以甲苯胺蓝为电化学探针的核酸适配体传感器用于腺苷的检测

以甲苯胺蓝为电化学探针的核酸适配体传感器用于腺苷的检测杨绍明;李瑞琴;李红;陈延胜;丁素游
【摘要】通过金硫键将腺苷适配体互补链(S1)和末端带羧基的DNA链(S2)修饰在金纳米粒子(GNPs)表面,以及甲苯胺蓝(TB)与S2的酰胺反应将TB标记在金纳米粒子表面形成甲苯胺蓝标记的DNA探针分子TB-S2-GNPs-S1,然后在玻碳电极表面电沉积一层金纳米粒子,以其为载体将末端带有巯基的腺苷适配体(Apt)固定在电极表面,以牛血清蛋白为封闭剂消除非特异性吸附,再通过TB-S2-GNPs-S1中的S1与Apt杂交将TB-S2-GNPs-S1负载到电极表面,成功建立了一种以甲苯胺蓝为电化学探针检测腺苷的适配体生物传感器.采用紫外可见光谱和扫描电镜对合成的金纳米粒子和TB-S2-GNPs-S1复合物进行表征.对电极的组装过程采用循环伏安法和电化学阻抗法(EIS)进行表征,对传感器的性能采用差分脉冲法(DPV)和电化学阻抗进行研究.该传感器在1.0×10-4～100.0 ng/mL范围内对腺苷具有良好的信号响应,相关系数(r)为0.994,检出限(S/N=3)为64.7 fg/mL.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2015(034)004
【总页数】6页(P395-400)
【关键词】腺苷;核酸适配体传感器;甲苯胺蓝;金纳米粒子
【作者】杨绍明;李瑞琴;李红;陈延胜;丁素游
【作者单位】华东交通大学理学院化学化工系,江西南昌330013;华东交通大学理学院化学化工系,江西南昌330013;华东交通大学理学院化学化工系,江西南昌
330013;华东交通大学理学院化学化工系,江西南昌330013;华东交通大学理学院化学化工系,江西南昌330013
【正文语种】中文
【中图分类】O657.1;O625.32
以甲苯胺蓝为电化学探针的核酸适配体传感器用于腺苷的检测
杨绍明
*，李瑞琴，李红，陈延胜，丁素游
(华东交通大学理学院化学化工系，江西南昌330013)
摘要:通过金硫键将腺苷适配体互补链(S
1)和末端带羧基的DNA链(S
2)修饰在金纳米粒子(GNPs)表面，以及甲苯胺蓝(TB)与S
2的酰胺反应将TB标记在金纳米粒子表面形成甲苯胺蓝标记的DNA 探针分子TB-S
2-GNPs-S
1，然后在玻碳电极表面电沉积一层金纳米粒子，以其为载体将末端带有巯基的腺苷适配体(Apt)固定在电极表面，以牛血清蛋白为封闭剂消除非特异性吸附，再通过TB-S
2-GNPs-S
1中的S
1与Apt杂交将TB-S
2-GNPs-S
1负载到电极表面，成功建立了一种以甲苯胺蓝为电化学探针检测腺苷的适配体生物传感器。

采用紫外可见光谱和扫描电镜对合成的金纳米粒子和TB-S 2-GNPs-S
1复合物进行表征。

对电极的组装过程采用循环伏安法和电化学阻抗法(EIS)进行表征，对传感器的性能采用差分脉冲法(DPV)和电化学阻抗进行研究。

该传感器在1.0×10
-4～100.0 ng/mL范围内对腺苷具有良好的信号响应，相关系数(r)为0.994，检出限(S/N =3)为64.7 fg/mL。

关键词:腺苷;核酸适配体传感器;甲苯胺蓝;金纳米粒子
中图分类号:O657.1; O625.32 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2015)04-0395-06
doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2015.04.004
收稿日期:2014-10-26;修回日期:2014-12-10
基金项目:国家自然科学基金(21465012，21065004)
*通讯作者:杨绍明，博士，教授，研究方向:电分析化学及生物传感器，Tel:0791-********，E-mail:****************
Determination of Adenosine Using Aptamer Biosensor with Toluidine Blue as Electrochemical Probe
YANG Shao-ming
*，LI Rui-qin，LI Hong，CHEN Yan-sheng，DING Su-you
(Department of Chemistry and Chemical Engineering，School of Sciences，East China Jiaotong University，Nanchang 330013，China)
Abstract:In the paper，adenosine complementary aptamer strand(S
1) and carboxylic acid terminated DNA(S
2) were firstly modified on the gold nanoparticles(GNPs) surface through Au-S bonds.With the help of the amidation reaction of toluidine blue(TB) and S
2，TB was labeled on the surface of gold nanoparticles for the preparation of TB labeled DNA probe TB-S
2-GNPs-S
1.Then a layer of gold nanoparticles was electro-deposited on
the glass carbon electrode surface，which was used as the immobilization matrix for adenosine aptamer with terminal mercapto group.Subsequently，bovine serum albumin(BSA) as a blocking agent was used to eliminate
non-specific adsorption.TB-S
2-GNPs-S
1was immobilized on the electrode surface through the hybridization of S
1and the adenosine aptamer.An aptamer biosensor was constructed with toluidine blue as the electrochemical redox probe.The
synthesized gold nanoparticles and TB-S
2-GNPs-S
1composites were characterized by UV-Vis spectroscopy and scanning electron microscopy.The electrode assembly process was monitored by cyclic voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy.The sensor's performance was studied by differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy.The sensor showed a linear relationship to adenosine from 1.0×10
-4ng/mL to 100.0 ng/mL，with a correlation coefficient(r) of
0.994 and a detection limit(S/N =3) of 64.7 fg/mL.
Key words:adenosine; aptasensor; toluidine blue; gold nanoparticles
核酸适配体具有稳定性高、选择性强、靶分子广泛等优点，其与靶分子具有高度的结合能力。

电化学核酸适配体生物传感器是一种将适配体与靶分子结合的生物信号转化为电化学信号的传感器，近年来在生物大分子及小分子等物质的研究领域受到广泛关注。

因此，发展灵敏、便捷的生物传感器成为人们研究的重要方向。

腺苷是参与生命活动的重要生物小分子，影响人体机能的正常运行。

在人们的日常生活中，对腺苷进行快速、灵敏的分析检测具有十分重要的现实意义
［1］。

甲苯胺蓝作为碱性生物染料，是用于疾病诊断的医学生化试剂，也是工业染色剂［2-3］。

由于其特殊的电催化活性，常被用于检测维生素C、多巴胺、血红蛋白等生物分子。

陈刚
［4］在玻碳电极表面电聚合甲苯胺蓝薄膜，利用其对多巴胺和抗坏血
酸的电催化作用，实现了对二者的同时测定，达到了互不干扰的良好效果。

此外，甲苯胺蓝还可作为电化学探针，并具有良好的可逆性和稳定性，是一种性能优异的电子媒介体。

金纳米颗粒具有导电性能强、催化活性高、比表面积大、负载能力强等优点，与生物分子具有良好的相容性，并且Au与巯基之间可形成很强的Au-S共价键，可以稳定地固定修饰了-SH的适配体，用金纳米粒子构建生物传感器可提高灵敏度和稳定性，以金纳米粒子修饰的探针可有效增大检测信号。

Cai等
［5］制备了电活性的金纳米粒子标记的寡聚核苷酸电化学探针，利用金胶的信号扩增作用，实现了对特定靶序列的识别和检测。

本文结合金纳米粒子的大比表面积和高负载能力等优点，将S
1和S
2修饰在金纳米粒子表面，以DNA链的末端羧基为基础通过酰胺反应将带有氨基的甲苯胺蓝标记在金纳米粒子表面，有效地放大了检测信号，实现了金纳米粒子信号扩增的作用，从而极大提高了传感器的灵敏度。

将甲苯胺蓝(TB)修饰在DNA分子上作为电化学指示剂，对于开发新型氧化还原探针有深远意义。

本文首先制备了甲苯胺蓝标记的DNA探针分子TB-S
2-GNPs-S
1，然后以玻碳电极为基质，在电极表面电沉积一层金纳米颗粒，将其作为适配体的固定基质，通过Au-S键合作用将Apt组装到电极表面，再以牛血清蛋白作为封闭剂，通过Apt与其互补链S
1的杂交，将TB-S
2-GNPs-S
1固定在电极上，当腺苷分子存在时，适配体会与互补链分离，TB-S 2-GNPs-S
1从电极表面脱落使得电流信号减小，阻抗值增大。

利用电流和阻抗的变化达到检测腺苷的目的，从而成功地构建了一种检测腺苷的新型适配体传感器。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器
腺苷适配体(Apt，5'-HS-(CH
2)
6-AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT-3')、腺苷适配体序列部分互补链(S
1，5'-CTT CCT CCG CAA TAC TCC CCC AGGT-(CH
2)
6-SH-3')和巯基修饰的DNA序列(S
2，5'-COOH-TTT TTT TT-(CH
2)
6-SH-3')均来源于上海生工生物工程有限公司;腺苷(AD，Sigma-Aldrich公司);凝血酶(THR，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);氯金酸(HAuCl 4，上海试剂一厂);牛血清白蛋白(BSA，上海晶纯实业有限公司);辣根过氧化物酶(HRP，上海三杰生物技术有限公司);实验用水为蒸馏水。

CHI660C电化学工作站(上海辰华仪器公司); JSM-6701F型扫描电子显微镜(日本电子(JEOL)公司); LB-550激光粒度仪(日本Horiba公司); Lamdba 35型紫外光谱
仪(PerkinElmer公司)。

1.2 溶液的配制
腺苷适配体序列为SELEX法筛选所得，腺苷适配体
［6-7］以TE
1(20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl
2和1 mmol/L MgCl
2，pH 7.4)缓冲溶液配成1 μmol/L的储备液，置于4℃冰箱中保存备用。

腺苷适配体互补链S
1
［8］和巯基修饰的DNA序列S
2以TE
2(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.1)配成1 μmol/L的储备液，置于4℃冰箱中保存。

三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、1-乙基-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)均以0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.8)配制成浓度分别为10，100，100 mmol/L的溶液。

各浓度腺苷均以0.2 mol/L PBS(pH 6.8)缓冲溶液配制，置于4℃冰箱中保存。

牛血清蛋白和甲苯胺蓝以0.2 mol/L PBS(pH 6.8)缓冲溶液分别配制成浓度为1 mg/mL和1 mmol/L的溶液，置于4℃冰箱内保存。

1.3 金纳米粒子的制备
金纳米粒子依据Turkevich-Frens法
［9-10］用柠檬酸钠还原氯金酸制备。

通过改变还原剂的量可以得到不同粒径的金纳米粒子。

将0.5 mL 1 mmol/L的氯金酸与18.5 mL的水在搅拌状态下加热至沸腾后，迅速加入0.5 mL 0.01 mol/L的柠檬酸钠溶液中。

几分钟后溶液呈酒红色即停止加热，溶液搅拌后，自然冷却至室温。

将制得的金纳米粒子置于棕色试剂瓶内，于4℃冰箱中保存。

1.4 TB-S
2-GNPs-S
1复合物的制备
参照文献［11-15］，取1 μmol/L的S
1和S
2各2 mL，并加入10 μL TCEP使之充分混合，活化巯基1 h后，加入4 mL新制的金纳米粒子轻微振荡过夜16 h，然后加入1 mL TE
1溶液老化，室温静置8 h后离心30 min去除上层清液，将沉积物重新分散于1 mL TE
1溶液中，再加入100 μL EDC和100 μL NHS溶液活化羧基2 h，加入1 mL 1 mmol/L TB溶液，静置一夜后离心30 min，最后将沉积物溶于1 mL TE
1溶液中备用，即制得TB-S
2-GNPs-S
1复合物，制备流程见图1。

图1 TB标记互补链S
1流程图
Fig.1 Schematic diagram of complementary strands S
1labeled with TB
1.5 修饰电极的制备
将GCE用0.05 μm的Al
2O
3粉抛光，再依次用无水乙醇和水超声洗涤干净后，在0.5 mol/L H 2SO
4溶液中于-0.3～1.5 V下扫描活化。

将活化后的GCE电极置于3 mmol/L HAuCl
4溶液中，于-0.2～1.4 V范围内，以0.1 V/s的扫速循环伏安扫描20圈，即得金纳米粒子覆盖的GCE电极。

然后将电极依次置于腺苷适配体(Apt)中浸泡12 h，BSA中浸泡40 min，TB-S
2-GNPs-S
1中浸泡2 h，即得GCE/GNPs/Apt/BSA/TB-S
2-GNPs-S
1修饰电极。

1.6 电化学测试方法
将制备好的GCE/GNPs/Apt/BSA/TB-S
2-GNPs-S
1电极置于0.2 mol/L PBS(pH 7.0)溶液中，使用三电极系统，采用DPV对电极进行扫描得到空白电流(I
0)，手动连续扫描几次，稳定后用水洗净电极，吹干后置于AD溶液中培养40 min，再用DPV进行扫描得到电流I，以传感器的电流响应ΔI(ΔI = I-I 0)来实现对腺苷的检测;将修饰电极置于铁氰化钾溶液中，采用EIS扫描得到空白电阻(R
et0)，洗净电极，吹干后置于AD溶液中培养孵育40 min，再用EIS 扫描得到阻抗R
et，腺苷的检测是基于传感器的阻抗响应ΔR
et(ΔR
et= R
et-R
et0)。

本实验均采用三电极体系测定:电化学核酸适配体所组装的玻碳电极(直径3 mm)为工作电极，Ag/AgCl，KCl(饱和)作为参比电极，铂电极为对电极。

实验过程均在室温下进行。

在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K
3［Fe(CN)
6］/K
4［Fe(CN)
6］(1∶1)溶液中测定交流阻抗谱(振幅:0.005 V，频率范围:1～100 000
Hz)，并通过ZSimpwin软件进行模拟。

2 结果与讨论
2.1 金纳米粒子及复合物的表征将实验制得的金纳米粒子进行紫外-可见吸收光谱表征、粒径分析及扫描电子显微镜表征。

本实验所得金纳米粒子的紫外可见吸收峰位于522 nm左右处(见图2A)，与文献［16-17］报道类似。

根据文献［18-19］，在传感器中使用的金纳米粒子粒径小于30 nm时效果较好，本文制备的金纳米粒
子的平均粒径为26.9 nm(图2B)，粒径大小符合实验需要。

从SEM谱图可观察到金纳米粒子呈球状分散，其形状规则，粒径大小均匀，约为25 nm(图2C)，与粒
度分析仪测定的结果很接近。

图2 金纳米粒子和氯金酸的紫外-可见光谱图(A)，以及金纳米粒子的粒径分布图(B)与扫描电镜图(C)
Fig.2 UV-Vis spectra of gold nanoparticles and chloroauric
acid(A)，particle size diameter distribution(B) and SEM image(C) of gold nanoparticles
为了考察DNA与甲苯胺蓝在金纳米粒子上的标记情况，对TB-S
2-GNPs-S
1进行了紫外-可见吸收光谱表征(图3A)。

由图可知，在260，526，630 nm左右处出现的吸收峰分别为DNA、金纳米粒子及甲苯胺蓝的吸收峰。

其
中260 nm左右有一个很强的吸收峰，说明DNA分子已成功地固定在金纳米粒子
的表面，且金纳米粒子的最大吸收峰红移，峰位置在526 nm左右
［20-21］。

金纳米粒子的紫外吸收峰发生微小偏移是因为其与DNA 分子结合后沉淀形成大的颗粒，粒径增大造成其紫外吸收峰红移。

630 nm左右出现了甲苯胺蓝的特征吸收峰，说明TB已被成功地标记在适配体表面。

图3 TB-S
2-GNPs-S
1复合物的紫外可见光谱图(A)及扫描电镜图(B)
Fig.3 UV-Vis spectrum(A) and SEM image(B) of TB-S
2-GNPs-S
1composites
利用扫描电子显微镜考察了复合物的形貌，从SEM谱图中可以看到分布均匀的链状复合物(图3B)。

表明适配体和甲苯胺蓝已被成功地固定在金纳米粒子的表面。

2.2 修饰电极的循环伏安表征
图4 不同电极的循环伏安表征
Fig.4 CV response of different electrodes
a.GCE，
b.GCE/GNPs/Apt/BSA，
c.GCE/GNPs/Apt/BSA/ TB-S
2-GNPs-S
1，d.GCE/GNPs/Apt/BSA/TB-S
2-GNPs-S
1/AD(1.0 ng/mL); scan rate:100 mV/s
在0.2 mol/L PBS(pH 7.0)中对该修饰电极的组装过程进行CV表征，结果如图4所示，裸玻碳电极几乎为一直线(曲线a);当电沉积金后，核酸适配体通过Au-S键与金纳米粒子结合，以BSA封闭电极表面之后，未出现氧化还原峰(曲线b);当TB 标记的DNA与腺苷适配体互补结合后，在-0.3 V电位左右出现一对可逆性良好的氧化还原峰，即为TB的特征峰(曲线c);最后，1.0 ng/mL腺苷与适配体的特异性结合致使TBS
2-GNPs-S
1从电极表面脱落，促使峰电流减小(曲线d)。

研究结果表明TB-S
2-GNPs-S
1可有效作为测定腺苷适配体传感器的电化学指示剂。

2.3 修饰电极的电化学阻抗表征
采用电化学阻抗对该修饰电极的组装过程进行表征(图5)，裸玻碳电极呈现一很小的半圆(曲线a);当电沉积金纳米粒子后，半圆的直径减小，说明GNPs促进了［Fe(CN)
6］
3-/4-的电子传递(曲线b);适配体组装到电极表面后，半圆直径略有增大，表明适配体阻碍了［Fe (CN)
6］
3-/4-到电极表面的电子传递(曲线c); BSA封闭电极表面的空白位点与
电极结合后阻抗明显增大(曲线d); TB标记的适配体与腺苷适配体互补结合后，半圆直径明显减小，说明TB促进了电子传递(曲线e);而腺苷(1.0 ng/mL)与适配体发生特异性结合后，半圆直径变大，说明腺苷阻碍了电化学探针在电极表面反应(曲
线f)。

研究表明电化学阻抗可对传感器的组装过程进行监测，也表明通过上述组装过程得到了目标传感器。

图5 不同电极的交流阻抗图
Fig.5 EIS response of different electrodes
a.GCE，
b.GCE/GNPs，
c.GCE/GNPs/Apt，
d.GCE/GNPs/ Apt/BSA，
e.GCE/GNPs/Apt/BSA/TB-S
2-GNPs-S
1，f.GCE/GNPs/Apt/BSA/TB-S
2-GNPs-S
1/AD
2.4 传感器的性能
采用EIS和DPV研究了传感器在不同浓度的腺苷中培育前后的阻抗和电流变化，结果如图6所示。

EIS法测得腺苷在1.0×10
-6～1.0 μg/mL浓度(c)范围内，ΔR
et与lgc呈线性关系。

线性方程为ΔR
et(Ω) =52.62+32.25lgc(pg/mL)，相关系数(r)为0.995，检出限(S/N =3)为0.5 pg/mL。

DPV法测得腺苷在1.0×10
-4～100.0 ng/mL范围内，ΔI与lgc呈线性关系。

线性方程为ΔI(μA) = 0.899 4+0.355 4lgc(pg/mL)，相关系数(r)为0.994，检出限(S/N =3)为64.7 fg/mL。

该传感器的检出限低于文献报道值
［6，22］。

图6 腺苷核酸适配体传感器对不同浓度腺苷的交流阻抗谱图(A)及差分脉冲图(B) Fig.6 EIS response(A)and different pulse voltammetry response(B) of aptamer biosensor to adenosine
inset:linear fitting curve; A:concentration of adenosine A(1-7):blank，
-6，1.0×10
-5，1.0×10
-4，1.0×10
-2，5.0×10
-2，1.0 μg/mL; B:concertraion of adenosine(1-7):blank，
1.0×10
-4，1.0×10
-2，0.10，0.50，50.0，100.0 ng/mL
2.5 抗干扰能力与稳定性
为考察该传感器的抗干扰能力，以pH 6.8的PBS缓冲溶液分别配制10.0 ng/mL HRP，10.0 ng/ mL THR，1.0 ng/mL AD及0.2 mol/L的PBS对核酸适配体进行抗干扰性能检测(图7)。

由图可知，同浓度下HRP和THR对腺苷传感器的干扰均非常小，显示传感器具有较强的抗干扰能力。

在最佳实验条件下，传感器在1.0 ng/mL的AD中组装后用EIS测定10次，测定电化学阻抗的相对标准偏差(RSD)为1.3％;将此电化学核酸适配体吹干置于4℃冰箱内1周后，传感器的响应信号保留值为初始的92.0％，说明该传感器的稳定性良好。

用同一根电极重复组装4次测定1.0 ng/mL的AD，其RSD为2.4％;采用4根不同的玻碳电极同时组装后测定1.0 ng/mL的AD，其RSD为5.1％，说明该传感器的重现性良好。

图7 不同物质的响应对比图
Fig.7 Response comparison of different substrates
2.6 回收率与相对标准偏差
为考察该传感器的实用性与可靠性，以牛血清为基质，分别加标1.0，10.0，100.0 pg/mL的腺苷，对传感器进行了回收率实验，测得回收率分别为101.0％，97.0％，107.0％，RSD(n = 3)分别为4.7％，1.4％，2.5％。

表明该传感器的可
靠性较好。

3 结论
本文首先将腺苷适配体互补链和带末端羧基的DNA链修饰在金纳米粒子表面，并以DNA链的末端羧基为基础，通过酰胺反应将带有氨基的甲苯胺蓝标记在金纳米粒子表面，制备了甲苯胺蓝标记的DNA探针分子TB-S
2-GNPs-S
1。

然后以玻碳电极为基质，在电极表面电沉积一层金纳米颗粒，将其
作为适配体的固定基质，以Au-S键合作用将腺苷适配体固定到电极表面，通过其与互补链S
1的杂交，将探针分子固定在电极上，成功地构建了一种以TB为指示
剂检测腺苷的新型适配体生物传感器。

结合紫外可见光谱、激光粒度及电子显微镜等分析技术，对材料的吸收光波长、粒径和形貌进行了表征。

利用CV和EIS技术表征电极的组装过程，并用EIS和DPV技术对传感器的测试性能进行了研究。

研
究结果显示，该传感器显示了良好的抗干扰能力与稳定性，方法有望用于实际样品的测定。

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