滚环扩增技术的原理及其应用的研究

滚环扩增技术的原理及其应用的研究
张俊;曾照芳
【摘要】Rolling circle amplification ( RCA) is a recently developed isothermal nucleic acids amplification method . This method can not only amplify DNA and RNA directly, but also allow the enlargement of signal from target nucleic acids with the sensitivity up to one copy of nucleic acids molecule. As a result, the RCA technique plays great values and potentials in whole genome amplification, single nucleotide polymorphism, DNA chips, protein chips and so on.%滚环扩增是近年来发展起来的一种恒温核酸扩增方法.这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA,还可以实现对靶核酸的信号放大,灵敏度达到一个拷贝的核酸分子,因此,RCA技术在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等方面检测中具有很大的应用价值和潜力.
【期刊名称】《生物信息学》
【年(卷),期】2012(010)001
【总页数】3页(P12-14)
【关键词】扩增技术;滚环扩增;线性扩增;指数扩增;检测
【作者】张俊;曾照芳
【作者单位】重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016;重庆医科大学检验医学院,临床检验诊断学教育部重点实验室,重庆400016
【正文语种】中文
【中图分类】Q523+.8
滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)技术是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方式而建立的一种核酸扩增技术，它是在恒温下发生的一种DNA扩增技术。

在RCA反应中，当有环形DNA模板和聚合酶时，通过DNA聚合酶的作用，以环形DNA为模板进行复制，最后形成了一条与环形DNA 模板互补的重复序列的DNA单链。

RCA包括线性扩增与指数扩增两种形式。

线性RCA是指一条引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全互补)的线状DNA单链。

DNA的延伸可不断进行，产生的DNA链长可为亲代DNA单位长度的许多倍。

利用RCA检测靶序列一般有两种途径:一种直接扩增环形单链模板;另一种首先通过连接反应环化与模板链杂交的探针，再扩增已环化的探针，然后检测扩增信号，这种探针常称为锁式探针(Padlock probe)。

锁式探针的两端与靶核酸序列特异性互补，当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成，接下来的RCA反应也就无法进行，因此确保了DNA和RNA检测中的高特异性。

同时，锁式探针和靶序列的杂交会产生较稳定的拓扑结构，确保了杂交连接产物的稳定性。

线性RCA的产物序列在长度上连续分布，其凝胶电泳图呈一条宽弥散带。

线性RCA用于靶核苷酸扩增，仅限于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体，而且限制在小于200bp长度的环。

由于其单链扩增特性，扩增产物一端可始终连接在固相支持物的引物上，非常适宜于固相形式的微阵列局部特异信号的检测。

指数RCA技术的原理与线性RCA相同，在线性RCA的基础上，再增加一条与环状DNA序列完全一致的引物，该引物和第一次线性RCA产物的部分序列互补并
酶促延伸，同时置换掉下游杂交到扩增产物上其他拷贝段的引物，之后被置换掉的延伸产物又可以作为第一条引物的模板进行扩增，这样一来，扩增产物量在很短的时间内呈指数递增。

文献通常称其为超分支滚环扩增(hyper－branched rolling circle amplification，HRCA)或者分支扩增(ramification amplification，RAM)。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90% 以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1 000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

利
用RCA技术进行SNPs的检测时，首先要合成一条锁式探针，其两端的序列与检
测的模板互补，多态性位点设计在3ˊ端，中间序列为引入的无关序列，不同等位
基因型对应的寡核苷酸探针引入不同的无关序列，当有错配存在时，探针的连接反应就无法完成，接下来的RCA反应也就无法进行。

Su等利用RCA技术结合电化
学发光对p53的点突变进行检测，在野生型与突变型的比例达到10 000∶1仍然
能够检测出相应的突变，实验证明，该方法在检测人类基因组DNA的SNPs时有很高的检测效率[1]。

Li等运用固相RCA技术，其检测的灵敏度比传统的DNA杂交技术扩大了两个数量级，检测阈值可达到 3.6pM[2]。

Qi等在进行植物基因的SNPs研究时尝试应用少于60个核苷酸的环形探针，并以多次变性和连接循环增
加了环形探针的连接效率，环形探针长度的缩短不但降低了实验成本，还使降低了探测合成的错误率[3]。

由于HRCA在核酸序列检测过程锁式探针的环化和引物的结合同时控制较为困难，Taku研究构建了一种新的RCA的检测技术称为PG－RCA，这项技术的最大优点就是整个反应不需要加引物，其扩增反应所需的引物
是在反应过程中通过加入核酸内切酶自动生成而不但的累积，并且环形探针不但的结合从而产生信号的级联放大[4]。

传统的蛋白质芯片操作简单、特异性好，但是由于传统信号扩增技术的限制而无法
实现高灵敏度和高通量检测。

当样本加入到不同位置标记有不同特定抗体的蛋白质芯片的微阵列上后，样本中的特定抗原和相应某一位点的抗体A发生特异的抗原
抗体反应而被捕获，该抗原又可与加入的标记有引物的抗体B继续反应(即双抗体
夹心反应)，随即由抗体B上的引物引发滚环扩增反应，从而显著放大了发生一系
列反应的位点信号，从而达到检测要求。

Cheng等建立了类似的免疫滚环扩增方法，在双抗体免疫夹心的基础上通过在引物的5ˊ端标记生物素，通过亲和素与生
物素化的二抗连接，并加入滚环扩增反应组分对环状DNA模板进行扩增，然后是标记有量子点的探针与扩增产物原位杂交，最后进行电化学检测[5]。

Lee等尝试
使用适配子替代了传统的抗体并结合高灵敏度的RCA扩增，通过构建一个适配子—引物复合体从而避免了传统的核酸与抗体之间复杂的结合反应[6]。

由于适配子
结构简单、制备周期比抗体短并且可以大量的化学合成、价格低廉，因此，它为新型临床检测技术的开发提供了新的方向。

Yan等利用了纳米金能够同时结合蛋白
和核酸的特性，将用于RCA反应的DNA引物和抗体通过纳米金连接起来，由于
纳米金相对较大的表面积，因此可以同时固定50条左右的DNA引物，这样就形
成一个强度更高的信号扩增反应，其灵敏度可达到5aM，比传统的ELISA方法扩
大5个数量级，其特异度可达到1∶1010倍[7]。

近年来，RCA方法已被用于扩增大的环型DNA模板，例如质粒和噬菌体DNA，通过对pg数量级的微量模板进行几个小时的滚环扩增，可以得到mg数量级的高质量扩增产物，然后对产物进行磷酸化作用灭活未掺入的碱基，得到的产物可以直接进行测序，省去了传统方法中的连接转化、扩大培养以及提取分离等繁琐步骤。

与PCR相比，RCA技术具有许多技术优势:(1)高灵敏度。

RCA具有极强扩增能力，线性RCA的扩增效率可达105倍，而HRC的扩增效率可达到109倍，这一高灵敏度特性使其能够检测到单个拷贝本子[8]，扩增产物可以利用法学发光法、荧光
法及纳米金等进行检测，成本低廉;(2)高特异性。

利用锁式探针检测靶序列时，需
要探针5ˊ端与3ˊ端的两段识别序列与靶序列完全互补，因此可以区分单一位点的
不同模式，该方法非常适合SNP的检测;(3)高通量。

传统的核酸扩增技术如PCR
等由于扩增产物扩散进液相而不能积累扩增信号，因此都不能在芯片上进行扩增，而RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增[9]，另外RCA技术还能保持立体分析的多元性，即使同时分析检测许多目标分子也不会互相干扰;(4)操作方便。

一方面，RCA是一种恒温扩增，不需要特别的热循环仪器;另一方面，可以直接扩增特定的DNA或者RNA分子，实现信号放大，避免了检测RNA链时预先进行的逆转录过程。

RCA的检测也还存在一些不足:(1)锁式探针的成本问题。

实验中所涉及到的锁式探针的长度一般在80个碱基左右，合成的费用较高。

已有报道采用以连接序列为模板、特异性互补区序列为引物的PCR反应来合成探针，可实现60% ～70%探针
产物的正确合成和相应的连接效率[10]，当需要较多数量的锁式探针时，此法可以有效降低成本;(2)背景信号问题。

RCA过程中未成环的锁式探针和未与锁式探针结合的模板DNA或者RNA也可产生信号，可能降低检测的灵敏度。

目前采用的固
相RCA能够在一定程度上减少背景信号的产生，扩大检测范围;在液相RCA反应
中引入DMSO和T4基因结合蛋白，可以提高扩增效率。

此外使用ExonucleasⅠ和Exonuclease Ⅲ混合的酶反应液，能够在连接反应后有效地去除线性锁式探针
和未结合的模板DNA[11]。

(3)RCA的结果目前没有理想的质控指标，因此，要想发展成为普通的实验室诊断技术，还应在探针设计和实验室质控等方便做进一步的探索研究[12]。

滚环扩增技术在特异性、灵敏度、拓展性等许多方面都明显优于传统的核酸扩增方法，目前，该技术已在全基因组扩增、单核苷酸多态性、DNA芯片、蛋白质芯片等检测中展现出巨大的应用价值和潜力，伴随着其技术的日趋成熟，其应用范围还将会更加广泛。

若将其特性拓展到更广阔的临床检测领域中，对不易用传统常规临
床检验手段进行检测的病原微生物及疾病相关基因进行检测，将对临床疾病的诊断和治疗产生重大的影响，并将为人类进行蛋白质组学、基因组学的研究提供一个良好的技术支持平台，有利于人类对疾病的重新认识。

【相关文献】
[1] Qiang Su，Da Xing，Xiaoming Zhou.Magnetic beads based rolling circle amplification －electrochemiluminescence assay for highly sensitive detection of point
mutation[J].Biosensors and Bioelectronics，2010，25:1615 –1621
[2] Zhengping Li，Li Wei，Yongqiang Cheng，Longteng Hao.Chemiluminescent detection of DNA hybridization and single－nucleotide polymorphisms on a solid surface using target－primed rolling circle amplification[J].Analyst，2008，133:1164 －1168
[3] Xiaoquan Qi，Saleha Bakht，Katrien M.Devos，Mike D.Gale，Anne Osbourn.L－
RCA(ligation－rolling circle amplification):a general method for genotyping of single nucleotide polymorphisms(SNPs)[J].Nucleic Acids Res，2001，29:e116.
[4] Taku Murakami，Jun Sumaoka，Makoto Komiyama.Sensitive isothermal detection of nucleic－acid sequence by primer generation－ rolling circle amplification[J].Nucleic Acids Research，2009，37(3):e19
[5] Wei Cheng，Feng Yan，Lin Ding，Huangxian Ju，Yibing Yin.Cascade Signal Amplication Strategy for Subattomolar Protein Detection by Rolling Circle Amplication and Quantum Dots Tagging[J].Anal.Chem，2010，82，3337 －3342
[6] Joonhyung Lee，Kutay Icoz，Ana Roberts，Andrew D.Ellington，Cagri
A.Savran.Diffractometric Detection of Proteins Using Microbead－Based Rolling Circle Ampli?cation[J].Anal.Chem，2010，82，197–202
[7] Juan Yan，Shiping Song，Bing Li，Qingzhi Zhang，Qing Huang，Hua Zhang，Chunhai Fan.An On－Nanoparticle Rolling－Circle Amplification Platform for Ultrasensitive Protein Detection in Biological Fluids[J].small，2010，22(6):2520 －2525
[8] V .V .Demidov.Rolling－circle amplification in DNA diagnostics:the powder of simplicity[J].Expert Rev Mol Diagn ，2002 ，2(6):542－548
[9] 乔婉琼，周东蕊，杨耀，陆祖宏.滚环扩增原理及其在医药领域的应用[J].中国药科大学学报，2006，37(3):201 －205
[10] Bin Wang，Simon J.Potter ，Yiguang Lin，Anthony L，Cunningham，Dominic
E.Dwyer，Yuelong Su，Xuejun Ma，Yunde Hou，Nitin K.Saksena.Rapid and sensitive detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus by rolling circle
amplification[J].J Clin Microbiol，2005，43(5):2339 －2344.
[11] Szemes M ，Bonants P ，Weerdt M ，et al.Diagnostic application of padlock probes multiplex detection of plant pathogens using universal microarrays[J].Nucl Acid Res ，2005，33(8):70
[12] 李启明，马学军.RCA技术的应用及研究进展[J].中华实验和临床病毒学杂志，2006，2(20):99－100.。