实验二 免疫球蛋白的提取

硫酸铵盐析法提纯血清 中的免疫球蛋白
材料

器材：
1、紫外分光光度计、磁力搅拌器、离心机；
2、三角瓶、吸管；3、透析袋

试剂：
4. 1%BaCl2 5. 奈氏试剂
1、饱和硫酸铵溶液；2、生理盐水； 3、血清

方法步骤
（1）盐析：

血清5ml用等量生理盐水稀释，逐滴加入饱和硫酸铵 10 ml，边加边搅拌，加完后继续搅拌10min，室温 10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。 4000rpm离心15-30min，取沉淀用10 ml生理盐水
Lowry-kalokar公式：蛋白浓度（mg/ml） =1.45*OD280-0.74*OD260


OD读数以1.0左右最为适宜，如OD>2时就需要稀释， 计算蛋白浓度时应乘上稀释倍数。
盐析法

在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分
子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离
子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋
白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，
并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。

各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同， 控制盐的浓度，能将血清中免疫球蛋白分离出来。 盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白
凝胶过滤法

凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状 凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形 状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。

一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时
速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱
较快。

常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和
琼脂糖凝胶等。
离子交换层析法

等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。
+ + + +
碱 碱 + 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 （悬浮） （悬浮） 脱水作用 脱水作用
+ +
酸
酸
- - 带负电荷的蛋白质 （悬浮） 脱水作用
-
-
+ + + + 中和电荷 + + + 带正电荷的蛋白质 （悬浮）
中和电荷 -
-
-
带正电荷的蛋白质 （沉淀）

离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反
电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。

常用的离子交换剂有DEAE纤维素（ 球蛋白）和
QAE-交联葡聚糖A-50（IgG），二者都是碱性阴
离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其
阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。
当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变 为零，不能吸附，被洗脱下柱。
实验二、免疫球蛋白的提纯
概 述

从血清中（或体液中）分离免疫球蛋白就是根
据各类免疫球蛋白与其他血清蛋白的分子大小、
电离密度、等电点及在水溶液中溶解度不同的
特性，将他们分离出来，进而加以纯化。免疫
球蛋白的分离与纯化是免疫学实验技术的基础。 免疫球蛋白分离与纯化的方法很多，常用的有 盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法及亲和 层析法等。
NH+4（用奈氏试剂检验，无黄色出现），无 硫酸根离子（1%氯化钡检验，无白色沉淀）。
方法步骤
（3）浓缩：

经透析的蛋白质溶液，如果浓度太稀，可在透析
袋中用冷风（10 ℃以下）吹，或包埋于脱水剂
（变色硅胶、聚乙二醇、蔗糖等）中浓缩。
方法步骤
（4）测定：

提取的蛋白溶液用生理盐水稀释后，用紫外分光光 度计测定其280nm和260nm时的光密度。按下列 公式计算蛋白质浓度。

溶解，搅拌下逐滴加入5 ml饱和硫酸铵，室温
10min或更长（4℃静置3h或过夜，充分沉淀）。离
心，取沉淀。重复沉淀三次可提高分离物纯度。
方法步骤
（2）脱盐：用透析法（或用凝胶过滤法）

用少量生理盐水将沉淀溶解，用毛细滴管将其移 入透析袋中，两端扎紧，将透析袋浸没于大烧杯 中，先对蒸馏水透析12小时，换液两次，再对生 理盐水透析，换液三次以上，直至透析液中无

由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结
合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它
们分开。

在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：
球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为球蛋
白和球蛋白，最后为白蛋白。
亲和层析法

由于抗原和抗体可发生特异性的可逆结合，先将
抗原或抗体等偶联到某种固wenku.baidu.com载体上装柱，再加 入分离样品进行层析。样品中的特异性抗体或抗 原被吸附，其它成分则从层析柱下端流出。再用 洗脱剂将吸附在柱上的抗体或抗原解离洗脱下来， 即可得到纯化的抗原或抗体。
带负电荷的蛋白质 （悬浮）

用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度 高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。 用33.3%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获 得较纯的IgG，但会损失一部分-球蛋白。 用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但-球蛋白 也会同时沉淀。



如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用 50%的饱和硫酸铵。