军团菌检验方法实施细则
军团菌 方案
军团菌方案一、背景介绍近年来，由于环境污染、气候变化等原因，菌群生态受到了严重破坏，导致部分微生物种群数量减少、生态系统受到了破坏。
在这一背景下，军团菌逐渐被人们所关注。
二、军团菌的特点军团菌是常见的一种细菌，根据鉴定这种菌的药物灵敏度可以划分为多个亚种。
军团菌的传播方式主要有两种：空气传播和水传播。
军团菌是一种比较容易感染人体的病菌，易引起肺炎、肺泡炎及其他呼吸系统疾病。
三、军团菌方案为了更好地治疗军团菌感染，保障人类健康，需要制定出一套完整的方案。
该方案应包括以下内容：1.军团菌检测方案：建立一套完整的军团菌检测标准，开发出高准确性的检测方法。
对受感染的病人进行及时检测，及时发现和诊治感染病例。
2.军团菌传播治疗方案：针对军团菌主要通过空气和水途径传播的特点，通过加强环境卫生管理措施，消除潜在传播源，保障人们生活环境的清洁。
加强饮用水源的流程控制，完善冷热水系统设计，消除水垢，防止水垢及其他抵御肥皂和其他清洗剂的物质的生长，从而保障饮用水的安全性。
3.军团菌药物治疗方案：在药物治疗方面，应准确判断军团菌的亚种，并给予对应的治疗药物。
同时应充分利用中药药方、喷雾和吸入治疗等手段，提高治疗效果及患者治愈率。
对于治疗较困难的病例，可以考虑行支气管肺泡灌洗术等手段辅助治疗。
四、方案实施措施为了更好地实施军团菌治疗方案，需要采取一系列的措施。
包括：1.加强科技支持，建立一套完整的军团菌检测标准和检测方法；2.加强环境卫生管理，消除军团菌的传播源；3.加强医疗卫生服务，提高医护人员的诊疗技能及对军团菌的认识；4.强化公共宣传和教育，提高公众对军团菌的认知及防范意识。
五、方案效果评估方案实施后，需要对方案的效果进行评估。
主要包括以下几个方面：1.军团菌感染发病率的下降情况；2.军团菌的检测准确率提高情况；3.基础设施改善，环境清洁程度提高情况；4.军团菌感染治愈率的提高情况；5.公众对军团菌的认知水平提升情况。
冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法
冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。
A1原理待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。
将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。
A2 主要仪器设备A2.1 平皿：90mmA2.2 培养箱：35~37℃A2.3 紫外灯：波长360±2nmA2.4 滤膜滤器A2.5 滤膜：孔径0.22～0.45µmA2.6 蠕动泵A2.7 离心机A2.8 涡旋振荡器A2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜A2.10 水浴箱A3 采样A3.1 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。
A3.2 采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约200ml。
A3.3 中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。
A3.4 样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。
A4 方法与步骤A4.1 样品处理A4.1.1 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。
A4.1.2 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。
A4.1.3 热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。
A4.1.4 酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。
A4.2 接种与培养：取A4.1.2洗脱样品、A4.1.3 热处理样品及A4.1.4 酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。
将接种平板静置于CO2培养箱中，温度为35~37℃，CO2浓度为2.5%。
军团菌病应急处置程序参考方案
军团菌病应急处置技术方案1 总则1.1 背景军团菌病（Legionnaires's disease）是由军团病杆菌引起的以肺部感染为主，可合并肺外多个系统损害的一种呼吸道传染病。
受感染的人和动物排出的军团杆菌污染环境、土壤和水源,成为本病的传染源,其中军团菌污染的各种水源为主要传染源。
传染的主要途径是:经呼吸道传染，含军团杆菌的气溶胶通过空气由人直接吸入肺泡（空气传播），气溶胶是军团菌传播、传染的重要载体, 军团菌的另一个传播载体是原虫，它可在阿米巴原虫细胞内寄生、繁殖。
各年龄段的人群普遍易感, 特别是患有慢性病的或有免疫功能低下的,以及长期吸烟者都是易感人群。
军团菌病全年均可发生,而以6至10月份发病最多。
流行主要因素：水温适当，静止的水源如大容积贮水器，空气水混合部分的水龙头及淋浴喷头处，温水游泳池，空调冷疑水，超声湿润器，呼吸医疗器械等，尤其空调的冷疑水中本菌的检出率最高, 空调系统的带菌是本病流行的主要原因。
该病首发于1976年美国的一次退伍军人聚会。
此后，欧洲、澳洲等不同国家和地区相继发现军团菌病例。
目前，多个国家已将军团菌肺炎为法定传染病，WHO也将其列入传染病报告范围。
全球每年都有数起军团菌病暴发流行，其发病率约为12/10万，病死率约为20%。
我国于1982年发现首例病人以来，在北京、天津、福建、、四川、广东、山东、哈尔滨、山西、河北、辽宁、新疆、上海等地都有病例发生的报告。
作为全球国际化休闲城，目前，随着百姓生活水平的逐步提高，城中高层建筑的日益增多，空调广泛使用，热水管、喷水池、淋浴及加湿器等设备的普及，这些都有可能增加军团菌病的危险性。
因而，军团菌病已作为一种“现代生活文明病”在不断威胁着人们的健康。
1.2 编制目的通过实施本技术方案，构建预防为主、防治结合的军团菌病的应急处理机制，提高快速反应和应急处理能力，做到“早发现、早报告、早采样、早隔离、早治疗”，有效地控制疫情蔓延扩散，保障人民群众的身体健康和生命安全，确保社会稳定和经济发展。
军团菌诊断血清明书
军团菌诊断血清使用方法
经初步生化检查，疑似军团菌菌株时，应将可疑菌落制备成检测抗原，先用多价血清做玻片凝集实验，阳性反应时，再与相应的单价血清做玻片凝集实验，做出诊断。
具体方法如下：
1.产品在使用前最好恢复温度到室温。
2.将可疑菌落转接到BCYE平板中培养，在洁净玻片上用接种环滴加两滴彼此分离的生理盐水。
3.用接种环挑取一环用BCYE生长平板中培养2~3天的可疑菌落，分别与玻片上的生理盐水混匀。
4.用接种环滴加1~2滴血清于玻片上一个菌落与生理盐水的混合液中，另一个菌落与生理盐水的混合液中加入一滴生理盐水作为对照。
5.用接种环分别混匀玻片上的两种混合液。
6.凝集结果判断结果如下：
反应强度判断依据
4+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较大
3+ 反应澄清透明，凝集颗粒较多、较小
2+ 反应有些混浊，但仍可见较多颗粒状凝集1+ 反应非常混浊，只有少许颗粒状凝集
- 反应完全混浊，未出现任何凝集。
军团菌检测
军团菌检测方法一、军团菌简介军团菌是一种环境感染性致病菌，可引起急性呼吸道传染病，即军团菌病。
军团菌分布极其广泛，医院、酒店等的供水系统、空调的冷却系统等各种水源均易于滋生、污染军团菌，并造成军团菌病传染的风险。
即与水有关的地方均可能存在军团菌。
军团菌传播、感染有以下特点：1、透过空气、水份感染，传播带季节性，超过50％病例在夏季发生。
2、滋生在医院、酒店的供水系统，通过过水龙头、浴室传播。
3、可通过空调的冷却系统，由通风口传播并感染对象。
军团菌属革兰氏阴性杆菌，专性需氧，无芽孢，无荚膜，军团菌需要半胱氨酸和铁，无半胱氨酸时，军团菌无法生长。
生化特征还有不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐，氧化酶实验阴性或弱阳性，尿素酶阴性，军团菌生长的最适pH为6.9-7.0，2％－5％CO2能促进部分菌株的生长。
军团菌生长缓慢，易于被其它菌落覆盖。
军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色。
菌落整齐，表面光滑，在紫外灯下，有荧光。
军团菌属有41个种，61个血清型。
侵肺军团菌（Legionella pneumophila, LP）有15个血清型，是引起军团菌病的主要菌型（占80%以上）。
军团菌病是一种急性呼吸道传染病，临床类型目前至少有肺炎型与庞蒂阿克热型。
本病主要为呼吸道飞沫(气溶胶)传播。
目前尚无证据表明感染者、病人或感染动物作为本病的传染源，通常把传染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷却塔、冷热管道系统水等)作为传染源。
二、军团菌的检测方法——ISO11731:19981．范围本标准描述了一种用于军团菌分离和估计环境样品中军团菌数量的培养方法。
该方法适用于所有环境样本，包括饮用水、工业用水和天然水以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本。
2．培养基和试剂2.1 BCYE培养基(也可用硝酸铁琼脂代替)2.2 BCYE-Cys(不含L-半胱氨酸)2.3 GVPC培养基2.4酸处理缓冲液3．取样3.1取样容器水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。
关于军团菌
军团菌的历史一、1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病,经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌.随后,许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原.其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似,具有共同的生化特征,引起类似疾病.二、疾病的范围包括：(1)无症状血清变化；(2)自限性无肺炎的流感样病态,有时叫做庞提阿克热(Pontiac fever)；(3)军团人员病为最严重和最常见到的肺炎类型；(4)局限性,罕见的软组织感染.三、军团病占需住院治疗的社区获得性肺炎的1%~8%,占致死性医院内获得性肺炎的4%左右.大多数病例为散发性,多发生于夏末和秋初.人和人之间的传播尚未得到证实.当给水系统受到污染或形成气溶胶的病原体经空调系统冷凝器的蒸发气体,或污染的淋浴喷头传播时,嗜肺军团菌则暴发流行.军团病可发生于任何年龄,但大多数人都是中年男性.已确定的危险因素包括吸烟,滥用酒精和免疫抑制,特别是由皮质类固醇引起的免疫抑制.四、军团菌是隐藏在空调制冷装置中的致病菌，随冷风吹出浮游在空气中，吸入人体后会出现上呼吸道感染及发热的症状，严重者可导致呼吸衰竭和肾衰竭。
军团菌最早是由于部队室内密闭作业，导致群体发生上呼吸道感染而得名。
军团病是一种非常严重的、有时可以致命的肺炎。
军团病是由军团杆菌引起，这种细菌产生在自然环境中，在温水里及潮热的地方蔓延。
人工供水系统有时也能为军团杆菌的大量繁殖提供生存环境。
这些系统包括淋浴器、矿泉池、喷泉以及空调设备的冷却水塔。
人们通常是由于呼吸了被军团杆菌污染的水源散发的水雾而传染上军团病的。
据估计，在美国每年都有国每年都有8000~18000人感染上军团病。
军团菌的分离培养与鉴定福建省疾病预防控制中心
1990
Legionella gresilensis
2001
Legionella cherrii
1985
Legionella adelaidensis
1991
Legionella rowbothamii
2001
Legionella erythra
运输包装分类
学名
中文名
大量活菌操作
动物感染实验
样本 检测
非感染性材料实验
A/B
UN 编号
Legionella pneumophila
嗜肺军团菌
第三类
BSL-2
ABSL-2
BSL-2
BSL-1
B
UN 3373
样本的采集和运输
〔一〕标本的种类 〔二〕标本的运输和相关生物平安要求
标本的种类
环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中别离到军团菌。
样品浓缩
离心 过滤
接种
酸处理 热处理
水样的正压膜过滤法
安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。
水样的离心
将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶中； 6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在15～25℃之间； 无菌操作去除上清； 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。
标本的运输和相关生物平安要求
在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3℃)贮藏在实验室或其他地方。 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20℃冻存备用。
空调系统军团菌的检验分析方法
附件公共场所集中空调通风系统卫生规范1.总则为了预防公共场所集中空调通风系统（以下简称空调系统）传播传染病，保护人体健康，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《公共场所卫生管理条例》、《突发公共卫生事件应急条例》和《传染性非典型肺炎防治管理办法》，制定本规范。
本规范规定了公共场所空调系统的一般卫生要求、传染病流行期卫生要求、净化消毒装置卫生要求、卫生学评价和卫生管理要求。
2.适用范围本规范适用于公共场所使用的空调系统，其它场所空调系统可参照执行。
3.规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
GB/T 18883 室内空气质量标准GB 9663-9673 公共场所卫生标准GB/T 18204.1 公共场所空气微生物检验方法卫生部消毒技术规范4.术语与定义4.1 集中空调通风系统为使房间或封闭空间空气温度、湿度、洁净度和气流速度等参数达到给定的要求，而对空气进行处理、输送、分配，并控制其参数的所有设备、管道及附件、仪器仪表的总和。
4.2 空气传播性传染病以空气为主要传播途径的传染病。
4.3 空气净化采用某些技术或方法去除室内空气中的颗粒物、微生物和气态污染物。
4.4 可吸入颗粒物（PM10）能够进入人体呼吸道的空气动力学当量质量中位径为10微米的颗粒物。
5.空调系统的卫生要求5.1 一般要求5.1.1 空调系统新风量和运行参数应符合国家卫生标准和要求，新风采气口的设置应保证所吸入的空气为室外新鲜空气，新风采气口应远离建筑物排风口和开放式冷却水塔。
严禁间接从空调通风的机房、建筑物楼道及天棚吊顶内吸取新风。
5.1.2 空调系统的新风口和回风口应安装防鼠、防虫设施。
5.1.3 空调系统的过滤器（网）、表冷器、加热（湿）器、冷凝水盘应每年进行一次全面检查、清洗或更换。
军团菌细菌分离鉴定作业指导书
军团菌细菌分离鉴定作业指导书【方法】1、标本运送和保存：军团菌抵抗力较强，但仍需尽快送实验室，以防污染菌生长。
应避免反复冻融。
水样标本应尽可能快或最好2d内送到指定实验室，不必冷冻，但应避光和防止受热，室温下贮存不得超过15d。
收到水样后应尽快进行检测，尤其对于已知含有生物防腐剂的样品，最好采样当天检测。
2、形态观察革兰染色：幼龄菌为革兰阴性短小杆菌，培养数日后可见多形性和长丝状。
革兰染色还可见菌体有空泡。
鞭毛染色可见1—2根单鞭毛和侧鞭毛，无荚膜、无芽胞。
3、培养特性观察：将待检菌接种BCYE平板、F-G平板、血平板和巧克力（色）血平板上，须置37℃，2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养37天。
如果在48小时内出现菌落或在这些培养液上均生长，则不是军团菌，如果仅在BCYE或F-G平板上生长，另外两种平板上不生长，而且至少在72小时以后出现菌落，则可能是军团菌。
在BCYE平板上4—5天可形成针尖大小的菌落，继续培养数日后菌落直径可增大至4—5mm。
菌落灰白色、圆形、湿润、有光泽、边缘透明。
呈刻花玻璃样条纹为其特征。
菌落较为黏着，并有特有的酸臭味。
在紫外线可见表面呈现白色自发荧光。
在F-G平板上培养10天才见生长，并可产生棕色色素。
4、生化反应触酶、氧化酶、β-内酰胺酶及马尿酸水解实验均阳性，不分解糖类产酸、脲酶及硝酸盐还原实验阴性。
5、气相色谱显示军团菌的细胞脂肪酸组成，易与其他细菌区别。
6、血清学检查（1）微量凝集实验：首先将军团菌标准株接种于BCYE或其他专用培养液上，35℃2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养3—4天，用0.01mol/l、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔，沸水浴1小时杀菌。
2000rpm离心10分钟后弃去上清液。
用含0.5%福尔马林的磷酸盐缓冲液配成悬液，使其浓度在420nm波长，光径1cm时吸光度值为0.65，即为诊断菌液。
诊断菌液在用前加石炭酸复红液1ul。
军团菌诊断标准及处置
军团菌诊断标准及处置Legionella bacteria, commonly known as legionella or Legionnaire's disease, is a type of bacteria found in natural water sources such as lakes and streams. 军团菌，通常被称为军团菌或军团病，是一种在自然水源如湖泊和溪流中发现的细菌。
It can also be found in human-made water systems such as hot tubs, cooling towers, and plumbing systems. 它也可以在人造水系统如热水浴池，冷却塔和管道系统中发现。
The bacteria can cause a serious form of pneumonia called Legionnaires' disease, as well as a milder flu-like illness known as Pontiac fever. 这种细菌会引起一种严重的肺炎称为军团病，以及一种较轻的类似流感的疾病称为庞蒂亚克热。
Given the potential health risks associated with Legionella bacteria, it is important to have clear diagnostic standards and effective measures for dealing with outbreaks. 鉴于军团菌细菌可能带来的健康风险，有必要制定清晰的诊断标准和有效的处理措施。
Diagnostic standards for Legionella bacteria should include a combination of clinical evaluation, laboratory testing, and environmental assessment. 军团菌细菌的诊断标准应包括临床评估、实验室测试和环境评估的结合。
微生物检验实验室军团菌属检验标准操作规程
微生物检验实验室军团菌属检验标准操作规程1. 概述军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型痰等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE 上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
(完整版)军团菌及其检测方法
哪些环境中存在军团菌？
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
标本的种类
环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水；
病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。
武汉市疾病预防控制中心——微生物检验科
环境标本采集原则
➢ 最初流出的水标本：打开水龙头或装置后立即采集水 样，该水样即代表设备内的水。
军团菌及其检测技术
武汉市疾病预防控制中心 微生物检验科 Nhomakorabea赵滢 博士
EMAIL：hustzy401@ 2014年11月
军团菌的发现
1976年7月在美国费城，参加退伍军人大会的人员中 爆发了一种症状相同，原因不明的细菌性肺炎， 有 221人感染疾病，其中死亡34人。
初步的流行病学分析显示，致病的微生物可能通过空 气传播，采集标本，分离病原体
Legionella shakespearei
发现时间
1985 1985 1985 1985 1985 1985 1986 1988 1989
1989 1989 1990 1990 1991 1991 1991
种名 Legionella geestiana Legionella londiniensis Legionella nautarum Legionella quateirensis Legionella worsleiensis Legionella lansingensis Legionella lytica Legionella waltersii Legionella taurinensis Legionella beliardensis Legionella drozanskii Legionella fallonii Legionella gresilensis Legionella rowbothamii Legionella busanensis Legionella drancourtii
军团菌属检验标准操作规程
军团菌属检验标准操作规程1. 概述军团菌属细菌是一群病死率较高的急性呼吸道传染病的病原菌，该菌属包括45个种（60多个血清型），已从人体分离出的有嗜肺军团菌、米克戴德军团菌、波兹曼军团菌等20种。
嗜肺军团菌是军团菌属的代表种。
2. 标本类型痰等标本。
3.鉴定3.1 形态与染色革兰阴性纤细小杆菌。
荧光显微镜下可见被荧光抗体包被的发亮菌体。
3.2 培养特性在缓冲活性炭酵母提取物琼脂（BCYE）培养基上，本菌生长缓慢，应每日观察生长情况，在BCYE上需要3~5日方可见菌落，数日后增大到4~5mm，菌落呈灰白色，有光泽。
3.3 生化反应大部分菌株氧化酶试验阳性，不分解糖类，动力、明胶、马尿酸钠试验阳性，触酶试验阳性，多数菌株产生β-内酰胺酶。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌属特征革兰阴性细小杆菌，有多形性，苏丹黑染色可显蓝黑色或蓝灰色脂肪滴。
在BCYEα平板上3~5日形成蓝灰色、有光泽的菌落。
普通琼脂平板上不生长。
3.4.2 根据在BCYEα琼脂上生长的菌落，在紫外线365nm 灯光照射下产生红色荧光可推断为红色军团菌；产生蓝白色荧光，如氧化酶阳性，则为博氏和其他军团菌，如氧化酶阴性，则为杜氏、戈氏、彻氏、图森山军团菌；产生无色荧光，则根据马尿酸水解、氧化酶及其他生化反应进一步鉴定。
3.5 操作步骤3.5.1 涂片、染色革兰阴性杆菌。
3.5.2 鉴定直接荧光抗体染色，生化反应。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSI M100-S20最新版本文件。
5.质量控制见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析本菌虽然营养要求和培养环境要求严格，但在外环境分布较广，并可长期存活，致使通过污染水源空气而传播致病。
从临床或环境标本中分离军团菌时，需先对标本作酸处理（军团菌耐酸而其他杂菌则易被酸杀灭），并使用选择性琼脂平板（在BCYEα琼脂平板上加入抗生素等抑制杂菌），以提高军团菌的检出率。
军团菌对多种抗菌药物敏感，包括红霉素、利福平、氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺抗生素、复方磺胺甲恶唑、多西环素和福喹诺酮类等。
军团菌酶底物法操作规程
军团菌酶底物法操作规程军团菌酶底物法（Legionella Enzyme Substrate Method）是一种用于检测军团菌的方法，其原理是利用军团菌分泌的特定酶（比如磷酸酶）对某个底物的特异性作用，通过观察底物的颜色变化来判断样品中是否存在军团菌。
下面是军团菌酶底物法的操作规程。
1. 材料准备- 军团菌培养基：准备适当浓度的军团菌培养基，含有可溶性底物。
- 冷藏保存的军团菌引种：保证引种活性。
2. 样品准备- 收集待测样品：收集需要检测的水样、环境样品等。
- 制备样品悬浮液：将样品加入适量的无菌的缓冲液中（比如PBS），摇匀使样品均匀分散。
3. 样品处理- 选择合适的稀释度：根据样品特性，选择适当的稀释度，保证样品在检测范围内。
- 稀释样品：根据选择的稀释度，将样品稀释到适当浓度。
4. 反应体系制备- 准备阴性对照：取等体积的培养基作为阴性对照。
- 准备阳性对照：取军团菌培养基，加入适量的军团菌引种悬浮液，调整浓度。
根据需要，可选择不同菌株的阳性对照。
- 准备试验样品：取一定体积的稀释后的样品悬浮液。
5. 反应体系操作- 预热培养基：将培养基置于37摄氏度的恒温水浴中预热。
- 加入反应物：依次向培养基中加入适量的阴性对照、阳性对照和试验样品。
确保加入的量与反应基于军团菌培养量之间成一定的比例。
6. 反应体系孵育- 孵育温度：将反应体系置于37摄氏度的恒温箱中孵育。
- 孵育时间：根据实验要求以及样品的特性，确定孵育时间。
一般来说，24小时后可以观察到反应的结果。
需要注意的是，不同的底物可能需要不同的孵育时间。
7. 结果判断- 结果观察：观察培养基中的底物是否发生颜色变化。
阳性样品将呈现颜色变化，而阴性对照则不会有明显变化。
- 结果判定：根据颜色变化和阳性对照的对比，判断样品中是否存在军团菌。
8. 结果记录和解读- 记录观察结果：将观察到的结果记录下来，包括样品和对照的颜色变化情况。
- 结果解读：根据颜色变化对样品进行解读，如阳性、阴性或可疑。
军团菌的检测方法
军团菌的检测方法嘿，咱今天就来聊聊军团菌的检测方法。
你说这军团菌啊，就像个隐藏在暗处的小调皮，不仔细找还真发现不了它呢！要检测军团菌，首先咱得从它可能出没的地方下手。
就好比你要找一只调皮的小猫，得先去它常去的角落不是？像一些空调系统、热水系统这些地方，可都是军团菌喜欢藏的地儿。
那怎么检测呢？咱可以用培养法呀！这就好像种小花朵一样，给军团菌提供一个合适的环境，让它慢慢长出来。
把样本放在专门的培养基上，然后就等着看有没有小菌落长出来。
这要是真长出来了，那不就说明有军团菌嘛！你说这是不是很有意思？还有一种方法叫核酸检测法。
这就好像有个超级放大镜，能直接找到军团菌的基因片段。
一下子就把它给揪出来啦！多厉害呀！血清学检测也不能少哦！就好像给军团菌做个标记，看看我们身体里有没有对它产生反应。
要是有相应的抗体，那不就说明我们可能和军团菌打过交道啦？你想想啊，要是没有这些检测方法，我们怎么能知道有没有被这个小调皮给捣乱呢？那可不行呀！咱得把它给抓住，不能让它随便捣蛋。
检测军团菌可不是一件容易的事儿啊，需要我们细心再细心。
就跟找宝藏似的，得一点一点地去挖掘。
而且检测的时候还得注意好多细节呢，不然一不小心就可能让它给跑掉啦！咱得严格按照操作步骤来，不能马虎。
这可不是闹着玩的，万一没检测好，让军团菌溜走了，那可就麻烦啦！这就好像你去抓小偷，要是不认真，小偷不就跑掉了嘛！总之啊，军团菌的检测方法很重要，我们得好好掌握。
这样才能及时发现它，把它给解决掉，让我们的生活更加健康、安全。
别小瞧了这些检测方法，它们可是我们对抗军团菌的有力武器呢！所以啊，大家都要重视起来哦！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
空调系统军团菌的检验分析方法
附件公共场所集中空调通风系统卫生规范1.总则为了预防公共场所集中空调通风系统（以下简称空调系统）传播传染病，保护人体健康，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《公共场所卫生管理条例》、《突发公共卫生事件应急条例》和《传染性非典型肺炎防治管理办法》，制定本规范。
本规范规定了公共场所空调系统的一般卫生要求、传染病流行期卫生要求、净化消毒装置卫生要求、卫生学评价和卫生管理要求。
2.适用范围本规范适用于公共场所使用的空调系统，其它场所空调系统可参照执行。
3.规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
GB/T 18883 室内空气质量标准GB 9663-9673 公共场所卫生标准GB/T 18204.1 公共场所空气微生物检验方法卫生部消毒技术规范4.术语与定义4.1 集中空调通风系统为使房间或封闭空间空气温度、湿度、洁净度和气流速度等参数达到给定的要求，而对空气进行处理、输送、分配，并控制其参数的所有设备、管道及附件、仪器仪表的总和。
4.2 空气传播性传染病以空气为主要传播途径的传染病。
4.3 空气净化采用某些技术或方法去除室内空气中的颗粒物、微生物和气态污染物。
4.4 可吸入颗粒物（PM10）能够进入人体呼吸道的空气动力学当量质量中位径为10微米的颗粒物。
5.空调系统的卫生要求5.1 一般要求5.1.1 空调系统新风量和运行参数应符合国家卫生标准和要求，新风采气口的设置应保证所吸入的空气为室外新鲜空气，新风采气口应远离建筑物排风口和开放式冷却水塔。
严禁间接从空调通风的机房、建筑物楼道及天棚吊顶内吸取新风。
5.1.2 空调系统的新风口和回风口应安装防鼠、防虫设施。
5.1.3 空调系统的过滤器（网）、表冷器、加热（湿）器、冷凝水盘应每年进行一次全面检查、清洗或更换。
空调系统军团菌的检验分析方法
附件公共场所集中空调通风系统卫生规范1.总则为了预防公共场所集中空调通风系统（以下简称空调系统）传播传染病，保护人体健康，依据《中华人民共和国传染病防治法》、《公共场所卫生管理条例》、《突发公共卫生事件应急条例》和《传染性非典型肺炎防治管理办法》，制定本规范。
本规范规定了公共场所空调系统的一般卫生要求、传染病流行期卫生要求、净化消毒装置卫生要求、卫生学评价和卫生管理要求。
2.适用范围本规范适用于公共场所使用的空调系统，其它场所空调系统可参照执行。
3.规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
GB/T 18883 室内空气质量标准GB 9663-9673 公共场所卫生标准GB/T 18204.1 公共场所空气微生物检验方法卫生部消毒技术规范4.术语与定义4.1 集中空调通风系统为使房间或封闭空间空气温度、湿度、洁净度和气流速度等参数达到给定的要求，而对空气进行处理、输送、分配，并控制其参数的所有设备、管道及附件、仪器仪表的总和。
4.2 空气传播性传染病以空气为主要传播途径的传染病。
4.3 空气净化采用某些技术或方法去除室内空气中的颗粒物、微生物和气态污染物。
4.4 可吸入颗粒物（PM10）能够进入人体呼吸道的空气动力学当量质量中位径为10微米的颗粒物。
5.空调系统的卫生要求5.1 一般要求5.1.1 空调系统新风量和运行参数应符合国家卫生标准和要求，新风采气口的设置应保证所吸入的空气为室外新鲜空气，新风采气口应远离建筑物排风口和开放式冷却水塔。
严禁间接从空调通风的机房、建筑物楼道及天棚吊顶内吸取新风。
5.1.2 空调系统的新风口和回风口应安装防鼠、防虫设施。
5.1.3 空调系统的过滤器（网）、表冷器、加热（湿）器、冷凝水盘应每年进行一次全面检查、清洗或更换。
水中军团菌检测(ISO11731-1998)
1.适用范围本方法适用于各种环境中的样品包括饮用水、工业用水和自然界中的水及沉淀物和污泥中的军团菌测定。
2.培养基与试剂2.1 GVPC：2.1.1基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.1.2添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)和军团菌GVPC选择性添加剂Oxoid(SR0152E)。
2.1.3制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀, 再无菌吸取2mL SR0152E（用10mL无菌蒸馏水溶解）加入到上述培养基中，混匀后，倾倒平板。
2.2 BCYE：2.2.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.2.2 添加剂：军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0110A)。
2.2.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR110A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.3 BCYE-Cys：2.3.1 基础琼脂：军团菌CYE琼脂基础Oxoid (CM0655B)。
2.3.2 添加剂：不含L-半胱氨酸的军团菌BCYE添加剂Oxoid (SR0175A)。
2.3.3 制备：2.5g CYE溶解在90ml蒸馏水中, 121ºC/15分钟灭菌, 冷却到50ºC, 将SR175A用10mL 50ºC无菌蒸馏水溶解后无菌加入到以上的培养基中, 混合均匀,倾倒平板。
2.4 酸缓冲液配制：A液 0.2M HCl（10mL 1M的HCl加入到40mL的蒸馏水中） 39mlB液 0.2M KCl (14.9gKCL溶解在1L无菌蒸馏水中) 250mlA, B液混合后用1M 的KOH调节pH至2.2±0.2,室温下的保质期一个月.2.5血平板(BA)2.6革兰氏染色液2.7军团菌乳胶凝集试剂盒Oxoid（DR0800M）。
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军团菌检验方法实施细则1适用范围：本细则适用于各类样品中军团菌的检测鉴定。
2检测依据：国家《传染病诊断标准》WS195-2001 军团病诊断标准及处理原则军团病诊断标准及处理原则，卫生部，2002年上海市卫生防疫站1979；卫生防疫细菌检验，第一版，上海科技出版社3设备与材料3.1冰箱：4～-20℃。
3.2恒温培养箱：36±1℃。
3.3振荡器3.4显微镜40x 100x3.5离心机12000rpm3.6架盘药物天平：0 g -500g, 精度0.5g。
3.7锥形瓶：100 mL、500 mL。
3.8灭菌吸管：1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.9灭菌平皿：直径90 mm。
3.10灭菌试管：16 mm×160 mm.。
一般用的是18*180mm3.11 温水浴箱：36±1℃3.12 二氧化碳培养箱：5%CO236±1℃3.13 紫外灯3.14 过滤器4培养基和试剂4.1 BCYEα琼脂成份：N-2-乙酰胺基-2-氨基乙烷磺酸（ACES） 10.00 克氢氧化钾片（85%KOH 试剂级） 2.80 克活性炭（Norit A） 1.50 克酵母浸膏（Difco） 10.00 克琼脂（Difco） 17.00 克α-酮戊二酸（单钾盐） 1.00 克L-半胱氨酸盐酸盐（溶于10毫升蒸馏水中） 0.40 克焦磷酸铁（溶于10毫升蒸馏水中） 0.25 克蒸馏水 1000 毫升4.2甘氨酸、万古霉素、多粘菌素B（GVP）琼脂成份：除上述每升BCYEα琼脂成份外，再加：甘氨酸 3.00 克万古霉素 5.00 毫克多粘菌素B 10 万单位4.3 明胶酶试验培养基：此培养基的制备，除用明胶（每100ml 中加3g ）代替琼脂外，其它同BCYE α培养基。
4.4 酪氨酸BCYE α培养基：在BCYE α琼脂中除去碳粉，再于每升培养基中加0.45g 酪氨酸。
试验时划种平板，于37℃培养5天观察结果。
4.5 血平板4.6 无半胱氨酸BCYE α平板4.7 1%新配制的四甲基对苯二胺水溶液 4.8 3%新配制的过氧化氢液 4.9 1%马尿酸钠水溶液5.0 3.5%茚三酮5.1 0.2%亚甲兰水溶液 5.2 10%中性福马林液5.3 96孔U 型（8×12）微孔板和微量移液器（8道及单道） 5.4 0.01mol/L pH2.0的盐酸 5.5 0.3mol/l KOH 5.6 革兰氏染色液5.7 军团菌成套诊断血清5 检验程序（军团菌检验程序）● 临床含杂菌的标本：痰、肺或其它组织（均用少量蒸馏水调匀或机械研磨成均匀的悬液）和气管灌洗液等标本直接免疫荧光法镜检 酸处理或放50℃30min 必要时放－70℃保存划种GVPC 琼脂平板（36℃，5%CO 27—14天）● 血液标本：● 水样类标本：水样（0.5L ～5L 水的离心沉淀物或经过滤后的0.22μm 孔径滤膜）或水龙头等处的棉拭子洗液● 菌种初步鉴定：BCYE α琼脂平板上的可疑菌落 接种无半胱氨酸的BCYE α琼脂平板36℃，5%CO 23～7天）不生长第2天生长 第3天后生长 出单个菌落 的革兰氏阴性杆菌 阴性杆菌 阳性杆菌或阴性球菌不是军团菌 不是军团菌菌种做进一步鉴定6操作步骤6.1 样品处理6.2 病人培养标本加热处理：将标本放50℃水浴30min，可杀灭大部分杂菌而不影响军团菌的存活。
6.3 环境标本(水样)加酸处理：采集500ml水样，经0.22μm孔径的滤膜抽滤后，将滤膜剪碎，放置于5ml原水样中混匀，取1ml混匀或研匀的标本，加于试管中，并于其中加1ml0.01mol/L pH2.0的盐酸，充分混匀。
然后于室温中作用5～15min，再于其中加0.03mol/l KOH若干以中和酸的作用。
取0.2ml处理水样培养。
6.4 血清学试验标本于发病时和两周后采血，测定军团菌抗体效价，每次采血2毫升（不加抗凝剂）并分离血清。
单次采血可在发病一两周后。
6.5 培养分离军团菌无菌的标本材料如胸水，可以在离心沉淀后划种BCYEα琼脂平板，而污染的材料则应先划种GVPC琼脂平板，划种时应先在原始区浓厚接种，然后再分离单个菌落。
将平板放36℃5%CO2培养箱（或烛缸）培养。
每日观察结果。
6.6 生化鉴定6.6.1 氧化酶试验采用平板法或滤纸法，即将1%新配制的四甲基对苯二胺水溶液直接滴在BCYEα琼脂平板上新生长出的菌苔和菌落上，30秒内出现明显深紫色时为阳性，或直接挑取新鲜菌落揉擦在清洁的白色泸纸上，再滴加试剂于其上，30秒内出现深紫色为阳性。
6.6.2 触酶试验准备一管新培养的BCYEα斜面培养物，于其中滴加3%过氧化氢液，立即出现大量气泡者为阳性。
也可用铂丝、小玻棒等挑取少量新鲜生长的菌落或菌苔，研均于盛有少量3%过氧化氢液的清洁试管内，立即出现大量气泡者为阳性。
6.6.3动力试验用军团菌营养肉汤的新鲜培养物做悬滴法。
观察时注意与布朗氏运动区别。
测定菌落荧光：将被试菌接种酪氨酸BYE琼脂平板，待生长出单个菌落后，在黑暗处以长波（365mμm）紫外线照射下，观察菌落发出的荧光。
6.6.4 棕色色素产生试验将被试菌划种酪氨酸BYE琼脂平板，待生长出单个菌落后（36℃培养7天），观察菌落和菌苔，出现棕色时为阳性。
6.6.5 马尿酸水解试验将一满环（环直径3mm）BCYEα琼脂斜面的生长物，接种于马尿酸盐管（内含1%马尿酸钠水溶液0.4ml）中，使成均匀混浊菌悬液，放36℃水浴18～20小时，再于其中加入0.2ml 茚三酮试剂液（将3.5%比例的茚三酮溶解于按1∶1混合的丙酮与正丁醇中，新鲜使用或黑暗中保存短时间），放36℃水浴10min，取出后在20min未接种的马尿酸盐管作空白对照，同样的条件下，嗜肺军团菌通常于5～15min形成兰色（阳性），而一般其它军团菌则于15min 后完全无颜色改变。
6.6.6 BCP试验将 0.05%溴甲酚紫水溶液1滴，加在一滤纸处，再于BCYEα琼脂上新生长的菌落或菌苔，以接种环取较大量揉擦于滴过试剂的滤纸处，如在1min内出现绿兰色，则此试验为阳性；黄色或暗绿色为阴性。
6.6.7 测定β内酰胺酶产生试验有多种方法。
有条件时建议采用硝化先锋霉素（Nitrocefin）纸片法，阳性时纸片由淡黄色变为深红色。
一般均认为此法是最灵敏、准确和方便的方法。
6.6.8 明胶水解试验将待试菌穿刺接种于明胶酶试验培养基管，放22℃培养至少14天，如出现液化时为阳性。
6.7 血清学分型鉴定军团菌血清分型鉴定时采用玻片凝集法，可参照标准分型表判定结果。
如符合以上结果，可按上表报告检出某种军团菌。
表1 军团菌科各常见种的表型试验鉴定特征菌株名血清型数在各种琼脂上生长氧化酶触酶动力菌落荧光马尿酸水解BCP斑点棕色素β内酰胺酶明胶液化BCYEα缺半胱氨酸BCYE血平板嗜肺军团菌15 + - - +/- +/- + - + - + + + 米克戴德军团菌 1 + - - +/- + + - - + - - - 博杰曼军团菌 2 + - - - + + 蓝白- - + +/- + 杜莫夫军团菌 1 + - - - +/- + 蓝白- - + + + 长滩军团菌 2 + - - +/- + + - - - + +/- + 约旦军团菌 1 + - - + + + - - - + + + 高尔曼军团菌 1 + - - - +/- + 蓝白- - + + + 菲利军团菌 2 + - - - + + - +/- - +/- - +/- 阿尼沙军团菌 1 + - - + +/- + 蓝白- - + + + 詹姆斯敦军团菌 1 + - - - + + - - - + + + 红光军团菌 1 + - - - + + 红- - + + + 橡树岭军团菌 1 + -/+ - - + - - - - + +/- +＋＝阳性－＝阴性＋／－＝可阴可阳6.8 基因检测以全军团菌属5s rRNA和嗜肺军团菌mip基因的特异序列作为引物，扩增片段大小分别为104bp和440bp。
核酸的提取及扩增（1）已知菌核酸提取：取灭菌双蒸水0.5ml于离心管中，挑取菌苔少许放入该离心管中振荡混匀，放置于裂解仪中100℃裂解10min，取出放入-20℃速冻，15min后， 12，000rpm，4℃，离心5min，取上清液，按试剂盒提供的方法操作。
（2）水样中核酸提取（第二批预处理水样）：取水样混悬液1ml于离心管中，10，000rpm，离心5min，取上清液，按试剂盒提供的方法操作。
（3）扩增条件预变性94℃ 5min；94℃ 35sec、55℃ 35sec、72℃ 75sec循环35次；最后72℃延伸3min。
PCR结果判定取10μl扩增产物，经2%琼脂糖凝胶电泳，100v，电泳20～30min，观测结果。
7报告结果7.1报告阳性结果检出军团菌7.2报告阴性结果未检出军团菌浙江省军团菌病监测方案1976年美国宾夕法尼亚州费城，一起流行性爆发性肺炎使人们陷入极度恐慌中，共221人感染，死亡34例。
由于患者主要是退伍军人，故称此病为军团菌病。
次年找到病原体，并命名为军团菌。
以后经过不断研究发现，此菌广泛分布于自然界，特别是水中。
军团菌有34个种59个血清型，其中嗜肺军团菌(Legionella pneumophila，Lp)有14个血清型，是引起人类军团病的主要病原菌。
军团菌感染可引起上呼吸道感染样症状、持续发热及其他系统的改变．临床症状体征并非特异。
军团菌感染主要以肺部炎症为特征。
轻者称庞地亚克热（pontiac fever），重者表现以肺部感染为主的全身多脏器损害，即军团菌病。
军团菌肺炎容易导致呼吸衰竭、横纹肌溶解和肾功能衰竭，15%军团菌肺炎可引起出现肾功能衰竭，其中有50%病人最终死于肾功能衰竭。
近年来，国外有过多起有关军团菌肺炎疫情爆发的报道，2004年Chrysochou C报道了一起军团菌肺炎爆发。
2000年发生比利时一起军团菌肺炎爆发疫情，该起疫情为旅行团中93例发生军团菌肺炎的，引起了当地政府的高度重视。
1996年法国也发生了一起旅行团中爆发军团菌肺炎。
我国在1981年发现首例病人，随后又在肺炎病人痰和空调系统冷却塔水中分离出军团菌。
血清流行病学证实，我国南京、广州、天津，等地均有军团菌感染。
不仅如此，据国内外报道在家禽家畜中也广泛存在军团菌感染，目前已在多种动物体内发现军团菌，发生感染并引起疾病。
军团菌引起肺炎症状，在临床上容易与SARS、禽流感和其他不明原因发热和肺炎相混淆。
而且军团菌由于缺乏典型的临床体征以及治疗的特殊性，其实验室确诊显得尤为重要。
但军团菌人工培养条件的苛刻及其生长代谢的缓慢导致临床与环境标本检出率低下，从而造成事实上的假阴性漏检，而且目前大多数医院都没有开展军团菌检测的条件和技术，对军团菌的预防和治疗十分不利。