第二节石蜡切片制作(共48张PPT)

❖ 1．刀和台木的固定螺丝太松； 10%缓冲中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水+4g磷酸二氢钠磷酸氢二钠。
材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。 切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。 染色后的切片须再次经过脱水、透明。
2．刀口倾斜度太大； ❖ 若过深则进行适当分化。
冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固定剂沉淀于组织之中影响切片的质量。 3．移动刀片，改用新的刀口；
❖ 4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液：4g多聚甲醛+100ml磷酸盐缓冲液（适用于 免疫组化学技术）。
不同浓度梯度酒精配制
梯度酒精的作用： 将组织中的水分经过梯度酒精的作用，置换出 来，以达到组织脱水的目的。
配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯 酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。
石蜡切片所需的实验器材
使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的 石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于 在蜡带上识别切片。
实验室是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密 机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下 移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件 是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切 片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转 轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一 定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一 张合乎厚度要求的切片。
100%的酒精
95%的酒精
80%的酒精 70%的酒精
蒸馏水 苏木精染色
自来水洗（在显微镜下检查细胞核的颜色是否 合适，若太浅，可经蒸馏水洗后放回重染，
若过深则进行适当分化。）
0.5%的盐酸水分色数秒钟在显
微镜 下检查退之前红色
自来水冲洗（ 蓝化）
蒸馏水冲洗
0.5%伊红（95%酒精溶液）数秒钟 70%酒精 80%酒精
以免损坏组织。
第二步：固定
无论何种器官、组织，要制成切片，首先需要固定。目的在于保存 组织原有的形态，同时使之易于染色。固定要求：
1：能迅速使蛋白质变性，使细胞维持原来的形态，既不收缩
又不变形。
2：固定剂必须也是保存剂，使组织在其中不易腐烂。
3：固定剂应有较强的通透能力，以保证组织块的内部也能被 及时的固定。
（注意：70%以上的酒精要回收利用）。
❖ 脱水之后，将组织块放入100%的酒精+二甲苯溶液（1： 1）再放入二甲苯溶液直到组织块透明为止，透明需要半
小时到一小时左右。
第四步：浸蜡包埋
❖ 由二甲苯透明的组织块经过二甲苯+石蜡后 ，即可进入纯蜡中，一般浸蜡在温箱中进行 ，温度稍高于石蜡的温度，蜡质由于冬夏的 温度不同而进行选择。
切片方法
❖ 切片前，选择刀口平整无缺刻的部分来进行切削。将所要 切的包埋块固定在标本台上，使包埋块外切面与标本夹截 面平行，并让包埋块稍露出一截。将刀台推至外缘后松开 刀片夹的螺旋，上好刀片，使切片刀平面与组织切面间呈 15°左右的夹角，包埋块上下边与刀口平行。在微动装置上 调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之 间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口 与组织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。
❖ 注意：熔蜡及浸蜡温度保持在65℃左右。
❖ 经过浸蜡之后的组织，必须包埋好才能切片 。
第六步：切片
❖ 切片之前必须修整好蜡块，并且固定在木块 之上，再将四周多余的残蜡用刀片削去，否 则不易于切片和展片。
❖ 切片使用旋转切片机时，应固定好木块；调 整好切片刀与蜡块的距离与角度，一般刀的 倾斜度为4-6度；根据切片的厚度不同调节厚
❖ 配制方法： ❖ 1.将铝化钾或硫酸铝钾溶于蒸馏水中（加热
至40~45℃）； ❖ 2.将苏木精溶于无水乙醇中，再加入冰乙酸、
温热的铝化钾或硫酸铝钾溶液，最后加入甘 油； ❖ 3.配置完成后，置于温热和阳光充足处，成 熟3个月，即可使用。
伊红溶液的配制
❖ 1.伊红酒精溶液的配制： ❖ 伊红Y（0.5-1.0g）+95%无水乙醇（100ml），
90%酒精 100%酒精（1）
100%酒精（2） 二甲苯+100%酒精（1：1）
二甲苯（1） 二甲苯（2）
树胶封片
第八步：透明
❖ 染色后的切片须再次经过脱水、透明。 ❖ 标本经二甲苯透明后，折射率改变，透明度
提高，使得染上色的部位更清晰地显示出来 。
第九步：封藏
❖ 封藏的目的：
❖ 是使制成的切片能够永久保存，封藏剂必须能与透明剂互溶，对 染色无影响，折射率近似玻璃和具有粘性的物质，常用的封藏剂 有加拿大树胶和中性树胶。
4：固定后的组织应软硬适宜，便于切片。 5:固定后的组织应容易被染料着色。 ！注意:不同固定剂固定时间不一样。具体问题具体分析。
第三步：冲洗、脱水、透明。
❖ 冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固定 剂沉淀于组织之中影响切片的质量。
❖ 脱水的过程就是用梯度酒精逐步取代水的过程，组织脱 水一般由70%——80%——90%——95%— —100%梯度酒精完成。在95%的时间可以稍长
问题三：切片卷起呈圆筒状
❖ 原 因：
❖ 1．室温过低； ❖ 2．石蜡过硬； ❖ 3．刀口太钝； ❖ 4．刀的倾角太大。
❖解 决 办 法 ：
❖ 1．提高室温； ❖ 2．加软蜡； ❖ 3. 用毛笔将蜡片摊开压住，切2—3 片即成
带； ❖ 4．减小倾角。
问题四：切片粘附于切片刀，皱摺在一起
❖ 原 因：
❖ 仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖 玻片、镊子、手术刀。
❖ 材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。
❖ 试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦 味酸、、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘 油、中性树胶。
第一步：取材
❖ 一般根据观察目的选取动物 或人体组织，取材要迅速，
组织块不宜太大，一般 为组织学观察，取黄豆 大小为宜。取材要用锋利 的刀剪，不可用钝刀，更不 可用力压、揉、挤等，
❖ 封片的方法是：
❖ 将载玻片从二甲苯中吸出后，吸去多余的二甲苯，在标本上的二甲苯尚 未干透之前加一滴树胶，仔细覆盖上盖玻片，避免产生气泡，也不得拖 动盖玻片，以免将标本破坏。树胶量视盖玻片大小而定，勿使过多过少 。贴上标签，注明材料、染色法，待封藏剂凝固后便成为一张成功的石 蜡切片。
封片的注意事项
❖ 1．室温过高； ❖ 2．石蜡过软； ❖ 3．刀口上留有一层石蜡； ❖ 4．刀口钝。
❖解 决 办 法 ：
❖ 1．降低室温； ❖ 2．将蜡块投入凉水中稍浸增加硬度； ❖ 3．切片厚度，改用硬蜡包埋，用二甲苯拭去
刀口的石蜡； ❖ 4．磨刀或移动刀口。
问题五：切片纵裂
❖ 原 因：
❖ 1．刀有缺口； ❖ 2．石蜡块中含有颗粒、杂质； ❖ 3．刀口留有碎屑或细丝； ❖ 4．组织太硬。
度标志器，在操作的过程中还应注意自身 的安全。
石蜡块的固着与整修
❖ 在包埋以后，就可进行切片。包埋好的石蜡块装上切片机进 行切片前还须进行固着和整修。
❖ 固着：一般旋转式切片机上都附有可固着石蜡块的金属小盘， 这也可用同样大小的台木替代。用加热的蜡铲将包埋块粘贴 于固着物上，并使组织块朝外，便于以后迅速切出所需的片 子。整修：用加热的蜡铲或刀片将固着的包埋块四周修平，
❖解 决 办 法 ：
❖ 1．可移动刀口； ❖ 2．将颗粒拽去； ❖ 3．清洁刀口； ❖ 4．让包埋块在水中浸泡。
问题六：切片有横纹
0g）+100ml蒸馏水，溶解至溶液中无伊红沉淀，过滤即可使用。 无水乙醇：100ml； 试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、中性树胶。
固定液的配置
❖ 10%福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml蒸馏水。
❖
10%缓冲中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛溶液+900ml
蒸馏水+4g磷酸二氢钠磷酸氢二钠。
❖ 10%中性福尔马林（甲醛）溶液：100ml甲醛+900ml水+碳酸钙加至饱
和充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
切片中存在的问题及补救方法
❖ 石蜡切片是很不容易掌握的，有时很容易成 功，有时则由于某种因素而造成切片的质量 低劣，甚至完全失败。现将切片时经常遇到
的一些缺点、可能的原因以及补救办法。
问题一：石蜡带弯曲不直
❖ 原 因：
❖ 1．石蜡块上下两边不平行； ❖ 2．石蜡块的上下两边不和刀口平行； ❖ 3．刀口锋利不一，局部产生差异； ❖ 4．蜡块的一边较另一边为软，或两边的硬度
❖ 烘烤的温度及时间：使用恒温烤箱进行烤片， 温度一般控制在38℃左右，时间一般控制在 12h或者在恒温箱中过夜处理即可。
第七步：染色
❖ 在染色的操作中：最常用的为 HE染色法。 染色前必须准备好洁净的染色缸。并分 别放入二甲苯、各种浓度的酒精及染料 中进行染色。
❖ 不同组织的染色时间不同。
切片、展片及烤片 二甲苯（1）脱蜡 二甲苯（2）
问题二：切片分离、不能连成带状
❖ 原 因：
❖ 1．室温过低； ❖ 2．石蜡过硬； ❖ 3．材料边缘留蜡太少； ❖ 4．刀的角度不适合。
❖解 决 办 法 ：
❖ 1．在切片机上方开一电灯或提高室温； ❖ 2．在蜡块面加一层； ❖ 45℃的软蜡或用手指蜡摩擦块面； ❖ 3．重新包埋； ❖ 4．矫正刀的角度。
❖ 原 因： 问题八：每张切片厚薄不匀
根据切片的厚度不同调节厚度标志器，在操作的过程中还应注意自身的安全。 2．调节标本台，使两者平行； 配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。 4．用正丁醇、叔丁醇和二氧六环等进行脱水和透明； 在微动装置上调节切片要求的厚度，调节时应注意指针不可在两个刻度之间，否则容易损伤切片机，将刀台移至近标本台处，让刀口与组 织切面稍稍接触，这时就可以开始切片了。
带有组织的载玻片，由二甲苯中取出，使用 纱布或者滤纸迅速擦净多余的二甲苯，然后 在组织切片上滴上一滴中性树胶轻轻的使用 镊子夹取盖玻片盖在组织上面，轻轻压一下 盖玻片（目的防止气泡的产生）。
第十步：显微镜下观察HE染色的结果
❖ 在显微镜下观察到细胞核呈蓝紫色，细胞质 、胶原纤维、肌纤维呈粉红色。
❖ 注意：根据不同的染色要求，苏木精染液可 以稀释，加长染色时间，效果较好。伊红染 液也可以相应的稀释，防止粉红色过深，影 响细胞核与细胞质颜色的对比，尤其不利于 黑白片显微系统的拍照。
石蜡切片展片
❖ 一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左 右，有利于石蜡切片的展开。
❖ 待石蜡切片切片完全展开之后，即可用载玻 片进行捞片。
❖ 捞片手势切忌粗暴。一定要亲柔。防止两张 切片粘黏在一起。
石蜡切片的烘烤
❖ 目的：使石蜡切片与载玻片粘黏更加紧密， 防止在进行染色的过程中，组织片与载玻片 分离开来，造成掉片。
整个石蜡切片的完成过程
各种药品的配制及器材准备
❖染色液的配制
❖固定液的配制
❖梯度酒精的配制
❖采样器材的准备
染色液的配制
❖ Ehrlich氏苏木精 ❖ 苏木精：2g; ❖ 无水乙醇：100ml； ❖ 冰醋酸：10ml； ❖ 铝化钾或硫酸铝钾：10g； ❖ 蒸馏水：100ml； ❖ 甘油：100ml。
❖ 方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接 隹切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定 长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑 起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太 快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起 切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台 后移而切不到片子。切片完毕，应及时用氯仿将切片 机的有关部分擦净。
过滤。混合即可使用。
❖ 2.伊红水溶液的配制： ❖ 伊红Y（0.5-1.0g）+100ml蒸馏水，溶解至溶
液中无伊红沉淀，过滤即可使用。
0.5%~1%盐酸酒精溶液的配制
❖ ~1ml）+70%~90%酒精溶液100ml，混合均匀 即可。
❖ 注意事项：因为浓盐酸对皮肤具有强烈的腐 蚀作用及对呼吸道具有刺激作用，因此在配 置的过程中一定要注意自身的安全。
不一致； ❖ 5．材料未居蜡块正中央； ❖ 6．材料大而形不正。
❖解 决 办 法 ：
❖ 1．取下台木，将两边修干； ❖ 2．调节标本台，使两者平行； ❖ 3．移动刀片，改用新的刀口； ❖ 4．待蜡块冷却后再切，或重新包埋； ❖ 5．用刀片切去部分石蜡，使材料居中； ❖ 6．在大的一边切去少许石蜡。