳鉴定 ⑷ 圆盘电泳鉴定
作业与思考题：
• 1，常用的分离、纯化免疫球蛋白的方法主要 有那几种？各自得到的纯度如何？ • 2，五类免疫球蛋白分离纯化的方法皆相同吗？ • 3，分离纯化IgG时，为什么硫酸铵的饱和度 先调至50%，然后调至33%？加入硫酸铵溶液 时，为什么要一滴滴地加？
• IgG的纯度鉴定 可采用下列方法之一鉴定。
盐析法原理水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的基础?在蛋白质胶体溶液中加入一定量的nh4na2so4盐类使溶液中大部分自由水分子转变为离子水化分子降低蛋白质极性基团与水分子的离子水化分子降低蛋白质极性基团与水分子的相互作用破坏蛋白质水膜蛋白质溶解度也随之降低
实验一、免疫球蛋白的粗提
实验目的：
• 学习免疫球蛋白的粗提方法 • 实践IgG分离纯化过程 • 了解分离纯化抗体的原理
• 多克隆抗体血清含有多种蛋白质组分，不适用 于实验室分析、检测应用。
• 根据实验目的不同，可按照不同的方法对有效 的抗体成分进行分离、纯化。
盐析法原理
• 水膜与同性电荷的排斥作用是蛋白质胶体稳定的 基础， • 在蛋白质胶体溶液中加入一定量的（ NH4 ） 2SO4 或 Na2SO4 盐类，使溶液中大部分自由水分子转变为 离子水化分子，降低蛋白质极性基团与水分子的 相互作用，破坏蛋白质水膜，蛋白质溶解度也随 之降低。 • 蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不 同浓度的高盐溶液内分级析出。33% （NH4）2SO4 为沉淀IgG的最适饱和度。
莎能奶山羊初乳免疫球蛋白的提取研究
莎能奶山羊初乳免疫球蛋白的提取研究•摘要：美国亚特兰大和乔治亚州的政府疾病控制中心研究发现，羊初乳含有广谱抗病毒因子，能抵抗病毒侵入，如流感病毒、肝炎病毒等，提高人体抗病能力。
羊初乳能强化新生儿的免疫系统，其中的某些免疫球蛋白能够加速B淋巴细胞的成熟，促进抗体的生成。
《纽约科学院年报》羊初乳中的免疫球蛋白能够中和大多数细菌，病毒和酵母菌。
《外科杂志》羊初乳对腹泻，尤其是轮状病毒引起的小儿秋季腹泻具有显著的改善作用。
所以羊初乳还是很有广泛市场前景的。
关键词：羊初乳; 免疫球蛋白; 功效;市场前景目录1 羊初乳 ............................................................ - 3 -1.1 羊初乳的基本概念................................. 错误!未定义书签。
1.2 羊初乳的使用记载............................................. - 3 -1.2.1 羊初乳的成分及功效 ..................................... - 3 -1.3 羊初乳和羊奶粉的区别......................................... - 4 -1.3.1 我国的奶粉现状 ......................................... - 3 -1.3.2 羊初乳和羊奶粉的成分区别 ............................... - 3 -1.3.3 羊初乳对人体的好处 ..................................... - 3 -2 免疫球蛋白 ........................................................ - 7 -2.1 免疫球蛋白的概况............................................. - 7 -2.2 材料与仪器................................................... - 7 -2.2.1 试验材料 ............................................... - 3 -2.2.2 主要仪器 ............................................... - 3 -2.2.3 溶液的配制 ............................................. - 3 -2.3 实验方法..................................................... - 7 -2.3.1 初乳乳清的制备 ......................................... - 3 -2.3.2 pH值对免疫球蛋白稳定性的影响........................... - 3 -2.3.3 加热对免疫球蛋白活性的影响 ............................. - 3 -2.3.4 糖醇化合物对免疫球蛋白活性的保护作用 ................... - 3 -2.4 免疫球蛋白质量浓度的测定..................................... - 7 -2.5 免疫球蛋白变性率的计算....................................... - 7 -2.6 结果与分析................................................... - 7 -2.6.1 pH值对免疫球蛋白稳定性的影响........................... - 3 -2.6.2 加热对免疫球蛋白稳定性的影响 ........................... - 3 -2.6.3 糖醇化合物对免疫球蛋白活性的保护作用 ................... - 3 -2.7 结论 ........................................................- 7 - 参考文献：.... ...................................................... - 15 - 致谢： .............................................................. - 14 -1 羊初乳1.1羊初乳的基本概念顾名思义羊初乳是指母羊生小羊后3天内所分泌的乳汁，其含有丰富的营养物质、各种生长因子和免疫球蛋白等物质.但必须认清一点的是：羊初乳≠母乳≠药品≠保健品≠辅食（狭义）1.2 羊初乳的使用记载羊初乳在世界各国都很很多早期的记载。
免疫球蛋白IgG的提取-3
免疫球蛋白IgG的提取-3五、蛋白质的盐析法向蛋白质溶液中加入不同浓度的中性盐，可以把不同的蛋白质分别沉淀出来。
这种方法称为蛋白质的盐析。
利用蛋白质的盐析法，可以得到我们所需的不同的免疫球蛋白。
最常用的中性盐包括，硅酸铵、硫酸镁、硫酸钠等，其中以硫酸铵最为常用：（一）、优点1、在水中溶解度大，其饱和溶液含有大量盐；2、在水中的溶解度受温度的影响很小；3、一般不会引起蛋白变性。
（二）、缺点提取的纯度较差，所以只能用它作为粗提。
饱和硫酸铵溶液配法：取760g～800g硫酸铵，放人70～80℃蒸馏水1000mL中，搅拌约20min，室温静置过液，硫酸铵结晶析出，即上清为饱和硫酸铵，再用NH40H调pH为7.0。
六、实验内容（一）稀释血清向血清中加入生理盐水，做1�U1稀释，主要目的，以防蛋白质溶液浓度过稠，引起其它蛋白质共沉，或局部蛋白质变性。
（二）用50%饱和度硫酸铵提取免疫球蛋白将用生理盐水按l�U1稀释的动物血清置于三角烧瓶或烧杯中，在电磁搅拌器不断搅拌下，逐滴加入与稀释的蛋白液等量的饱和硫酸铵（血清1体积+生理水1体积+饱和硫酸铵2体积），搅拌的目的是为了防止局部硫酸铵浓度过高。
搅拌后，室温放置0.5～1h，或置4℃冰箱过夜，次日取出，以每分钟4000转离心30min（离心管周围加冰块或冰水），离心后弃上清（内含白蛋白等），沉淀物中即含γ和β球蛋白。
硫酸铵溶液的饱和度是指在整个溶液中所占的百分比，与原蛋白液的浓度无关。
分子量大的蛋白质先沉淀，分子量小的蛋白质后沉淀，球蛋白的分子量20～30万，而白蛋白的分子量只有69000，所以50%饱和度硫酸铵沉淀的是球蛋白，而白蛋白则留在上清液中。
（三）用33%饱和度硫酸铵提取血清中的γ球蛋白当血清中饱和硫酸铵为50%饱和度时，沉淀三次，仍含有大量的α、β球蛋白及极少量的白蛋白，当硫酸铵饱和度由50%减少到33～35%时，沉淀蛋白质中的α、β球蛋白和白蛋白的含量相应逐渐减少，而γ球蛋白的纯度逐渐提高，第三次沉淀物只含有少量的α、β球蛋白及白蛋白。
IgG纯化指南
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
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溶解，搅拌下逐滴加入5 ml饱和硫酸铵，室温
10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。离
心，取沉淀。重复沉淀三次可提高分离物纯度。
方法步骤
（2）脱盐：用透析法（或用凝胶过滤法）
用少量生理盐水将沉淀溶解，用毛细滴管将其移 入透析袋中，两端扎紧，将透析袋浸没于大烧杯 中，先对蒸馏水透析12小时，换液两次，再对生 理盐水透析，换液三次以上，直至透析液中无
NH+4（用奈氏试剂检验，无黄色出现），无 硫酸根离子（1%氯化钡检验，无白色沉淀）。
方法步骤
（3）浓缩：
经透析的蛋白质溶液，如果浓度太稀，可在透析
袋中用冷风（10 ℃以下）吹，或包埋于脱水剂
（变色硅胶、聚乙二醇、蔗糖等）中浓缩。
方法步骤
（4）测定：
提取的蛋白溶液用生理盐水稀释后，用紫外分光光 度计测定其280nm和260nm时的光密度。按下列 公式计算蛋白质浓度。
实验二、免疫球蛋白的提纯
概 述
从血清中（或体液中）分离免疫球蛋白就是根
据各类免疫球蛋白与其他血清蛋白的分子大小、
电离密度、等电点及在水溶液中溶解度不同的
特性，将他们分离出来，进而加以纯化。免疫
球蛋白的分离与纯化是免疫学实验技术的基础。 免疫球蛋白分离与纯化的方法很多，常用的有 盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法及亲和 层析法等。
由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结
合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它
们分开。
在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：
球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为球蛋
白和球蛋白，最后为白蛋白。
亲和层析法
由于抗原和抗体可发生特异性的可逆结合，先将
抗原或抗体等偶联到某种固相载体上装柱，再加 入分离样品进行层析。样品中的特异性抗体或抗 原被吸附，其它成分则从层析柱下端流出。再用 洗脱剂将吸附在柱上的抗体或抗原解离洗脱下来， 即可得到纯化的抗原或抗体。
等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。
+ + + +
碱 碱 + 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 （悬浮） （悬浮） 脱水作用 脱水作用
+ +
酸
酸
- - 带负电荷的蛋白质 （悬浮） 脱水作用
-
-
+ + + + 中和电荷 + + + 带正电荷的蛋白质 （悬浮）
中和电荷 -
-
-
带正电荷的蛋白质 （沉淀）
盐析法
在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分
子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离
子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋
白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，
并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。
各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同， 控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。 盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白
Lowry-kalokar公式：蛋白浓度（mg/ml） =1.45*OD280-0.74*OD260
OD读数以1.0左右最为适宜，如OD>2时就需要稀释， 计算蛋白浓度时应乘上稀释倍数。
离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反
电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。
常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ 球蛋白）和
QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴
离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其
阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。
当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋
凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状 凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形 状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。
一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时
速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱
较快。
常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和
琼脂糖凝胶等。
离子交换层析法
硫酸铵盐析法提纯血清 中的免疫球蛋白
材料
器材：
1、紫外分光光度计、磁力搅拌器、离心机；
2、三角瓶、吸管；3、透析袋
试剂：
4. 1%BaCl2 5. 奈氏试剂
1、饱和硫酸铵溶液；2、生理盐水； 3、血清
方法步骤
（1）盐析：
血清5ml用等量生理盐水稀释，逐滴加入饱和硫酸铵 10 ml，边加边搅拌，加完后继续搅拌10min，室温 10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。 4000rpm离心15-30min，取沉淀用10 ml生理盐水
带负电荷的蛋白质 （悬浮）
用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度 高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。 用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获 得较纯的IgG，但会损失一部分-球蛋白。 用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但-球蛋白 也会同时沉淀。
如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用 50%的饱和硫酸铵。