荧光定量分析仪PPT课件
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实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
荧光定量PCR原理及操作步骤.课件
THANK YOU
感谢观看
荧光定量PCR的原理
• 在PCR反应过程中，随着DNA的扩增，荧光染料或荧光探针会 与新合成的DNA结合，产生荧光信号。荧光信号的积累与DNA 的扩增数量呈线性关系，通过荧光信号的实时监测，可以精确 地计算出起始模板的浓度。
荧光定量PCR的应用
• 荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、突变检测、病原体 检测和基因分型等领域。通过实时监测PCR反应进程，可以 精确定量目标基因的表达水平，检测基因突变，以及鉴定病 原体种类和基因型等。
实验结果解读注意事项
数据解读与处理
荧光定量PCR实验产生的数据需要进行解读和处理。实验人员应熟悉数据分析方 法，正确解读实验结果，避免因数据处理不当导致误判。
结果报告与交流
荧光定量PCR实验结果应按照相关规定进行报告和交流。实验人员应确保结果的 准确性和可靠性，避免因结果报告不准确导致误导或决策失误。同时，实验人员 还应与其他相关人员进行有效沟通，共同探讨实验结果和问题解决方案。
案例二：突变检测
总结词
荧光定量PCR是突变检测的有效手段，能够快速准确地检测DNA序列中的点突变、插入或缺失。
详细描述
针对目标基因的特定区域，设计包含突变信息的引物或探针，通过荧光定量PCR扩增后，利用熔解曲 线或高分辨率溶解分析等技术，判断是否存在突变。这种方法在遗传性疾病诊断、癌症研究等方面具 有重要应用。
解决方案3
对于引物二聚体问题，可以通过优化引物设计、 降低引物浓度等方法来解决。
建议3
在实验前对引物进行充分的评估和验证，避免使 用易形成二聚体的引物。
问题解决方案及建议
解决方案4
对于假阳性结果问题，可以通过 增加重复实验次数、设置阴性对 照等方法来避免。
罗氏实时荧光定量PCR仪课件
02
罗氏实时荧光定量PCR仪 介绍
仪器的基本结构
仪器外观
操作界面
罗氏实时荧光定量PCR仪外观为长方 体，尺寸适中，便于实验室放置。
仪器配备彩色触摸屏，操作界面友好 ，方便用户进行参数设置和实验操作 。
内部结构
仪器内部包括加热模块、光学检测系 统、电脑控制系统等部分，各部分协 同工作完成PCR扩增和荧光检测。
制定仪器的维护保养计划，按照 计划进行保养，保证仪器的正常
运行和使用寿命。
THANKS
感谢观看
通过比较不同样本之间的基因表达数据，可以筛选出差异表达的基 因，进一步研究其在生物学过程中的作用。
基因表达调控机制研究
通过实时监测基因转录水平的变化，有助于深入了解基因表达的调 控机制，为相关疾病的研究和治疗提供线索。
在病毒检测中的应用
1 2 3
病毒载量测定
利用罗氏实时荧光定量PCR仪，可以快速、准确 地测定病毒载量，为临床诊断和治疗提供依据。
02
根据错误提示查找相关资料或联系技术支持解决。
仪器运行结果不准确
03
检查样品是否符合要求，运行程序是否正确，仪器是否经过校
正等。
仪器的保养与校正
定期清洗仪器内部
根据仪器使用情况定期清洗仪器 内部，包括清洗反应管、更换滤
芯等。
校正仪器
定期邀请专业技术人员对仪器进 行校正，确保仪器准确性。
建立维护保养计划
详细记录实验数据，包括荧光信号的 变化、扩增曲线等，并对数据进行整 理和分析。
实验后处理
仪器清洁与保养
数据审核与报告撰写
实验结束据进行审核，撰写详细的实验报 告，包括实验目的、方法、结果和结论等 。
样品处理
第十三章-荧光分析法PPT课件
内部能量转换
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
.
34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠 时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。
.
6
荧光和磷光产生示意图
关于荧光
荧光的产生需经历两个过程：
吸收 发射
第一激发单重态的最低振动能级
振动驰豫 内部能量转换
.
8
例题
1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后， 吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射 光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线
.
24
三、影响荧光强度的外部因素
温度 溶剂 酸度 散射光
学习目的: 提高荧光分析的灵敏度和选择性
.
25
1 溶剂对荧光的影响
萘在下列哪种溶剂中的荧光强度最强？ A 1－氯丙烷 B 1－溴丙烷 C 1－碘丙烷 D 1，2－二氯丙烷
1. 一般情况下，荧光波长随着溶剂极性的增强而长移， 荧光强度也增强。
OH N
C H2
芴φf 1.0
O N Mg1/2
.
21
（三）分子的刚性和共平面性
CH3
SO3Na
N
CH3 CH3
SO3NaN CH3
H CCH
H CC H
结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共 平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移
（四）取代基效应
给电子基团 －NH2、 －OH、－OCH3、－NHR、－NR2荧 光效率提高、荧光波长长移
•
• • • •
cx
cs
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34
二、定量分析方法
2、比例法（对照法）
Fs F0 KCs
FxF0KCx
Cx
Fx Fs
罗氏实时荧光定量PCR仪分解课件
该技术通过荧光染料或荧光探针标记特异性寡核苷酸引物，在PCR扩增过程中， 随着DNA片段的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过荧光信号的累积可以实时监测 DNA片段的扩增量。
实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR技术基于PCR扩增 过程中荧光信号的变化进行监测。
荧光信号的强度与DNA片段的扩增量 成正比，因此可以通过实时监测荧光 信号的变化来反映DNA片段的扩增量 。
技术发展面临的挑战与机遇
技术更新换代
临床应用需求
随着新技术的不断涌现，实时荧光定量PCR 技术面临着被替代和淘汰的风险，需要不 断更新和完善。
临床应用对实时荧光定量PCR技术的需求不 断增长，同时也对其准确性和可靠性提出 了更高的要求。
科研领域需求
技术创新与合作
科研领域对实时荧光定量PCR技术的需求也 在不断增加，需要不断提高其检测的灵敏 度和特异性。
记录仪器使用情况
每天记录仪器的使用情况 ，包括样品数量、运行时 间等，以便于跟踪仪器性 能和保养计划。
仪器的定期保养
清洁仪器内部
按照制造商的推荐，定期对仪器 内部进行清洁，确保光学系统和 加热模块等关键部件不受污染。
检查仪器性能
定期对仪器进行校准和性能测试， 确保其准确性和可靠性。
更换消耗品
根据需要，定期更换消耗品，如滤 芯、密封圈等，以确保仪器正常运 行。
常见故障的排除与处理
样品检测异常
如果样品检测结果异常，可能需 要对仪器进行校准或检查样品制
备过程。
仪器无法启动
如果仪器无法启动，可能需要进 行电源检查或联系制造商的技术
支持。
加热模块故障
如果加热模块出现故障，可能需 要更换加热模块或联系制造商的
实时荧光定量PCR技术的原理
实时荧光定量PCR技术基于PCR扩增 过程中荧光信号的变化进行监测。
荧光信号的强度与DNA片段的扩增量 成正比，因此可以通过实时监测荧光 信号的变化来反映DNA片段的扩增量 。
技术发展面临的挑战与机遇
技术更新换代
临床应用需求
随着新技术的不断涌现，实时荧光定量PCR 技术面临着被替代和淘汰的风险，需要不 断更新和完善。
临床应用对实时荧光定量PCR技术的需求不 断增长，同时也对其准确性和可靠性提出 了更高的要求。
科研领域需求
技术创新与合作
科研领域对实时荧光定量PCR技术的需求也 在不断增加，需要不断提高其检测的灵敏 度和特异性。
记录仪器使用情况
每天记录仪器的使用情况 ，包括样品数量、运行时 间等，以便于跟踪仪器性 能和保养计划。
仪器的定期保养
清洁仪器内部
按照制造商的推荐，定期对仪器 内部进行清洁，确保光学系统和 加热模块等关键部件不受污染。
检查仪器性能
定期对仪器进行校准和性能测试， 确保其准确性和可靠性。
更换消耗品
根据需要，定期更换消耗品，如滤 芯、密封圈等，以确保仪器正常运 行。
常见故障的排除与处理
样品检测异常
如果样品检测结果异常，可能需 要对仪器进行校准或检查样品制
备过程。
仪器无法启动
如果仪器无法启动，可能需要进 行电源检查或联系制造商的技术
支持。
加热模块故障
如果加热模块出现故障，可能需 要更换加热模块或联系制造商的
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
常见荧光定量PCR仪汇总课件
第24页/共57页
ABI 7500 fast
7500 fast是7500快速反应模式仪器，理论支持本公司PCR体系：20ul 检测孔数：兼容96孔和8联管。 检测通道：5通道，除去ROX后4通道。 反应时间：30~40min 激发光源：齿钨灯。
第25页/共57页
优缺点：
ABI 7300
ABI7300就是ABI7000的简单升级版，硬件设计上几乎没有改 变，只是换过几个性能更好的配件，软件有所升级。价格2030万RMB，理论支持本公司PCR体系：40ul 检测孔数：兼容96孔和8联管。 检测通道：4通道，除去ROX后3通道。 激发光源：齿钨灯。 加热模块：半导体加热模块，升温3℃/S
检测通道：6通道 加热模式：半导体加热制冷模块 升温：5℃/S 孔数：96孔（10-100ul）检测1小时,384孔（5-20ul）检
测40min 材料：专用板，理论支持本公司PCR体系：40ul 集多个优点于一身，目前市面上最强悍的PCR仪
第34页/共57页
第35页/共57页
优缺点：
LightCycler Nano
第37页/共57页
进口定量PCR仪器厂商
ABI
市
场
占
ROChe （罗氏）
有
率
Bio价 格
ABI
Bio-Rad
第38页/共57页
厂家介绍：
Bio-Rad
伯乐自1952年在美国成立，在50多年中为临床诊断和生命 科学研究市场提供了广泛的新型产品和服务，始终居于科 学发现的中心地位。
第20页/共57页
优缺点：
ABI 7900
7900是ABI第二代PCR产品，目前最强PCR仪。价格70-80万RMB，理论 支持本公司PCR体系：40ul 1.检测孔数：支持8联管，96孔板，384孔板，Taqman 低密度表达谱芯片 2.激发光源：氩离子激光，全波长检测 3.进样时可以采用ABI自动机械臂，方便快捷 4.加热模块：半导体加热模块，升温3℃/S 缺点： 体积大，价格贵，性能比上不如7500。
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
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未知
104
103
106
105
102
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标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
荧光定量的原理及过程介绍PPT课件
3. 以“ Gamma ”表示的路径是以增 强效应为主，如Ni--Fe--Cr--探测器。
1
15
基体影响的校正方法
1. 实验校正法：外标法、内标法、散射内标法、 比例稀释法等；
2. 数学校正法：经验系数法1
16
基体影响校正模型
式中Z为浓度或计数率；N为样品中存在的元 素数； ，，，为基体影响校正系数；I为 分析元素；j, k 基体干扰元素
1
13
铁-镍-铬体系的第三元素影响
NiK NiKab
Nik
FeK
FeKab
NiK FeK CrKab CrK
初级激发产生 的 CrK 的强度占Cr总强度的72.5%; 初级荧光 NiK同时激发 Fe 和Cr; 初级荧光FeK直接增强 CrK 占 Cr 总强度的23.5％; 初级荧光NiK的直接增强 CrK 占 Cr 总强度的2. 5％ 二次荧光FeK对CrK的增强占Cr 总强度的1.5％。
系，可用中值定理或内插法计算； 3. 在分析峰两侧的背景呈现复杂的非线性分布规律。
1
28
单点法扣背景 Rn=Rp-Rb
1
29
两点法扣背景
1
30
非线性区峰底背景计算
峰底背景利用通过4个背景点的多项式进行计算：式中: BgC表示常数项；BgL表示 一次项；BgQ表示二次项； BgT 表示三次项。X表示背景与主峰的2角之差; R(background)表示峰位的背景强度
1
35
实验校正法
3. 散射内标法： 选择一条靶的散射线或某波长处连续散射线作为内标来校 正吸收效应和样品密度的变化。 包括靶线内标法和本底内标法。 散射线内标法对轻基体中少量或微量元素的测定是广为使 用的方便而实用的方法。
1
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基体影响的校正方法
1. 实验校正法：外标法、内标法、散射内标法、 比例稀释法等；
2. 数学校正法：经验系数法1
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基体影响校正模型
式中Z为浓度或计数率；N为样品中存在的元 素数； ，，，为基体影响校正系数；I为 分析元素；j, k 基体干扰元素
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铁-镍-铬体系的第三元素影响
NiK NiKab
Nik
FeK
FeKab
NiK FeK CrKab CrK
初级激发产生 的 CrK 的强度占Cr总强度的72.5%; 初级荧光 NiK同时激发 Fe 和Cr; 初级荧光FeK直接增强 CrK 占 Cr 总强度的23.5％; 初级荧光NiK的直接增强 CrK 占 Cr 总强度的2. 5％ 二次荧光FeK对CrK的增强占Cr 总强度的1.5％。
系，可用中值定理或内插法计算； 3. 在分析峰两侧的背景呈现复杂的非线性分布规律。
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单点法扣背景 Rn=Rp-Rb
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两点法扣背景
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非线性区峰底背景计算
峰底背景利用通过4个背景点的多项式进行计算：式中: BgC表示常数项；BgL表示 一次项；BgQ表示二次项； BgT 表示三次项。X表示背景与主峰的2角之差; R(background)表示峰位的背景强度
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实验校正法
3. 散射内标法： 选择一条靶的散射线或某波长处连续散射线作为内标来校 正吸收效应和样品密度的变化。 包括靶线内标法和本底内标法。 散射线内标法对轻基体中少量或微量元素的测定是广为使 用的方便而实用的方法。
《x荧光分析仪资料》课件
1 数据处理基本流程
包括数据读出、基线校正、元素峰形拟合、峰位校正以及内标校正等。
2 常见数据处理方法
如如定量分析、定性分析等方法。
3 数据分析及结果解释
数据分析是确定样品中元素含量的过程，得到的数据是客观的，应该基于科学原理进行 解释。
x荧光分析仪应用
x荧光分析仪可以应用于多个领域，如医学、环境保护、材料科学等。
x荧光的原理
x荧光分析仪使用的是x射线激发，测量样品对激发的反应，利用荧光辐射得到样品元素含量的信 息。
x荧光分析仪的基本组成
x荧光分析仪由激光器、样品室、荧光探测器和数据处理器等组成，其中探测器是最主要的组件。
优点和缺点
使用x荧光分析仪可以快速、准确地测量物质中元素的含量，但需要一定的专业技能。此外，对于 易挥发的元素、非金属元素和轻元素等样品制备是成功分析的关键。
1
样品制备步骤
2
样品制备包括样品收集、样品制备和
分析。样品制备的主要步骤包括样品
挑选、制样、质量控制和实验室测试。
3
样品选择
样品的选择应该基于研究的目的和预 期结果。它应能以无偏的方式反映所 研究物质的元素组成。
常用样品制备方法
包括煅烧、酸溶、融熔、干法灰化等。 不同的制备方法适用于不同类型的样 品。
x荧光分析仪的优 势与不足
该技术具有高灵敏度、特异 性和多元素分析能力，但其 检出限有待提高。
提高检测的灵敏度
提高灵敏度的方法包括合理 调整参数、改进样品制备方 法和校正曲线等。
未来发展趋势
未来的发展方向主要是加强 成像分析、完成在线实时分 析以及与其他分析技术融合 等方面。
生物医学
x荧光分析仪在生物医学领域的应用包括对器官和组织的元素分析，如骨骼和牙齿中的成分。
包括数据读出、基线校正、元素峰形拟合、峰位校正以及内标校正等。
2 常见数据处理方法
如如定量分析、定性分析等方法。
3 数据分析及结果解释
数据分析是确定样品中元素含量的过程，得到的数据是客观的，应该基于科学原理进行 解释。
x荧光分析仪应用
x荧光分析仪可以应用于多个领域，如医学、环境保护、材料科学等。
x荧光的原理
x荧光分析仪使用的是x射线激发，测量样品对激发的反应，利用荧光辐射得到样品元素含量的信 息。
x荧光分析仪的基本组成
x荧光分析仪由激光器、样品室、荧光探测器和数据处理器等组成，其中探测器是最主要的组件。
优点和缺点
使用x荧光分析仪可以快速、准确地测量物质中元素的含量，但需要一定的专业技能。此外，对于 易挥发的元素、非金属元素和轻元素等样品制备是成功分析的关键。
1
样品制备步骤
2
样品制备包括样品收集、样品制备和
分析。样品制备的主要步骤包括样品
挑选、制样、质量控制和实验室测试。
3
样品选择
样品的选择应该基于研究的目的和预 期结果。它应能以无偏的方式反映所 研究物质的元素组成。
常用样品制备方法
包括煅烧、酸溶、融熔、干法灰化等。 不同的制备方法适用于不同类型的样 品。
x荧光分析仪的优 势与不足
该技术具有高灵敏度、特异 性和多元素分析能力，但其 检出限有待提高。
提高检测的灵敏度
提高灵敏度的方法包括合理 调整参数、改进样品制备方 法和校正曲线等。
未来发展趋势
未来的发展方向主要是加强 成像分析、完成在线实时分 析以及与其他分析技术融合 等方面。
生物医学
x荧光分析仪在生物医学领域的应用包括对器官和组织的元素分析，如骨骼和牙齿中的成分。
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PCT
线性范围：0.05～10 mg/L
•正常参考值： ＜0.05 ng/mL
•线性范围：0.05～100 ng/mL
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快速检测方法学线性分析
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C-反应蛋白（CRP）的发现与结构
C—反应蛋白（ c-reactive protein ，CRP）
• 1930年由Tillet和Francis发现
• 一种能在Ca2+存在时与肺炎链球菌 的荚膜C多糖结合的蛋白质
全自动特定蛋白仪进行比对，相关性好，相关系数R=0.9992 ➢ 一卡双项（超敏+常规），线性范围广（0.5-200 mg/L）,
可全面满足临床需求 ➢ 正常参考值：hsCRP< 1 mg/L; CRP < 10 mg/L
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D-Dimers定义
• D-Dimers ：是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后， 再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。
性疾病时抗生素治疗的最适化，避免抗生素滥 用和耐药性） 心血管疾病的风险评估和指导治疗（独立于脂 类之外的危险因子，广泛应用于临床）
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CRP优势
➢ 标本面广，可适用于全血、血浆、血清样本的检测 ➢ 反应时间短，3 分钟 即可出结果 ➢ 先进的免疫荧光系统，与美国 DADE BEHRING BN 100
一般细菌感染 CRP
20-50 mg/L
超敏 CRP
中度危险性 CRP
1-3 mg/L
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严重细菌感染 CRP
＞50 mg/L
高危险性 CRP
＞3 mg/L
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CRP与疾病的活动性及检测的临床意义
鉴别细菌或病毒感染（首选指标） 监测病情（CRP升高的程度反映炎症组织和感
染的范围.严重程度和活动性）。 监控感染（术后.产后） 抗生素疗效观察，指导和监测治疗（急性感染
• 由肝细胞在IL6、IL2、TNF刺激下 合成，炎症局部巨噬细胞也可少量 产生。
• 正常合成率1-10mg/d，急性炎症时 每天合成>1g。
• 半衰期19h，不耐热，65℃30min 破坏。
• 不能通过胎盘，在体内分布甚广， 除血液外，胸水、腹水、心包液、 关节液中均可测出。
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8
C-反应蛋白（CRP）的生理作用
• 是一个特异性的纤溶过程标记物。
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16
凝血系统
纤溶系统
D-Dime内r源性的凝血产生外源性凝血
凝血酶原
凝血酶
纤溶酶原
纤维蛋白原
纤溶酶
纤维蛋白单体
凝固
FXIII
FXIIIa
纤溶
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交联纤维蛋白
FDP
X,Y,D,E等碎 片
X ′,Ｙ′, Ｄ,Ｅ等碎片
DD,DXD, DD/E,YXD等 复合物
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D-二聚体临床意义
适用范围
➢ 中心实验室、门/急诊化验室、体检中心
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3
产品优势
激光器，采用的是韩国激光二极管 635nm，相比同类产 品所用LED灯，灵敏度高。
IC卡具有自动上电和掉电管理功能,减少带电操作而产生 的烧片现象。
连续测量模式下的仪器分别计时，省去秒表计时的繁琐。
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4
全程C-反应蛋白（hsCRP+常规CRP）
荧光定量分析仪器及试剂
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1
仪器 试剂
概要
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2
荧光仪
产品特点
➢ 快速：连续模式＞200T/小时，单步模式 3 分钟/例 ➢ 智能：自动模式，智能识别检测，无需手动干预 ➢ 报告：综合多项目输出 ➢ 存贮：可存贮上万例结果 ➢ 准确：CV＜5%，多重质控，检测结果准确 ➢ 通信：用COM，USB等可连入Lis系统 ➢ 轻便：2Kg,适合床边诊断
正常参考值：hs CRP:＜1 mg/L; CRP:＜10 mg/L
线性范围：0.5～200 mg/L
尿微量白蛋白
人绒毛膜促性腺激素HCG
正常参考值：＜20 mg/L
正常参考值：＜10 mIU/mL
线性范围： 5～300 mg/L
线性范围：10 mIU/mL～200000 mIU/mL
D-二聚体
正常参考值： ＜0.5 mg/L
• 静脉血栓栓塞的排除性诊断 • 弥漫性血管内凝血的诊断 • 脑梗死的辅助诊断及预后判断 • 外科手术、溶栓治疗的监测 • 妊娠高血压综合征高凝状态的诊断及检测 • ACS、肝脏疾病、恶性肿瘤的辅助诊断及预后判
断
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18
D-二聚体阳性结果的解释
• <0.5ug/mL ，结合验前概率评估，中、低风险的疑似患者可排除 DVT和PE，无需再做进一步检查。
响（肝脏发育不全或肝功能严重受损则会影响CRP的合成）
4.能关联疾病活动性：CRP 上升速度、幅度及持续时间与病情
及组织损伤的严重程度密切相关
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11
常规CRP、hsCRP 、全程CRP的区别
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12
常规炎症严重程度判断 常规 CRP
病毒或细菌感染 CRP
10-20 mg/L
低危险性 CRP
＜ 1mg/L
• >0.5ug/mL，不能排除静脉栓塞性疾病，应结合临床表现和其他 检查综合评估血栓性疾病的风险，必要时进行动态观察。
• 1941年， Avery等先后证实这是一 种急性感染时出现的蛋白质（病情 恢复后/健康人血清中没有这种物 质）
• 结构对称的盘状五聚体，归于五聚 素家族
– 由5个完全相同的非糖基化单体以 非共价键联接形成
– 每个单体每个含206个氨基酸残基（
相对分子质量23017）
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7
C-反应蛋白（CRP）的生成
• 引发对侵入细胞的免疫调节和吞噬作用，与配体结合，激活补体，调 理吞噬功能，促使内源性或外源性配体物质（载有配体的病理物质或 病原体）的清除，表现为炎症反应
– 在Ca2+存在下与磷酸胆碱、DNA、组蛋白等结合
• 与凋亡坏死细胞膜脂质双层结构破坏时暴露的磷脂或外部侵入的细菌 、真菌、寄生虫的细胞壁磷酸胆碱结合
2.病毒感染没有标志性升高：病毒主要在细胞内进行复制，一般不破坏
细胞膜，暴露CRP结合点，所以病毒感染时CRP一般不超过25mg/L。在 成人，革兰氏阴性菌感染时CRP可高达500mg/L,革兰氏阳性菌和寄生虫感 染时通常可引起CRP中度升高，多为100mg/L左右。
3. 受影响因素少：不受生理活动的影响，不受化疗、放疗和激素治疗的影
CRP
细菌巨噬细胞ຫໍສະໝຸດ .9CRP的生物学特点
1.反应快速，增量大，随着恢复下降也快；敏感！
感染、创伤、手术等情况下 快速上升，6~10hr 明显改变 48hr（24~72 hr）到高峰，102~103倍的
变化 半衰期6~7hr，较快反映病情的变化 例图：术后CRP等变化
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CRP的生物学特点