L_苹果酸代谢流分析及高产菌株构建

Metabolic Analysis of L-Malic Acid and Confirmation of A Strain Huang Yan-hong, Tian Yan-jun, Hao Xi-xiang, Zhao Xiang-ying, Liu Jian-jun, Zhang Jia-xiang, Han Yan-lei （1. Life Science College of Shandong Teacher’s University Jinan 250014；2. Food Science & Engineering College of Shandong Agriculture University Tai’an 271018；3. Laboratory of Shandong Food & Fermentation Engineering） Abstract：Malic acid is a C4-dicarboxylic acid and an intermediate of tricarboxylic acid（TCA）cycle.It has been widely used in the polymer，food and pharmaceutical industries.Metabolic flux analysis was performed to find a strategy for enhanced malic acid production in Aspergillus flavus.Microbial metabolic pathways in mainstream approach were studied through high molecular biology technology.Aflatoxin strains of industrial production is provide for malic acid effective way. Key words：Malic acid；Aspergillus flavus；Metabolic Flux Analysis；Fermentation
（1）在糖质原料培养基中，必需有CaCO3 才能使L-苹果酸有效地积累起来。早在1925年， Kostychev等［16］利用酵母发酵蔗糖时，发现只有 在CaCO3存在的条件下，才能测出L-苹果酸的存 在。 后人的许多实验均证实了这一点［17-18］。
（2）把H14CO3-加入或把14CO2通入培养 基中，发酵后14C主要集中于L-苹果酸及L-天 门冬氢酸中。1973年，Elhissy等［19］发现赭曲 霉（Aspergillus ochraceus）及黑色葡萄状穗霉 （Spachybotrys astra）的菌丝吸收H14CO3-后，14C 主要进入L-苹果酸及L-天门冬氨酸中。
济型，需要实现目标产物高产量、高产率和高生 产强度的有机统一，需要通过传统诱变、代谢工 程等手段认识从自然界中筛选得到的微生物代谢 特性。而对微生物代谢特性的认识不足，又进一 步妨碍了对其代谢能力的改造及工业应用。实际 上，对微生物代谢过程的理解、开发和利用是否 能达到或者超过化学加工水平，是提高发酵过程 经济性的关键。基因工程技术的进步，为菌株改 良和生理学特性的认识提供了比传统诱变技术更 为合理的手段，即能够利用重组DNA技术引入定 向基因变化。1991年，Bailey把这一门新的学科 称为代谢工程，并将其定义为“采用DNA重组技 术，对细胞的酶反应、物质运输以及调节功能加 以改进以达到提高、改善细胞活性的目的”。以 糖质原料为底物生产重要发酵产品时，代谢工程 研究者所采取的主要手段是：（1）阻断目标代谢 产物的降解途径；（2）强化目标代谢产物的生物 合成途径；（3）解除生物合成途径的代谢调节。 这些手段在提高目标代谢产物的产量、产率和生 产强度方面已被证实是非常有效的。当前，以源
2009.3(总第154期）
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L-苹果酸代谢流分析及高产菌株构建
黄艳红1 田延军3 郝夕祥2 赵祥颖3 刘建军1，2，3 张家祥3 韩延磊3
（1. 山东师范大学生命科学学院 济南 250014）1 （2. 山东农业大学食品科学与工程学院 泰安 271018）2 （3. 山东省食品发酵工程重点实验室 济南 250013）3
（3）生物素、丙酮酸及磷酸烯醇丙酮酸对L苹果酸的合成具有促进作用［20］。
周小燕等 研 ［21］ 究表明，曲霉胞质中丙酮酸 羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮 酸羧化激酶三种羧化酶的活性与胞质蛋白量和苹 果酸产生速率之间都存在很好的正相关关系，尤 其是丙酮酸羧化酶，伴随着胞质蛋白量波动14.5 倍，苹果酸产生速率波动5.6倍，丙酮酸羧化酶酶 活力波动13倍。表明胞质中羧化酶类合成的增多 或减少是其酶活力增强或减弱的重要原因，从而 引起苹果酸生成速度加快或减慢，胞质中羧化酶 蛋白分子的合成是产生苹果酸的重要机制。
从酶和分子水平的调节深入进行探讨，不但 有助于发酵苹果酸工艺水平的提高，而且由于CO2 固定反应是TCA 循环的C4 羧酸的重要补充回路， 深入了解其中酶反应的本质对柠檬酸发酵、谷氨 酸发酵以及天冬氨酸族的氨基酸发酵（包括天冬 氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、高丝氨酸等） 都会具有 一定的促进作用。
2 代谢流分析 为了提高基于生物炼制的工业生物过程的经
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几十年来，人们对L-苹果酸在微生物 中的代谢途径进行了研究，尤其对裂褶菌 （Schizophyllum commune）代谢途径的研究比较 深入。Scrutton［13-14］等从丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）在细胞中的定位进行研究，发 现与大多数真核生物不同，构巢曲霉（Aspergill us ni dulans）和少根根霉（Rhizopus arrhiz us）的 PC 主要存在于胞质中，并提出这种胞质中的CO2 固定反应是有机酸积累的机制［15］。目前从事这 方面工作的研究者大都认为CO2固定反应是L-苹果 酸生成及积累的重要过程，其证据有3个：
法也可用于苹果酸生产[4]。但这些生产方法均需 要很高的成本。用曲霉属和裂褶菌属发酵生产苹 果酸产量也很低，仅为0.1-0.6g/L/h。因此，发展 更有效的苹果酸生产系统是苹果酸生产工艺必须 的。代谢工程[5-6]可以重新构建代谢网络，提高产 物产量。
1 L-苹果酸在微生物中的代谢途径 L-苹果酸在生物体内的合成途径如图1所示，
+ADP+pi 1.2 通过磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的作用
酶
磷酸烯醇式丙酮酸+CO2+百度文库DP→草酰乙酸
+GTP 1.3 通过苹果酸酶的作用
酶
丙酮酸+CO2+NADP+H+→苹果酸+NADP+
三羧酸循环
苹果酸→草酰乙酸 1.4 通过乙醛酸途径
合成
2分子乙酰辅酶A→1分子琥珀酸 琥珀酸 三羧酸循环 草酰乙酸 1.5 氨基酸途径 天冬氨酸和谷氨酸的转氨作用可形成草酰乙 酸和α-酮戊二酸。异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨 酸、缬氨酸也会形成琥珀酰辅酶A，此物进入三羧 酸循环后，进一步形成草酰乙酸。 深入的研究发现有三种途径完成CO2 固定［12］： （1）由磷酸烯醇丙酮酸（PEP）羧化（激） 酶（或称草酰乙酸激酶）催化，使PEP 加CO2生成 草酰乙酸再还原为L-苹果酸； （2）由丙酮酸羧化酶催化丙酮酸（PYA）加 CO2生成草酰乙酸再还原为L-苹果酸；以上两个反 应均需核酸三磷酸作辅酶； （3）由苹果酸酶催化，进行还原羧化作用生成 L-苹果酸，在这里参与反应的辅酶是NAD（P）。 L-苹果酸在微生物中的代谢途径 （C3+C1=C4）与植物光合作用中的C4途径相似。 许多实验说明给正在培养中的微生物一定的光 照及O2等条件，同样能促进L-苹果酸的合成及积 累。此外，可溶性的无机磷，合适的碳、氮源和 某些金属离子等均有利于L-苹果酸的合成。
丙酮酸羧化酶广泛存在于动物、霉菌和酵母 中，但在植物体和大部分细菌中却不含此酶。在 三羧酸循环中，它是供给草酰乙酸的主要补充反 应。丙酮酸羧化酶属于一类以生物素为辅酶的酶 家族，研究表明，不同种属来源的PC酶蛋白中， 存在着高度保守的区域。在序列的N端，有一段
共同的序列：GGGGRG，这在所有的生物素酶类 中都存在（R可为K），被认为是ATP 的结合位点 ［22-23］。在序列的中部，有另一个关键的区域： FLFEDPWDR，Kumer 等人认为［24］，这中间的 色氨酸残基（W）参与了转羧基反应中的丙酮酸 结合过程。在序列的C 端，有一个非常保守的部 位：AMKM，被认为是生物素的结合位点［25］， 已经证实其中的赖氨酸残基（K）与生物素特异共 价结合；C端另外三个特定位置的甘氨酸残基也参 与了生物素的结合［26］。
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于生物资源经工业发酵生产重要基础化工原料的 生物炼制成为备受关注的亮点。对发酵工程研究 人员来说，应当在认识微生物代谢调控机理的基 础上，通过定向改变和优化微生物细胞的生理功 能以提高目标代谢产物的生产效率。
图2 丙酮酸进入线粒体的途径
一旦草酰乙酸浓度下降，势必影响三羧酸循 环的进行。因此这些中间产物必须不断地得到补 充，才能维持三羧酸循环的正常进行。但草酰乙 酸是怎样得到补充的呢？可能有如下的5条途径 ： ［10-11］ 1.1 通过丙酮酸羧化酶的作用
酶
丙酮酸+ATP+CO2+H2O <——> 草酰乙酸
有三条合成途径［7］：一是丙酮酸羧化或磷酸烯醇 式丙酮酸羧化，此涉及到CO2的固定；二是支路乙 醛酸循环；三是延胡索酸由延胡索酸酶转化生成 苹果酸。
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图1 苹果酸在生物体内的合成途径
糖质发酵产生苹果酸在细胞内是如何进行的 呢？糖酵解的产物丙酮酸是三羧酸循环的底物。但 糖酵解发生在细胞质基质中，三羧酸循环发生在线 粒体中，丙酮酸脱氢酶系也位于线粒体内，因此丙 酮 酸 必 须 进 入 线 粒体。那么丙 酮 酸 是如 何进 入 线 粒体 的 如图 2［8］所 示，在 细 胞 质 基 质中，由糖 酵 解 产生的丙 酮 酸，经 线 粒体内膜 上的丙 酮 酸 传 递 体 与OH－ 进行电中性的交换，进入线粒体基质。也有 可能在酵解中形成的磷酸烯醇式丙酮酸不进一步 形成 丙 酮 酸 ，而是 在 磷 酸 烯 醇 式丙 酮 酸 羧 化 酶 的 催化下形成草酰乙酸，草酰乙酸再 被还原为苹果 酸，细 胞 质基 质中的 苹果 酸 经内膜 上二 羧 酸 传 递 体 与 P i 2 -进 行电中性的交 换，进 入 线 粒体 基 质。线 粒体基质中苹果酸或直接进入TCA 循环，或在苹 果 酸 酶 的 作用 下脱 羧 形成丙 酮 酸，再进 入 三 羧 酸 循环。苹果酸比丙酮酸更容易进入线粒体［9］。
摘 要 苹果酸是一种C4二羧酸，三羧酸循环中间代谢产物。它已经被广泛地应用于聚合物、食品、医药工业等行业。为 提高黄曲霉苹果酸产量，应用代谢流通量进行分析，找到微生物代谢途径中主流途径，通过分子生物学技术构建黄曲霉 高产菌株，为苹果酸的工业生产提供有效途径。 关键词 苹果酸 黄曲霉 代谢流分析 发酵
苹果酸又名2－羟基丁二酸，由于分子中有 一个不对称碳原子，有两种立体异构体。大自然 中，以三种形式存在，即D-苹果酸、L-苹果酸和 其混合物DL-苹果酸。L-苹果酸是生物体代谢过 程中所产生的重要有机酸。在微生物中，它的产 生与多条重要的代谢途径有关，出现于三羧酸循 环（TCA）及其支路乙醛酸循环中，也是CO2 固 定反应的产物。工业上，苹果酸被用于食品添加 剂及化学化工药品合成材料。苹果酸的生产方法 有很多种，如直接提取法、酶转化法、化学合成 法[1-3]。从果实中直接提取苹果酸是传统的生产 方法，但因为产量低而无法应用于实际生产。也 可用顺丁烯二酸或富马酸合成，延胡索酸酶转化