大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析学士学位论文

张文杰指导教师章元明教授专业名称作物遗传育种研究方向大豆耐逆遗传与生物统计答辩日期2012年6月Evaluation and association mapping for soybean salt- alkaline tolerance at seeding stageByZhang WenjieThe Thesis Submitted toNanjing Agricultural UniversityNanjing P.R.ChinaIn Partial Fulfillment of the RequirementsforThe Master DegreeSupervisedByProf. Zhang Yuan-MingCompleted in June 2012原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。

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对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

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学位论文作者(需亲笔)签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。

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(请在以上方框内打“√”)学位论文作者(需亲笔)签名：年月日导师(需亲笔)签名：年月日目录目录摘要 (I)ABSTRACT (III)符号说明(英文缩略词) (V)第一章文献综述 (1)1. 盐碱胁迫对大豆生长的影响 (1)1.1盐胁迫对大豆生长发育的影响 (1)1.2碱胁迫对大豆生长发育的影响 (1)2大豆耐盐、碱性鉴定及大豆种质资源耐盐、碱性评价 (2)2.1大豆耐盐碱性鉴定 (2)2.1.1耐盐碱的鉴定方法 (2)2.1.1.1田间鉴定 (2)2.1.1.2室内鉴定 (2)2.1.2大豆盐害鉴定指标 (3)2.1.2.1相对盐害指数法 (3)2.1.2.2形态伤害评价法 (3)2.1.2.3综合指数法 (4)2.1.2.4测定钠离子、氯离子浓度法 (4)2.2大豆种质资源耐盐碱性评价 (5)3大豆耐盐性遗传、QTL定位和耐盐机理研究进展 (5)3.1经典遗传学研究 (5)3.1.1单基因控制 (5)3.1.2多基因控制 (6)3.2大豆耐盐碱QTL定位的研究进展 (6)3.2.1大豆耐盐性QTL定位研究进展 (7)3.2.2 大豆耐碱性QTL定位研究进展 (8)3.3大豆耐盐机理研究进展 (9)3.3.1 盐胁迫下盐离子的吸收、外排和转运 (9)3.3.2渗透调节机制 (9)3.3.3 野生大豆的耐盐机理 (10)4 关联分析的研究进展 (10)4.1关联分析的原理 (10)4.1.1 连锁不平衡 (11)4.1.2 连锁不平衡的度量 (11)- I -大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析4.1.3影响连锁不平衡的因素及LD衰减 (12)4.2关联分析特点 (13)4.3关联分析的方法、步骤与注意事项 (13)4.3.1关联分析的方法 (13)4.3.2关联分析的步骤 (15)4.3.3关联分析需注意的问题 (16)4.4关联分析在大豆中的应用 (17)5 本研究的目的与研究内容 (18)第二章试验材料与分析方法 (21)1 材料与方法 (21)1.1实验材料 (21)1.2大豆幼苗期耐盐碱相关性状考察 (21)1.3SSR全基因组扫描 (21)1.3.1实验仪器 (21)1.3.2 DNA提取 (21)1.3.2.1试剂配制 (21)1.3.2.2 DNA提取步骤 (22)1.3.3 PCR扩增 (22)1.3.4 凝胶电泳检测 (23)1.3.4.1试剂配制 (23)1.3.4.2 凝胶电泳 (24)2 数据的分析方法 (25)2.1表型数据分析 (25)2.2连锁不平衡分析 (25)2.3群体结构分析 (26)2.4关联分析 (26)第三章结果与分析 (29)1大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征、方差及相关分析 (29)1.1大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征分析 (29)1.2方差分析 (31)1.3相关和偏相关分析 (33)1.4连锁不平衡分析 (33)2 大豆幼苗期耐盐碱性鉴定 (35)3、盐碱指数的定位结果 (38)3.1主根长耐盐、碱指数结果 (38)3.2根鲜重耐盐、碱指数结果 (38)目录3.3根干重耐盐、碱指数结果 (39)3.4下胚轴长耐盐、碱指数结果 (39)3.5幼苗生物量耐盐、碱指数结果 (43)4原始表型性状的定位结果 (43)4.1主根长定位结果 (44)4.2下胚轴长定位结果 (44)4.3根干重定位结果 (45)4.4根鲜重定位结果 (48)4.5优异等位基因的挖掘 (48)第四章讨论 (51)1.与前人耐盐、碱性QTL定位结果的比较 (51)2.相关分析与QTL成簇现象 (52)3.与拟南芥耐盐、碱基因的比较 (54)4.与现有大豆耐盐、碱基因的比较 (55)5.指数与原始性状定位结果的比较 (58)6方法间的比较 (63)第五章全文结论及创新点 (65)1全文结论 (65)2 创新点 (66)参考文献 (67)附表 (79)致谢 (81)攻读硕士期间发表的学术论文 (82)- III -- I -摘要大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析摘要土壤盐碱化是世界范围内影响农作物生产的主要非生物胁迫因子，同时也是降低作物产量的主要因子。

全世界大概有20%的农业灌溉用地受到盐碱的影响。

近年来，由于不合理农业灌溉进一步加重了耕地盐碱化。

为保持大豆在盐碱化土壤环境的持续生产，培育新品种是一种有效途径。

然而，其先决条件是解析大豆耐盐碱性的遗传机制。

大豆耐盐碱性遗传研究主要是利用双亲分离群体，其结果对作物育种贡献有限。

为克服这一缺陷，利用品种资源群体进行关联分析是一种有效的方式。

为此，本研究以分层随机抽样方法抽取的257份大豆品种为研究材料，在大豆幼苗期分别以浓度为100 mM的NaCl溶液和10 mM的Na2CO3溶液作为盐、碱处理液，以蒸馏水处理作为对照，大豆幼苗期主根长、下胚轴长、根鲜重、根干重和幼苗生物量的表型值以及各性状的耐盐、碱指数为指标，鉴定各大豆品种的耐盐碱性；利用135个SSR标记扫描该品种群体获得分子标记数据，通过上位性关联分析方法（EAM）和两种改进的压缩混合线性模型方法（ECMLMA和ECMLM）进行大豆耐盐碱性的关联分析；利用关联分析结果，发掘优异等位基因与载体品种，并实施设计育种。

其主要结果如下：1、以大豆幼苗期根鲜重耐盐和耐碱指数为指标，鉴定出两年表现基本一致、重复性好的耐盐品种2个：枫紫田岸豆和白秋1号；鉴定出耐碱品种8个：临安八月白、嵊县田埂豆、遵义棕子豆、北川乌眼窝、枫紫田岸豆、广西大粒豆、合豆6号和冀豆13。

枫紫田岸豆既耐盐又耐碱。

2、以耐盐碱指数为指标，通过ECMLM方法检测到129个QTLs，其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有35、24、19、33和18个；通过EAM 方法共检测到154个QTLs，其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有28、31、22、33和40个。

两种方法共同检测到30个QTLs，以QTL×环境互作为主，贡献率为0.68%-9.38%。

以原始观测值为指标，通过ECMLMA、ECMLM和EAM方法共同检测到20个QTLs，其中主根长、下胚轴长、根干重和根鲜重分别有6、10、1和3个。

上述两种结果间既有相同的QTL，又有一定的互补性。

本研究获得的大豆耐盐碱性部分关联标记与拟南芥耐盐基因的大豆同源基因连- I -大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析锁，例如satt453、satt656、satt411、satt687、satt256、satt413、sat_153、satt672和satt102。

3、利用关联分析结果，估计各QTL的等位基因效应，挖掘优异等位基因与载体品种，例如，主根长耐盐与耐碱指数减效最大的等位变异分别为353 bp（sat_256）和401 bp（sat_344），其载体品种分别为德兴老鼠牙和徐豆10号。

发现白秋1号和北川乌眼窝均携带耐盐、耐碱的优异等位变异，具有育种利用价值。

关键词：大豆；耐盐碱性；抗性鉴定；关联分析;优异等位基因ABSTRACTEV ALUATION AND ASSOCIATION MAPPING FOR SOYBEAN SALT-ALKALINE TOLERANCE AT SEEDING STAGEABSTRACTSoil salinization is an important abiotic stress for crop production worldwide, and seriously reduced crop yield as well. About 20% of the agricultural irrigation land was affected by salt and alkaline. In recent years, soil salinization is more and more serious owing to unsuitable irrigation. To maintain a sustainable production of soybean in a salt stress environment, developing alkaline-salt tolerant cultivars is an efficient way. However, the prerequisite for the breeding is to elucidate genetic mechanism of the tolerance.Previous studies on soybean alkaline-salt tolerance focus on bi-parental segregation populations, and its results have a limited role in crop breeding. To overcome the shortcoming, an alternative approach is to conduct genome-wide association studies (GWAS) in in soybean cultivar resource. In this study, therefore, 257 soybean cultivars randomly selected from China, along with 135 SSR marker information, were used to carry out GWAS for the tolerance using enriched compression mixed linear model (ECMLM) and epistatic association mapping (EAM) approaches. Evaluation of soybean alkaline-salt tolerance was carried out based on length of main root (LR), fresh and dry weights of roots (FWR and DWR), biomass of seedlings (BS) and length of hypocotyls (LH) for healthy seedlings after treatments with control, 100 mM NaCl and 10 mM Na2CO3 for about one week under greenhouse conditions. Using results from GWAS, genetic effects of all the alleles for each locus were estimated so that elite allele and its cultivar could be found and breeding by design could be performed. The main results were asd follows.First, using FWR index at seedling stage, two cultivars (Zifengtian’andou and BaiqiuNo.1) have a stable saline tolerant performance, and eight cultivars (Lin’anbayuebai, Shengxiantian gengdou, Zunyizongzidou, Beichuanwuyanwo, Zifengtian’andou, Guangxi- dalidou, Hedou No.6 and Jidou No.13) have a stable alkaline tolerant performance in 2009 and 2010. Note that Zifengtian’andou has the above two performances simultaneously.Second, with alkaline-salt tolerant indices, a total of 129 main-effect QTL: 35 for LR, 24 for FWR, 19 for DWR, 33 for LH and 18 for BS, were detected by the ECMLM method, whereas a total of 154 QTL: 19 for LR, 27 for FWR, 18 for DWR, 26 for LH and 32 for BS, were identified by the EAM. It should be noted that there are 30 common QTL with the- III -大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析heritabilities of 0.68%-9.38%, which are mainly QTL-by-environment interaction. With original observations for the alkaline-salt tolerance, 20 common QTL: 6 for LR, 10 for LH, 1 for DWR and 3 for FWR, were identified by ECMLMA, ECMLM and EAM approaches. Some same QTL were observed between the above two kinds of results.More importantly, some alkaline-salt tolerance genes in Arabidopsis thaliana and soybean are found to be around the tolerance-associated markers in this study, i.e., satt453, of satt656, satt411, satt687 satt256, satt413 sat_153, satt672, and satt102.Finally, the above results from GWAS were used to estimate allelic effects so that novel allele and its cultivar could be mined, for example, elite alleles for LR alkaline-salt tolerance indices were 353 bp (sat_256) and 401 bp (sat_344) and their corresponding cultivars were Dexinlaoshuya and Xudou No. 10. Note that BaiqiuNo.1 and Beichuanwuyanwo have the tolerance to salt and alkaline stresses simultaneously, which are of use in soybean breeding.KEY WORDS：soybean; tolerance to alkaline-salt stresses; resistance measurement; genome-wide association study; novel allele符号说明（英文缩略词）- V -符号说明(英文缩略词)缩写英文名称 中文名称 CTABCetyltrimethyl Ammonium Bromide 溴代十六烷基三甲胺 EDTAEthylene Diamine Tetra-acetic Acid 乙二胺四乙酸 PVPPolyvinyl Pyrrolidone 聚乙烯吡咯烷酮 TrisTris(Hydroxymethyl) Aminomethane 三(羟甲基)氨基甲烷 DNADeoxyribo Nucleic Acid 脱氧核糖核酸 AcrAcrylamide 丙烯酰胺 BisBis-Acrylamide 甲叉双丙烯酰胺 APAmmonium Persulfate 过硫酸铵 TEMEDN ，N ，N ，N-tetramethylethlenediamine N ，N ，N ，N-四甲基乙二胺 MASMolecular Marker-assisted Selection 分子标记辅助选择 PCRPolymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应 SSRSimple Sequence Repeats 简单序列重复 SNPSingle Nucleotide Polymorphism 单核苷酸多态性 AFLPAmplified Fragment Length Polymorphism 扩增片断长度多态性 RAPDRandom Amplified Polymorphic DNA 随机扩增多态性DNA RFLPRestriction Fragment Length Polymorphism 限制性片段长度多态性 ESTExpressed Sequence Tags 表达序列标签 QTLQuantitative Trait Locus 数量性状基因座 LDLinkage Disequilibrium 连锁不平衡 GW ASGenome-wide Association Study 全基因组关联分析 GLMGeneral Linear Model 一般线性模型 MLMMixed Linear Model 混合线性模型 NAMNested Association Mapping 巢式关联作图 cMLMCompressed Mixed Linear Model 压缩的混合线性模型 EAMEpistatic Association Mapping 上位性关联分析 ECMLMEnriched Compressed Mixed Linear Model 改进的压缩混合线性模型 ECMLMA Enriched Compressed Mixed Linear ModelAdvanced 改进的压缩混合线性模型的提高第一部分文献综述第一章文献综述1.盐碱胁迫对大豆生长的影响盐胁迫对植物生长的影响主要分为两个阶段。