微生物实验操作

油镜的使用和维护

目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯

原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。

步骤：显微镜油镜的使用和维护

1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。

2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。

3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。

4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。

5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸

擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。

6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。

革兰染色

目的：掌握革兰染色的原理及操作。

材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液

原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。

步骤：

1. 细菌标本的制作

（1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。

（2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。

（3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是

杀死细菌，使细菌与玻片黏附较牢固。菌体蛋白质变性后，提高与染料的亲和力。

2. 革兰染色

（1）初染：滴加结晶紫染液1-2滴于涂片上，1min 钟后用自来水缓缓冲洗。

（2）媒染：滴加碘液1-2滴，1min后用自来水缓缓冲洗。

（3）脱色：加95%酒精数滴，摆动玻片使酒精与细菌充分接触，约20-30s后，立即用自来水缓缓冲洗。（4）复染：滴加稀释碳酸品红液，30-60s后，自来水缓缓冲洗。

用吸水纸吸干后，用油镜观察。镜检后，载片放入消毒缸。

细菌特殊结构的观察

目的：观察并掌握细菌的形态及特殊结构。

材料：细菌鞭毛、芽孢、荚膜的标本片；革兰阳性菌、革兰阴性菌染色标本片

示教：

革兰阳性菌：葡萄球菌，紫色

革兰阴性菌：大肠杆菌，红色

细菌鞭毛

细菌芽孢

细菌荚膜

细菌的分布

目的：了解细菌在自然界中的分布情况。

材料：普通琼脂平板培养基、血平板、镊子、无菌棉拭子、革兰染液。

操作步骤：

1.空气中细菌的检查

（1）采用沉降法：取普通琼脂平板培养基1只，任意置一处，启盖约15分钟，再盖上，37oC培养24小时，观察有无细菌生长。

（2）结果判定：培养基表面可见多种大小、形态不一的菌落。

2. 皮肤表面细茵检查

(1)采用涂抹法: 先在平板底面用记号笔分成两区，作标记，将未消毒的手指在平板的1／2处表面轻轻涂抹划线，然后用碘酒、乙醇擦拭手指皮肤，用消毒后的手指在平板另一1／2处进行涂抹，操作完毕，置37℃培养24小时后，取出观察结果。

(2)结果判定：培养基表面有几种大小及形态不同的菌落生长，注意比较消毒前后细菌的生长情况。

3.咽喉部细茵检查

(1)用无菌棉拭子在咽喉部涂抹后，涂在血平板上，并划线分离，37oC培养24小时后观察结果。注意观察平板上菌落种类以及是否有溶血现象，并可挑取菌落进行革兰染色检查。口腔微生物检查也可用无菌牙签直接挑取少量牙垢，制成涂片，进行革兰染色检查。

(2)结果判定：血平板表面有大小和形态不同的菌落，有的菌落周围可见溶血环。牙垢涂片镜检可见革兰阳性菌和革兰阴性菌。

紫外线杀菌实验

目的：掌握紫外线杀菌的原理，熟悉紫外线杀菌实验的操作。材料：大肠杆菌，琼脂平板，无菌回形状纸片，接种环，镊子，紫外灯.

原理：紫外线波长范围为240～280nm,最适的波长为260nm，这与DNA吸收光谱范围相一致。其杀菌原理是紫外线易被核蛋白吸收，使DNA的同一条螺旋体上相邻的碱基形成胸腺嘧啶二聚体，从而干拢DNA的复制，导致细菌死亡或变异。紫外线特点：紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃。

步骤：

1.平板密集划线接种。

2.在平板上贴无菌回形纸片。

3.UV照射30min（打开平板盖子）。

4.取出回形纸，将回形纸放入消毒缸中。

5.37oC培养24h后观察结果。

细菌代谢产物观察和生长现象

目的：掌握细菌代谢产物的检测和结果的判断。熟悉细菌在各种培养基中的生长现象。

材料：各种生化管，大肠杆菌、伤寒杆菌、产气杆菌、变形杆菌等。

原理：不同菌的酶系统不同，对底物的代谢产物也不同，用生化的实验方法可将产物检测出来，从而对细菌鉴定。

步骤：

一、细菌代谢产物观察

1. 糖发酵实验

将大肠杆菌、伤寒杆菌分别接种在葡萄糖发酵管内，37℃培养18-24h进行观察。培养基中指示剂为溴甲酚紫。

如能分解葡萄糖，则产酸，培养基由原来的紫色变为黄色，记录符合为“+”。如同时还产生气体，则其中