Cobe spectra 血细胞分离机MNC程序与Auto PBSC 程序采集效果比较

血细胞分离机AutoPBSC程序与MNC程序
采集外周血干细胞的效果比较及影响因素分析
曾丰1魏世金1黄豪博1黄清华1林秋燕1范丽萍1黄惠炆1付丹晖1，2*
1福建医科大学附属协和医院输血科；2福建省血液病研究所血液科，福建福州350001
摘要：本研究旨在分析COBE Spectra血细胞分离机自动采集程序（AutoPBSC 程序）与半自动采集程序（MNC程序）在外周血干细胞采集中的效果及影响因素。

109例采集按对象不同分为患者自体组（患者）和异基因供者组（供者），通过比较采集物中干细胞数量与质量及采集程序特点，分别对两种采集程序在两组中的采集结果及影响因素进行分析。

结果表明在全血处理量基本相同的情况下，全组中两种程序采集物中MNC%与CD34+%、CD34+细胞数及血红蛋白含量差异无显著性（P＞0.05）；与MNC程序比较， AutoPBSC程序采集物中血小板混入少，采集物体积小，但抗凝剂用量多，采集时间长（P＜0.05）。

相关性分析显示：患者组两种程序采集物中MNC数（r=0.314,P=0.015）、CD34+细胞数（r=0.922,P=0.000）与采集前对应参数呈正相关，采集物CD34+细胞数与WBC 数（r=0.369,P=0.004）及MNC数（r=0.495,P=0.000）正相关；供者组Auto PBSC 程序采集物中MNC数与采集前呈正相关（r=0.896,P=0.000），MNC程序采集物中CD34+细胞数与采集前呈正相关（r=0.666,P=0.000）。

患者组Auto PBSC程序采集物中MNC数与CD34+细胞数男性显著高于女性（P＜0.05），年龄40岁以下显著高于年龄40岁以上（P＜0.05），而MNC程序年龄40岁以上患者采集的CD34+细胞数显著高于年龄40岁以下患者（P＜0.05）。

供者组仅MNC程序采集物中MNC 数与CD34+细胞数男性显著高于女性（P＜0.05）。

结论：在全血处理量相同时，患者自体和健康供者PBSC采集中两种程序收获的MNC纯度与CD34+细胞纯度及浓度高度一致但患者自体PBSC采集结果受年龄与性别影响较大。

关键词：外周血造血干细胞；采集；自体；异基因；AutoPBSC程序；MNC程
序
Analysis of the Efficiency and Influence Factors of PBSC Collection with Cell Separator ：comparison between AutoPBSC and MNC procedure
Abstract This study was aimed to analyze efficiency and influence factors of PBSC collection by an automatic (AutoPBSC procedure) and a semiautomatic apheresis procedure ( MNC procedure) of COBE Spectra cell separators. According to the different objects, 109 cases of apheresis were divided into autologous cohort (patient) and allogeneic cohort (donor), we made a comparison of the qunatity and quality of the collections and the characteristics of apheresis procedure, analysed the yields and influence factors of two cohorts with two kinds of procedures respectively. The results shows that the collections of two procedure in patients and donors which processed the similar blood volumes were insignificantly different in MNC%, CD34+ %, CD34+ cell counts and Hb concentration（P＜0.05）; the collections by AutoPBSC procedure had got fewer platelets, less product volumes whereas more ACD-A used, longer apheresis time in comparison with MNC procedure (P<0.05). Correlation analysis indicated that MNC（r=0.314,P=0.015）, CD34+cell counts（r=0.922,P=0.000）in collections were positive correlated with preahperesis in the autologus cohort by two procedures, CD34+ cell counts were correlated with WBC（r=0.369,P=0.004）and MNC（r=0.495,P=0.000）in collections; MNC（r=0.896,P=0.000）was positive correlated with preahperesis by AutoPBSC procedures and CD34+cell counts （r=0.666,P=0.000）by MNC procedure in the allogeneic cohort. Male had got more MNC and CD34+ cell counts than female (P<0.05),age≤40 had got more MNC and CD34+ cell counts than age>40 (P<0.05) in patients by AutoPBSC procedure; age＞40 had got more CD34+cell counts than age≤40 by MNC procedure(P<0.05). Only male had got more MNC and CD34+ cell counts than female (P<0.05) by MNC procedure in donors. Concluded: With same amount of blood processing, the PBSC collections from autologous patients and allogeneic donors had got a high degree of uniformly in purity of MNC and purity and concentration of CD34+ cell counts by two procedure, whereas sex and age imposed more influence on PBSC collection in autologous.
Key words peripheral blood stem cell; apheresis; autologous; allogeneic ; AutoPBSC procedure; MNC procedure
外周血造血干细胞移植（peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT）因其造血干细胞采集方便、无需全身麻醉、移植后造血功能及免疫功能重建快等优点，已成为治疗某些恶性血液性疾病、实体瘤、遗传性及免疫性疾病的可靠选择[1]。

外周血造血干细胞（peripheral blood stem cell，PBSC）的数量和质量是PBSCT成功的关键因素[2]。

目前国内外对不同血细胞分离机PBSC采集效果及影响因素的报道较多，对COBE Spectra血细胞分离机6.1版Auto-PBSC程序与MNC程序在PBSC采集效果及影响因素研究末见报道，本研究回顾性分析我科在2010年11月份至2013年11月份应用COBE Spectra 血细胞分离机中的
MNC程序和AutoPBSC程序对109例患者自体和健康供者进行211次PBSC采集，通过比较采集物中PBSC的数量与质量差异，探讨AutoPBSC程序和MNC 程序在PBSC的采集中的效果及影响因素。

资料及方法
病例资料
2010年11月至2013年11月间，我科应用COBE Spectra血细胞分离机的MNC及AutoPBSC程序共采集包括患者自体和异基因供者PBSC109例211次。

其中男55例，女54例；中位年龄43岁（18～67岁）。

患者61例，其中多发性骨髓瘤（MM）13例、霍奇金淋巴瘤（HL）8例、非霍奇金淋巴瘤（NHL）15例、急性早幼粒细胞白血病（APL）10例、急性单核细胞白血病（AMoL）7例、急性粒细胞白血病部分分化型（M2）5例、其它疾病3例；异基因供者48例，其中8例为父子、母子间的半相合移植，其余40例均为同胞供者移植。

病例资料按采集程序及患者/供者不同分两组四类统计（表1）。

Table1:Characterisitics of Patients and donors
AutoPBSC procedure MNC procedure
Patients Donors Patients Donors
Cases/Times 28/59 13/26 33/65 35/61
Age 43(18-67) 40(22-62) 47(23-63) 41(19-64)
Men/Women 15/13 6/7 16/17 18/17 Diagnosis:
Hodgkin lymphoma 3 5
Non-HL 5 10
Multiple myeloma 6 7
APL 7 3
M2 1 4
AMoL 5 2
other 1 2
仪器设备及采集程序
2010年11月至2012年12月期间应用COBE Spectra血细胞分离机（美国
Terumo BCT公司）AutoPBSC程序（版本6.1），AutoPBSC专用采集管道；2012年12月至2013年11月期间使用MNC程序（版本6.1），MNC专用采集管道。

ACD-A血液保存液（500ml/袋，广东费森尤斯卡比医疗用品公司产品）；一次性静脉穿刺针（17G，广州贝恩医疗用品公司）；500ml塑料袋装生理盐水（福州海王医药有限公司）；全自动高频热合封口机（日本泰尔茂）等。

采集前动员
健康供者每日皮下注射重组人类粒细胞集落刺激因子（G-CSF，特尔金）5～10μg/(kg.d)，于注射后第4天开始采集PBSC。

患者化疗后每天注射G-CSF 300μg，每日监测外周血白细胞（WBC）数，当WBC下降至低谷并开始回升至2～5×109/L时开始采集。

AutoPBSC程序PBSC采集方法
使用6.1版软件的COBE Spectra血细胞分离机和双级充填盘，按照采集液流径指示膜安装AutoPBSC管路，初始化后输入供者身高、体重、HCT、WBC 计数、MNC%，设定循环血量10000ml，全血流速40～75ml。

采集PBSC的收获量3～5ml，追赶量4ml,根据WBC数设定每800～1600ml收获一次，采集物终体积为（收获量+追赶量）×收获次数。

连续采集2～3天，以达到预期PBSC为准。

MNC程序PBSC采集方法
选用单级充填盘，基本步骤同AutoPBSC程序，初始化后输入供者身高、体重、HCT，设定循环血量10000ml，全血流速40～75ml。

MNC程序在采集界面建立时需操作人员根据经验，通过目测比色法手控调节血浆泵流速进行PBSC采集，采集物终体积为采集界面建立后至总循环血量结束所需时间对应的毫升数，约为110ml～200ml。

连续采集1～3天，以达到预期PBSC为准。

静脉通路
COBE Spectra血细胞分离机是双针式管路，需建立两条静脉通路，健康供者一般选用外周肘部静脉，采血端使用一次性17G采血针，回输端使用18G静
脉留置针；患者静脉通路在化疗后遭到不同程度的破坏，所以采集前置12F的三腔血透管，采集完成后拔除。

观察指标
全血处理量、采集时间、抗凝剂用量、采集物体积，采集物中WBC数、单个核细胞（MNC）数、MNC%、CD34+细胞数、CD34+%、混入血小板数、混入血红蛋白量。

PBSC检测方法
供者血常规及采集物的细胞数及单个核细胞测定应用Sysmex-XE2100血细胞分析仪结合人工涂片分类计数, CD34+细胞应用库尔特FC500流式细胞仪检测。

统计分析
采用EXCEL2003及SPSS19.0统计软件进行T检验及相关分析，所得数据用X±SD表示，p＜0.05为差异有统计学意义。

结果
两种采集程序PBSC采集结果比较
在患者/供者两组中，与MNC程序比较，Auto-PBSC程序中的全血处理量差异无统计学意义（P＞0.05），但采集物的体积明显减少，抗凝剂用量显著增多，采集时间明显延长（P<0.05）。

在患者组，与MNC程序比较，Auto-PBSC程序中采集物中的CD34+细胞的百分比、浓度、细胞总数及Hb含量无显著性差异（P＞0.05），MNC浓度明显增高，采集物中血小板混入数明显降低（P<0.05）。

供者组两种程序的PBSC采集结果与患者组相似（表2）。

Table 2:Harvest details of Auto-PBSC and MNC procedure
Patients Donors
Auto-PBSC(n=59) MNC(n=65) Auto-PBSC(n=26) MNC(n=61)
Total vol.of blood processed(L) 9.78±0.99 9.82±0.77 9.51±1.23 9.49±1.20
Volume of product (ml) 67.34±21.46 135.053±18.98* 86.85±16.71 136.87±28.34*
Apheresis time (min) 208±44 159±20* 221±40 159±42*
ACD-A used (ml) 772±95 710±70* 783±108 687±90*
WBC×109/L 238.23±82.29 199.30±91.32* 219.62±67.80 222.83±84.78
MNC(%) 48.64±22.96 52.78±21.57 70.28±21.32 61.23±19.37
MNC×109/L 115.38±70.05 94.77±41.48* 157.39±75.51 133.98±59.58
MNC×1098.10±6.18 12.64±5.70* 13.76±7.90 17.77±8.02*
CD34+(%) 2.10±4.55 2.70±3.19 0.65±0.46 0.69±0.68
CD34+×109/L 6.04±14.64 6.59±9.72 1.33±0.89 1.50±1.61
CD34+×106 6.31±15.68 8.53±12.35 1.17±0.89 1.89±1.84
Hb g 0.25±0.27 0.25±0.27 0.14±0.15 0.27±0.37
Platelets×106 9.70±7.64 13.29±10.29* 21.16±11.20 55.01±45.24*
*P<0.05,compared with AutoPBSC procedure
PBSC采集的相关性分析
在患者组，Auto-PBSC程序和MNC程序采集物中CD34+细胞数采集前后呈高度相关（R=0.922，R=0.666），MNC数采集前后分别为中或低度相关（R=0.314 ，R=0.279），WBC数采集前后分别为低或中度相关（R=0.231，R=0.371）（表3）；Auto-PBSC程序采集物中CD34+细胞数与WBC数及MNC数呈中度相关（R=0.369，R=0.495）；MNC程序中仅采集物中CD34+细胞数与WBC数呈中度相关（R=0.599）（表4）。

Table 3:Main parameters correlation between pre-apheresis and collection by Auto-PBSC or MNC procedure in Paitents
Auto-PBSC MNC
n Pre-apheresis/collection R value n Pre-apheresis/collection R value WBC×109/L 59 18.84±21.80/238.23±82.29 0.231 65 13.74±10.45/199.30±91.31 0.371 MNC(%) 59 19.05±11.21/48.64±21.96 -0.256 65 25.53±16.02/52.79±21.57 0.053 MNC×109/L 59 2.26±2.37/115.38±70.05 0.314 65 2.80±2.01/94.79±41.48 0.279 CD34+(%) 36 0.59±1.24/2.79±5.66 0.93 4 2.49±2.68/3.20±3.15 0.97 CD34+×109/L 36 0.27±0.67/8.31±18.27 0.922 4 0.24±0.25/7.98±8.64 0.666
Table 4: correlation analysis of CD34+and WBC/MNC by Auto-PBSC and MNC procedure in Paitents’collection
n Auto-PBSC R value n MNC R value WBC/CD34+×109/L 59 238.23±82.29/8.31±18.27 0.369 65 199.30±91.31/7.98±8.64 0.599 MNC/CD34+×109/L59 115.38±70.05/8.31±18.27 0.495 65 94.78±41.48/7.98±8.64 0.001
在供者组，Auto-PBSC程序中MNC数和WBC数采集前后呈高、中度相关(R=0.896, 0.502)，CD34+%及CD34+细胞数采集前后无相关（R=0.003）；MNC程
序中WBC数采集前后呈低度相关（R=0.189）， CD34+%百分率及CD34+细胞数采集
前后呈中度相关（R=0.457，0.666）（表5）；两种程序采集物中CD34+细胞数与WBC数、MNC数之间均呈低度相关（表6）。

Table 5:Main parameters correlation between pre-apheresis and collection using Auto-PBSC and MNC procedure in Dornors
Auto-PBSC MNC
n Pre-apheresis/collection R value n Pre-apheresis/collection R value WBC×109/L 26 43.34±10.57/219.62±67.80 0.502 61 36.11±10.21/222.83±84.78 0.189 MNC(%) 26 13.96±5.39/70.28±21.33 0.889 61 11.90±6.37/61.23±19.37 0.133 MNC×109/L 26 5.93±2.58/157.39±75.51 0.896 61 4.24±2.86/133.98±59.58 0.044
CD34+(%) 22 0.22±0.22/0.73±0.45 0.039 20 0.15±0.09/0.84±0.71 0.457
CD34+×109/L 22 0.93±1.03/14.77±8.64 0.003 20 0.57±0.45/16.31±14.69 0.666
Table 6: correlation analysis of CD34+and WBC/MNC by Auto-PBSC and MNC procedure in Donors’collection n Auto-PBSC R value n MNC R value WBC/CD34+×109/L 26 219.62±67.80/14.77±8.64 0.224 61 222.83±84.78/16.31±14.69 0.255 MNC/CD34+×109/L26 157.39±75.51/14.77±8.64 0.117 61 133.98±59.58/16.31±14.69 0.229
性别对PBSC采集的影响
在患者组，Auto-PBSC程序采集物中CD34+%、CD34+细胞数、MNC数及WBC数
男性显著高于女性，差别具有统计学意义（P<0.05），而MNC程序中性别对PBSC
采集无明显影响（表7）。

在供者组，MNC程序采集物中CD34+细胞数、MNC数与
WBC数男性供者显著高于女性供者，差别有统计学意义（P<0.05 or P<0.01）；
Auto-PBSC程序中仅MNC数男性供者显著高于女性，差别有统计学意义（P<0.05）
（表8）。

Table 7:Influence of sex on apheresis by AutoPBSC and MNC procedure in Patients
Auto-PBSC MNC
M/F(n=27/30) M/F(n=31/35)
WBC×109/L 262.36±69.80/214.90±16.02* 206.65±92.46/192.60±91.13
MNC(%) 53.10±21.59/44.33±23.78 53.68±20.52/51.98±22.75
MNC×109/L 141.46±73.15/90.18±57.54** 97.59±39.96/92.22±43.26
CD34+(%) 3.06±5.35/1.13±3.50* 2.30±2.69/3.07±3.58
CD34+×106/L 7.94±16.39/2.65±9.97* 7.56±11.42/9.41±13.24
*P<0.05,**P<0.01,compared with male
Table 8:Influence of sex on apheresis by AutoPBSC and MNC procedure in Donors
Auto-PBSC *MNC
M/F(n=12/14) M/F(n=34/27)
WBC×109/L 243.91±59.52/198.80±69.51 248.70±87.92/190.26±69.29*
MNC(%) 75.08±18.80/66.17±23.15 63.46±15.95/58.43±22.97
MNC×109/L 188.74±73.16/130.52±68.92* 154.79±59.73/107.77±41.82**
CD34+(%) 0.65±0.18/0.65±0.62 0.88±0.80/0.44±0.38**
CD34+×109/L 15.95±6.52/10.96±10.15 2.49±2.18/1.12±0.83**
*P<0.05,**P<0.01,,compared with male
年龄对PBSC采集的影响
在患者组，Auto-PBSC程序采集物中CD34+%与CD34+细胞数在年龄≤40岁的患者中显著高于40岁以上的患者，差别有统计学意义（P<0.05）；MNC程序采集物中CD34+%及CD34+细胞数在年龄>40岁患者中显著高于40岁以下的患者，差别有统计学意义（P<0.05）（表9）。

在供者组，仅Auto-PBSC程序中MNC%在年龄≤40岁供者中明显高于40岁以上供者（P<0.01）（表10）。

Table 9:Influence of age on apheresis by AutoPBSC and MNC procedure in Patients
Auto-PBSC MNC
≤40/>40(n=25/33) ≤40/>40(n=35/31)
WBC×109/L 234.61±88.63/241.08±78.22 196.86±89.56/203.09±93.33
MNC(%) 50.46±23.51/47.21±22.79 52.55±23.03/53.32±19.82
MNC×109/L 120.24±73.63/111.56±68.00 95.49±44.09/95.47±39.22
CD34+(%) 3.69±6.59/0.88±0.20* 1.79±1.69/3.44±4.02*
CD34+×109/L 10.26±19.81/1.53±2.57* 3.44±4.02/8.93±11.35*
*P<0.05, compared with age≤40
Table10:Influence of age on apheresis by AutoPBSC and MNC procedure in Donors
Auto-PBSC MNC
<40/>40(n=14/12) <40/>40(n=34/27)
WBC×109/L 209.09±81.83/231.90±47.22 231.04±80.28/211.02±91.25
MNC(%) 82.07±10.36/56.53±22.88** 63.10±18.48/58.54±20.66
MNC×109/L 173.35±74.88/138.77±75.02 144.92±58.61/118.22±58.53
CD34+(%) 0.68±0.39/0.61±0.55 0.68±0.57/0.69±0.82
CD34+×109/L 13.77±8.48/12.66±9.65 1.97±1.79/1.76±1.94
**P<0.01, compared with age>40
不良反应观察
在PBSC采集过程中， ACD-A抗凝剂与血中游离钙离子结合易产生低钙血症。

因此在采集过程中给予口服10%葡萄糖酸钙50ml可防止低钙发生。

109例供者在PBSC采集过程中均未出现严重的不良反应，其中22例供者（均为女性）在采集过程中出现程度不一的低钙血症，表现为口唇、四肢或面部发麻，少数供者出现手脚抽搐症状，经口服或静脉推注10％葡萄糖酸钙、部分供者间断口服氯化钾溶液后症状缓解或消失，均顺利完成采集。

讨论
外周血造血干细胞移植（peripheral blood stem cell transplantation, PBSCT）已成为多种恶性血液病治疗的重要手段，获得足够的外周血干细胞是PBSCT成功的关键。

目前临床用于PBSC单采的血细胞分离机主要有COBE Spectra、Baxter CS 3000 plus和Haemonetics MCS+，多数研究结果认为COBE Spectra在PBSC 采集效果上更有优势[3-7]。

COBE Spectra血细胞分离机有半自动采集程序（MNC 程序）和全自动程序采集程序（Auto-PBSC程序），不同版本的采集程序对PBSC 的采集效果明显不同，Del Fante C等比较了半自动COBE Spectra MNC程序与全自动Spectra Optia 5.0版MNC程序单个核细胞的采集效率，结果显示全自动Spectra Optia 5.0版MNC程序能收获更高质量的单个核细胞且采集时间短[8]。

Rowley等比较了6.0版AutoPBSC与4.7版MNC程序PBSC的采集效果，结果显示两程序均可收获临床满意的CD34+细胞数，但4.7版MNC程序采集物中CD34+细胞收获率明显高于６.0版AutoPBSC程序且采集时间明显缩短[9]。

本研究回顾性分析了6.1版Auto-PBSC程序与MNC程序在患者自体和健康供者109例211次PBSC采集的效果。

结果显示：在全血处理量相同情况下，患者/供者组在两种程序采集物中MNC的百分率无明显差异，提示两种程序收获的单个核细胞纯度相似；CD34+细胞百分率及浓度无明显差异，提示在患者/供者
组中两种程序干细胞采集效果相同。

两组采集结果均显示Auto-PBSC程序采集物的体积小、混入的血小板更少，提示该程序采集纯度更高、血小板减少的风险更低，对于需要PBSC冻存的患者自体，采集物细胞纯度高且体积小能减少DMSO 的用量，有利于冻存和复苏，减少在自体造血干细胞回输时出现不良反应的机率[10]。

相较Auto-PBSC程序， MNC程序采集时间和抗凝剂用量明显减少，分析认为与两程序采集的原理不同有关。

对于健康供者，MNC程序较短的采集时间与较少的抗凝剂用量将降低采集风险、让供者更易于接受且混入较多血小板的采集物立即回输给受者有助于减少受者血小板的输注。

PBSC主要存在于MNC细胞群体中，故采集前外周血常规检测与CD34+细胞计数对把握采集时机和预测采集效果具有重要意义。

有研究显示采集物中CD34+细胞水平与采前CD34+细胞数呈明显正相关[11]，而与采前WBC数、MNC数及Hct无显著相关[12]。

本研究对资料完整的患者/供者采集前后及采集物中多个参数进行相关性分析，结果显示患者两种程序采集前后CD34+%及CD34+细胞数呈高度相关（R＞0.9），提示患者自体PBSC采集前CD34+细胞数高可收获到较高的干细胞数。

采集物中MNC数与采集前呈中度相关，提示临床可将MNC数作为患者自体动员后采集时机选择的指标；供者两种程序采集前后各参数相关性表现不一致，AutoPBSC程序采集物中MNC数与采集前呈高度相关，而MNC程序采集前后CD34+细胞数呈高度相关，考虑可能与异基因供者干细胞动员效率有关，有待于进一步证实。

影响PBSC采集的因素众多，其中关于性别和年龄对PBSC采集的影响报道较多，但研究结果不尽相同。

Rinaldi等研究显示男性采集结果优于女性[13,14]，张曦等分析结果显示性别对采集结果影响无差别[15]。

本研究结果显示患者自体组的AutoPBSC程序和异基因供者组MNC程序男性采集结果显著高于女性，提示
对于不同供者选择不同的采集程序可使采集效率最大化。

年龄是影响采集结果的另一重要因素，Richa研究显示当供者年龄大于50岁时，干细胞采集效率显著下降，CD34+细胞数明显减少[16]；Yang报道显示年龄对采集效率没有影响[17]。

本研究结果显示患者自体组采集物中CD34+细胞数受年龄影响较大而异基因供者组干细胞采集结果与年龄无关。

外周血干细胞采集过程中可能会出现枸椽酸盐中毒等不良反应[18]。

因此采集过程中要注意ACD与全血的比例，在完成一个循环血量的采集后，可适当降低抗凝剂比例从而减少ACD的用量以降低不良反应发生机率。

本研究在采集PBSC 过程中发生的几例不良反应均为女性，提示在采集过程中对女性患者/供者要提早且足量补充钙剂，密切观察其临床反应，及时对症处理，减少不良反应的发生。

综上所述，在全血处理量相同时，COBE Spectra 血细胞分离机AutoPBSC 程序与MNC两种采集程序在患者自体与健康供者PBSC采集中单个核细胞收获的纯度与CD34+细胞纯度与浓度高度一致，但患者自体PBSC采集结果受年龄与性别影响较大。

临床应用中应根据不同采集程序的特点及不同供者选择合适的采集程序以达到采集效率最佳的效果。

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