海洋生物技术

绪论
一．海洋生物技术定义：运用海洋生物学与工程学的原理和方法，利用海洋生物或生物的代谢过程生产有用物质或定向改良海洋生物遗传特性的综合科学技术。

二．重点发展领域：
1.发育与生殖生物学基础
2.基因组学与基因转移
3.病原生物学与免疫
4.生物活性及其产物
5.海洋环境生物技术
三．最新研究进展：
动物细胞培养
一、细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

二、细胞培养基本过程：取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。

将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。

悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，成为细胞贴壁。

当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。

此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。

再配成一定浓度的细胞悬浮液。

另外，原代培养就是从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。

当细胞从动植物中生长迁移出来，形成生长晕并增大以后，科学家接着进行传代培养，即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。

通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞称为细胞株。

当培养超过50代时，大多数的细胞已经衰老死亡，但仍有部分细胞发生了遗传物质的改变出现了无限传代的特性，即癌变。

此时的细胞被称为细胞系。

三、原代培养：从供体取得组织细胞后在体外进行首次培养
四、传代培养：即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖
五、细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞
六、细胞系：原代培养的细胞顺利传至40--50代，并保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞成为细胞系
动物细胞融合技术
1.细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。

基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

2.融合方法包括：生物法用灭活的仙台病毒(Sendai virus），化学法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG）和物理法如电脉冲，振动、离心、电激等。

3.主要用途：制造单克隆抗体
4.意义：突破有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能
5.选择方法: 荧光标记；选择性培养基；遗传标记
6单克隆抗体的制备
抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体制备
答：先提取病毒粒子---分离出囊膜蛋白----作抗原免疫小鼠---与骨髓瘤细胞杂交---细胞融合---螯虾动物模型筛选
细胞核移植技术
一.概念：通过显微操作,将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。

以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种
二.受体细胞为什么选用卵母细胞？
答：卵细胞体积大易操作，而且决定细胞向某一方向进化的初始信息存在于卵细胞中
三为什么有时在进行核移植时不是取供体细胞核进行核移植，而是将整个供体细胞全部注入受体细胞中?
答：保证供体核不被破坏，使遗传物质不被破坏
.四、在体细胞的细胞核移植到手提卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？
答：为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细
胞。

在供体细胞的细胞核至受体细胞前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。

五、提供细胞核为供体——常为鱼的囊胚或体细胞
去核的卵子为受体——鱼的成熟卵细胞
六、卵子在接受供体核之前，先要被激活以获得发育能力（鱼卵挤入水中即被激活）
受体成熟卵刚产出时，供体受精卵刚好发育到囊胚期。

供受体配合方法：可用超低温保存供体囊胚细胞，用温度控制供体受精卵的发育速度。

七、卵和早起胚胎的细胞操作的前处理。

答：卵膜的去除：不管是未受精卵还是受精卵，一接触水即吸水，卵膜和卵的表面分离，很
容易用镊子剥去，也可以用蛋白酶消去。

无卵膜的培养：除去卵膜的卵抵抗物理冲击能力很弱，所以应尽可能不要去移动它。

八、鱼类核移植的应用？
答：
1.培养新品种——核杂种
2.冲破远缘杂交难以进行和杂交后代不育的屏障
3.保持并复制优良个体的基因型
4.产生雄核纯合二倍体
5.基础研究
海洋动物染色体工程
一．鱼类染色体标本的制备：选择合适的鱼细胞，用适量的秋水仙素处理，低渗处理，离心，用现配的固定液固定，然后吸取细胞培养液向预冷的载玻片悬滴，盖上盖玻片，观察。

二．多倍体鱼的特点：1.巨型性2.速生性 3.增强抗逆性4.生理生化方面变化明显
三．诱导多倍体的方法：
1.生物方法：远缘杂交核移植细胞融合
2.物理方法：温度休克法（热休克，冷休克）静水压法
3.化学方法：利用秋水仙素，细胞松弛素
四．多倍体在水产养殖上的应用：
1. 控制过度繁殖
2.提高生长速度
3.延长鱼类寿命
五．甲壳动物多倍体育种的困难：
1.处理时间难确定
2.抱卵特性对诱导和发育有不利影响
五、转基因技术 就是利用实验手段, 将特定外源基因导入早期胚胎的细胞内, 由此整合到
染色体上, 并通过生殖细胞亲代传递给子代的动物, 这类被整合了外源基因的新动物被称为转基因动物。

1.1 受精卵原核显微注射法
受精卵原核显微注射法以单细胞期受精卵为靶细胞，借助显微操作仪，将构建的载体DNA直接注入到受精卵的原核中，并将受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育。

通过DNA在复制或修复过程中造成的缺口，把外源DNA整合到胚胎基因组中，获得转基因动物个体。

1982 年，Palmiter成功的将大鼠生长激素基因与小鼠金属硫蛋白I 基因启动子相连接，然后将融合基因注入小鼠雄原核，成功研制出了著名的
“超级小鼠”( super mouse)[4]。

按照转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊都相继成功。

受精卵原核显微注射法是哺乳动物最常见的转基因方法,效果稳定,导入时对外源基因的长度限制小，可向动物原核内导入250kb左右的DNA片段，而且不经嵌合体途径便可直接获得纯系。

但该方法操作复杂，转基因效率低，导入外源基因的拷贝数无法控制，转基因为单复本或由几千复本首尾串联成多联体，而且外源基因随机整合到基因组中，导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入突变，有的造成严重的生理缺陷。

1.2 反转录病毒感染法
此方法是把重组的逆转录病毒载体, 包装成高滴度的病毒颗粒去感染卵裂期胚胎, 于是携带外源基因的逆转录DNA 可以在感染过程中, 整合到宿主细胞的染色体上, 使这种细胞具有新的遗传性。

1974年最早把猿猴病毒40 ( SV40)注入小鼠囊胚中,得到部分体组织含有SV40DNA的嵌合体小鼠[5]。

反转录病毒感染法方法简单、效率高，外源DNA在整合时不发生重排，单位点、单拷贝整合，并且不受胚胎发育阶段的限制。

但携带外源基因的长度不能超过15kb；载体病毒基因有潜在的致病性，携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞过程中有可能激活受体细胞DNA 序列上的原癌基因或其它有害基因，威胁受体动物的健康安全。

1.3 胚胎干细胞法
此方法先体外培养ES细胞，利用电穿孔等基因转移技术将载体DNA 转入ES细胞后，经过筛选和鉴定，得到符合设计要求的基因组修饰，再将所获得的ES细胞经过囊胚腔注射等与受体囊胚细胞混合，并移植入假孕母体子宫继续发育生产嵌合体动物。

当胚胎干细胞分化为生殖干细胞时外源基因可通过生殖细胞遗传给后代，在第二代获得转基因动物。

该法优点是可对阳性细胞选择，实现外源DNA的定点整合。

但第一代是嵌合体，获得转基因动物的周期较长。

目前试图把胚胎干细胞的细胞核移入去核的受精卵中来获得非嵌合体[6] 。

1.4 精子载体法
该方法由Brackett最早提出，其要点是利用哺乳动物的获能精子能结合外源DNA的特性，通过受精过程把外源DNA 导入受精卵，获得转基因动物[7]。

该方法简单，转基因效率高。

但效果不稳定，外源DNA分子可能会受到受精液中内切酶的作用而影响整合后的功能。

Anthony等[8]尝试了一种新方法：预先将小鼠精子进行破膜处理，再与外源基因共孵育1 min，然后将精子的头部显微注入MⅡ期的小鼠卵母细胞，在出生的后代小鼠中转基因阳性率可达20%以上。

该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA穿过外膜吸附于内膜，更有益于转基因动物的获得。

1.5 细胞核移植法
细胞核移植法用外源DNA对培养的体细胞或胚胎干细胞进行转染，然后选择阳性细胞作核供体，通过细胞核移植，获得转基因动物。

1997年英国PPI公司与罗丝林研究所的科学家联手通过体细胞核移植技术制作了转基因绵羊[9]。

毫无疑问该法是非常理想的转基因手段，因为它可与基因打靶技术结合，实现外源基因的定点整合，消除外源DNA 随机整合带来的负作用;转基因效率可达100%，大大降低转基因家畜的生产成本。

但这种方法的广泛应用还依赖于体细胞克隆技术的发展，目前还难以实现。

1.6 腺病毒载体法
腺病毒是一种线性双链DNA无包膜病毒，该病毒感染细胞时，可以将DNA整合进宿主的染色体组。

该法优点是腺病毒易制备，感染效率高（可达100%），对于宿主动物安全；复制缺陷型的腺病毒载体可以使外源基因成单拷贝整合。

但存在免疫原性、对受体细胞选择的非特异性等暂时限制了该技术的大规模应用。

1.7 脂质体介导法
该法将磷脂、胆固醇或其他脂类的乙醚溶液与DNA混合，利用高温蒸发或减压或超声处理得到脂质体小泡—DNA被包裹于脂质体膜内部，这一结构可以与细胞膜融合，被细胞内吞而进行基因转移。

脂质体基因转移的效率很高，多种脂质体已经达到商品化。

1.8 基因打靶
基因打靶通常是把含有已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因进行同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。

1988 年Mansour首次采用该技术使转移基因在体内的定点整合成为现实, 产生了敲除特定基因的转基因小鼠(Knockout小鼠)。

此方法的优点在于能够进行基因的定点整合，避免了随即整合的缺点。

其缺点是产生的串联重复序列不稳定, 能自发进行二次同源重组。

1.9 原始生殖细胞技术
此法利用精原干细胞的既能自我更新维持自身群体数量恒定，又能定向分化成生殖细胞进而产生精子的特性，使外源基因感染精原干细胞，让其产生能够稳定遗传的配子进行自然交配，从而产生转基因动物。

二、转基因动物的基本操作步骤
1 获取目的基因
2 将目的基因与运载体结合
3 将目的基因导入受体细胞
4 目的基因的检测
三、海水鱼类基因工程研究内容
1、分离和克隆海水鱼类中的有用基因
2、筛选使用海水鱼类基因克隆和表达的载体及表达体系
3、利用转基因技术，将外源基因导入海水鱼中，培育性状优良的转基因海水鱼类品系。

四、海水鱼类基因工程应用
1、改良养殖性能
2、生产医药生物制品
3、培养新型观赏鱼类
海洋活性物质
一．海洋活性物质：是指海洋生物体内含有的对生命现象具有影响的微量或少量物质，主要包括：海洋药用物质，生物信息物质，海洋生物毒素产生物，功能材料等。

二．海洋活性物质特点：种类繁多结构特异活性强资源有限，含量一般很少
三．海洋活性物质应用：
1.为海洋生物活性物质基因的分离，研究和保存提供了便利条件
2.有助于解决生物活性物质的资源有限问题，实现可持续发展
3.成了推进海洋药物产业化的首选技术
遗传标记
一、概念：指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。

在重组实验中多用于测定重
组型和双亲型。

二、遗传标记包括形态学标记(性状标记）、细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记和分子
标记五种类型。

优缺点：遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种
遗传特性。

它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基
因突变型均可作为遗传标记。

形态学标记、细胞学标记、生化标记、免疫学标记等一直被广泛应用，然而这些标记都无法
直接反映遗传物质的特征，仅是遗传物质的间接反映，且易受环境的影响，因此具有很大的
局限性。

DNA分子标记直接反映DNA水平上的遗传变异，能稳定遗传，信息量大，可靠性高，消除
了环境影响
三、遗传标记在水产育种上的应用
对水产动物的遗传多样性，近亲繁殖，种类，和品系鉴定以及遗传连锁图谱的建立有重要作
用
如利用RAPD分子标记技术筛选水产动物种间鉴别标记，为水产动物的分子标记辅助选育，
种质资源保护和遗传性状选育提供技术支撑；利用RFLP技术对mtDNA进行分析；利用SSR
标记进行水产动物抗病育种的选育等。

四、DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对
较短的DNA片段。

2003年，加拿大动物学家Paul Hebert最早提出了DNA条形码的概念。

2011
年，DNA条形码已经成为生态学研究的重要工具。

DNA条形码不仅用于物种鉴定，同时也帮
助生物学家进一步了解生态系统内发生的相互作用。

Kress等（2005年）和Taberlet等（2007年）提出了理想的DNA条形码标准：（1）具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小；
（2）有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；
（3）片段足够段，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增
生命条形码联盟（CBOL）阐述了DNA条形码的优点：
1、以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变。

较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。

2、可进行非专家物种鉴定。

3、准确性高。

4、通过建立DNA条形码数据库，可以一次性快速鉴定大量样本。

五、功能基因组学又往往被称为后基因组学（Postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。