PCR (2)

PCR——酶聚合链式反应
原 因
PCR检验及影响因素 PCR检验及影响因素
PCR实验是否成功可用48h电泳进行检测
模板 Taq酶 ①模板中含有杂蛋白质 ②模板中含有Taq酶抑制剂 失去活性 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别 是染色体中的组蛋白 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸 两条引物的浓度不对称 入酚 多次冻融或长期放冰箱冷藏 ⑤模 板核酸变性不彻底。 部分，导致引物变质降解失效
PCR——酶聚合链式反应
名词解释
PCR 组分介绍
dNTP 引物（primer），是一小段单链 PCR Taq酶 deoxy-ribonucleoside DNA或RNA，作为DNA复制的起 triphosphate（脱氧核糖核苷三磷 Thermus AquaticusDNA聚合 dNTP 聚合酶链式反应（Polymerase 始点，在核酸合成反应时，作为 Chain Reaction，简称PCR）又称无 酸）的缩写。 同酶 该酶可以耐受90℃以上 每个多核苷酸链进行延伸的出 细胞分子克隆或特异性DNA序列 是包括 的高温而不失活，不需要每个 发点而起作用的多核苷酸链，在 体外引物定向酶促扩增技术。 dATP, dGTP, dTTP, dCTP,dUT 循环加酶，使PCR技术变得非 引物的3′-OH上，核苷酸以二 P等在内的统称，N是指含氮碱 常简捷、同时也大大降低了成 酯链形式进行合成，因此引物的 基，代表变量指代A、T、G、C、U 本，PCR技术得以大量应用， 3′-OH，必须是游离的。 等中的一种。在生物DNA、RNA 并逐步应用于临床。 Taq酶 合成中，以及各种PCR（RT-PCR、 Real-time PCR）中起原料作用
浓度及温度
过高对酶的活性有影 响 低于93℃则需延长时 1.Taq DNA聚合酶 间 约需酶量2.5U
2.dNTP的质量与浓度 解链温Tm=4(G+C)+2(A+T) dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系 复性温度=Tm值-(5～10℃) 3.Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性 常用温度为72℃ 和产量有显著的影响 过高的延伸温度不利 4.模板核酸的量与纯化程度 于引物和模板的结合 是PCR成败与否的关键环节 之一
2)反向PCR
4）LP-PCR 6）原位ＰＣＲ
8)荧光定量PCR 10)巢式PCR
PCR——酶聚合链式反应
引 物 设 计
引物extra
引物
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜 ③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上 的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 ⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配 对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适 宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同 源性。
——聚合酶链式反应
PCR
作者：俞月 陈羚
PCR——酶聚合链式反应
目录
发展史 相关名词解释 PCR运作原理及特点
浓度及温度的影响 PCR检验及影响因素 PCR技术类别简介
PCR——酶聚合链式反应
发展史 发展史
1971年
20世纪60年代末70年代初，人们所能 提取的核酸的含量较少，一定程度上 Khorana 限制了DNA的体外操作。 于是Khorana于1971年最早提出核酸 体外扩增的设想。 Saiki等人又在黄石公园从生活在 Saiki 温泉中的水生嗜热杆菌内提取到 一种耐热的DNA聚合酶，使得 PCR技术的扩增效率大大提高。
美国科学家Kary Mullis在高速公路的启发 下，经过两年的努力，发明了PCR技术，并 1985年 在Science杂志上发表了关于PCR技术的第 Kary Mullis 一篇学术论文。 获得1993年的诺贝尔化学奖。 1988年初，Keohanog通过对所使 用的酶的改进，提高了扩增的真 1988年 Keohanog 实性。
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DNA
时间/min
PCR——酶聚合链式反应
PCR运作原理 标准的PCR过程分为三步：
1.DNA变性：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA 90℃-96℃ 2.退火（复性）：系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链。40℃-65℃ 3.延伸：在Taq酶（在72℃左右最佳的活 性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端 →3′ 端延 伸，合成与模板互补的DNA链。 68℃-75℃

二温度点法
PCR——酶聚合链式反应
DNA单链 DNA双螺旋结构
由游离的dNTP延伸，形成互补链
95 ℃ 72 ℃ 65 ℃
Taq酶
}Primer
PCR——酶聚合链式反应
PCR——酶聚合链式反应
PCR——酶聚合链式反应
特点
特异性强
反 应 特 点
①引物与模板DNA特异正确 的结合 ②碱基配对原则 ③Taq DNA聚合酶合成反 应的忠实性 ④靶基因的特异性与保守性
引物 primer
PCR——酶聚合链式反应
时间及温变性 PCR运作原理
低温退火
适温延伸 重复25-30轮
温度/℃
64
48
32 16 0 0
目旳DNA片段扩 形 成 增100万倍以上 两变 子链延伸 条性 DNA加倍 单 链 DNA单链与引物 复性
DNA双螺旋
作者：俞月 陈羚
引物
Dntp
PCR——酶聚合链式反应
PCR技术类别简介
1）不对称PCR
PCR技术类别简介
3）多重PCR
5）锚式PCR
7）ＲＴ－ＰＣＲ
9）RACE技术
对某个已知DNA片 目的：扩增产生特 段两侧的未知序列 异长度的单链 它是利用完整 进行扩增 DNA。 利用同位素、 的细胞作为一 用于检测特定基 荧光素等对Ｐ 个微小的反应 因序列的存在或 ＣＲ引物进行 体系来扩增细 缺失。 标记，用以直 胞内的目的 观地检测目的 片段，在不破 基因。 坏细胞的前提 下，利用一些 特定的检测手 段来检测细胞 内的扩增产 物。
PCR产物的生成量是以指数方 式增加 只需添加一次，无需重复 添加
灵敏度高
简便、快速 耐高温的Taq DNA聚合酶
对标本的纯度要求低
PCR——酶聚合链式反应
浓度及温度影响
1.变性温度 变性温度低，解链不完 全是导致PCR失败的最 过高可引起非特异性扩增 主要原因。
过低则合成产物量减少 过低会降低PCR产物的产量 2.退火温度 过高会与Mg2+结合，使游离 退火温度是影响PCR特 异性的较重要因素。 的Mg2+浓度降低 过高，反应特异性降低，出 传统的DNA纯化方法通常采用 现非特异扩增 3.延伸温度及时间 SDS和蛋白酶K（由于篇幅关 过低会降低Taq DNA聚合酶的 PCR反应的延伸温度一 系不做介绍）来消化处理标 活性，使反应产物减少 般选择在70～75℃之 本。一般临床检测标本，可 间，常用温度为72℃ 采用快速简便的方法溶解细 胞，裂解病原体