黄酮含量的测定方法
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黄酮含量的测定方法
1、对照法
1）
①对照品制备：精密称取芦丁对照品20.8mg，置于100m l容量瓶中，加70%乙
醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。
②样品溶液制备
精密称取样品0.50g，精密加入70%乙醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，称定重量，用70%乙醇补足减失重量，即得。
③标准曲线的制备
精密称取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml，分别置于25ml比色管中，加70%乙醇10ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加1mol/L氢氧化钠溶液10ml，加70%乙醇置刻度，摇匀，放置15分钟。
各取10ml置于50m l容量瓶中，用70%乙醇稀释至刻度。
在510nm的波长下测定吸光度。
2）
①样品溶液的制备：
分别精确称取80℃恒温干燥的样品用50%甲醇回流提取，料液比1：15,提取两次，每次30mi n，将两次提取液合并浓缩至一定体积，用30%甲醇定容至50ml 容量瓶中。
从其中取出12ml溶液放入100ml容量瓶中，稀释至刻度，再从100m l 容量瓶中取出1.5ml溶液，放至10ml容量瓶中，定容，为待测样品液Ⅰa和Ⅱa。
②最大吸收波长的选择：分别作样品液Ⅰa、Ⅱa及芦丁标准品的吸收曲线，均在350nm 处有一强吸收，因此选择350 nm为测定波长。
③标准曲线的制定：
精密称取芦丁对照品10.3mg，用少量30%乙醇溶解后，转移至50m l容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。
分别精密量取2ml、3ml、4ml、5ml、6ml芦丁溶液置于100ml 容量瓶中，于350 nm 波长处测定吸光值，以芦丁空白为参比，以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，提示在4.12～12.36mg／103ml浓度之间，吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。
④含量测定结果：
分别吸取2．2．1中Ⅰa和Ⅱa待测样品液各适量于石英比色池中，按标准芦丁一吸光度测定法，以样液空白参比，于350nm波长下测定吸光值，计算各提取液中总黄酮含量。
计算公式为:样品总黄酮含量(%)=0.03692(A+0.1644)/W。
注:上式为通过回归方程转化而来，式中A为测得样品液的吸光度值，W为称样量。
2、紫外分光光度法
黄酮类化合物由于均具有α－苯基色原酮的基本结构，羰基与二个芳香环
形成两个较强的共轭系统，对紫外光区相应有两个区域的特征吸收。
吸收
带I在较长波长（330～380nm）；吸收带II在较短波长（240～280nm）。
经分离纯化的待测样品中主要含有黄酮类成分，其紫外光谱中有两个特征
吸收带，因此可以选用其中主要的黄酮成分作为对照品测定总黄酮含量，例如2005版中国药典，淫羊藿中总黄酮的含量测定就是采用淫羊藿苷为
对照品在270nm处测定淫羊藿总黄酮含量。
用紫外分光光度法测定总黄酮
含量时应注意，（1）对照品应是有待测物中含有的成分；（2）对照品的分子量应适中、在待测物中含量较高；（3）对照品的吸收曲线与待测物的吸收曲线相似、最大吸收波长相同；（4）应加强样品的前处理，合理选择阴性样品，尽可能排除其他组分的干扰。
3、高效液相色谱法
如果待测物中，总黄酮的大多数成分明确、含量高、易得到可供含量测定用的对照品，则可用高效液相色谱法直接测定总黄酮的含量或者样品经过处理，测定指标成分含量，再换算成总黄酮含量。
欧来良等人用高效液相色谱法测定沙棘中总黄酮含量，因沙棘黄酮中几类苷元的分子在结构上极为相似, 只是少数非强生色基团不同, 而且相对分子质量也相差不多。
因而它们对槲皮素的响应因子都应该接近1, 即只用槲皮素作为对照,测定槲皮素含量，再转换成总黄酮含量。
该方法产生的误差小，待测物总黄酮成分母核相同，均可采用该方法测定。
4、亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠比色法
该方法是目前应用最广泛的总黄酮含量测定方法，该法的原理是在待测物的水溶液中，加入亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠试液，铝离子与黄酮类化合物3，，4，二羟基发生络合反应显色来进行测定。
例如芦丁化合物B环
上有邻二酚羟基，与铝离子络合，在500nm处有最大吸收，如果供试品显色后在同一地方有最大吸收，即可以芦丁做对照品，用比色法进行测定。
芦丁为黄酮类成分，由于很容易得到对照品，很多文献报道某些中药或中药制剂中都沿用以芦丁为对照品的比色法测定总黄酮含量。
2005年版中国药典用改方法对一味胶囊、益心酮片、消咳喘糖浆及排石颗粒进行了总黄酮的含量测定。
用此方法进行总黄酮的含量测定影响因素很多，其一，某些具有邻二酚羟基类化合物也会和铝离子络合显色，例如含多羟基的酚酸、有机酸类化合物，如咖啡酸、绿原酸等；其二，某些黄酮类成分与铝离子络合，不在500n m 处有最大吸收，影响测定结果，使测定结果偏小，例如刺槐素苷、黄芩素、山柰酚等；其三，某些总黄酮类化合物中不含或仅含有少量芦丁，但是很多研究者仍然用芦丁做对照品测定总黄酮含量，如果待测总黄酮类某些成分分子量与芦丁分子量相差很多，或者该组分中大部分是苷元，则测定结果与实际总黄酮含量会有差别，不能准确定量。
因此用亚硝酸钠－硝酸铝－氢氧化钠对成分不明确的待测物进行含量测定，结果不准确，该方法用做总黄酮含量测定专属性不强。
建议大家应用的时候慎重考虑。