现场紫外光谱及圆二色谱研究电化学还原反应诱导微过氧化物酶-11 构象的转变

现场紫外光谱及圆二色谱研究电化学还原反应诱导微过氧化物酶-11构象的转变姜秀娥,张哲泠,黄卫民,刘小强,汪尔康,董绍俊(中国科学院长春应用化学研究所,电分析化学国家重点试验室,长春130022)摘要　采用现场紫外光谱及圆二色谱电化学方法研究了微过氧化物酶211的电化学还原过程.同时应用奇异值分解最小二乘法和双对数法对所得光谱数据进行处理.研究发现,电化学还原过程诱导微过氧化物酶211的构象由无规卷曲向Α螺旋转变,这为进一步理解生物电子传递过程与生物分子构象转变机理提供了基础信息.关键词　微过氧化物酶211;光谱电化学;电子传递;构象变化中图分类号　O 641 文献标识码　A 文章编号　025120790(2005)022*******收稿日期:2004202227.基金项目:国家自然科学基金(批准号:20275036,20275037)资助.联系人简介:董绍俊(1932年出生),女,研究员,博士生导师,第三世界科学院院士,从事电分析化学、生物电化学和光谱电化学等方面的研究.E 2m ail :dongsj @ciac.jl .cn 电极 电解液界面可以看作是一种模拟的生物界面,研究血红素蛋白在电极表面的氧化还原过程可以加深对生物体系电子传递过程(ET )机理的认识.电化学方法可以用来研究溶液本体中的氧化还原过程[1～3],但是却不能提供蛋白质分子电子向电极表面转移的全面信息.如细胞色素c 的氧化还原过程中包含了电活性的生物分子在电子传递过程中构象的转变[4,5].因此有人认为生物电子传递过程与生物分子构象转变是同时发生的[6～10].为了验证这种假设,需要对生物电子传递过程的动力学及电　F i g .1　Sche ma ti c represen t a ti on of m i croperox i da ses struc -tureInset rep resents the generic a m ino acid bl ock unit .Solid line :backbone linkages .R :lateral group s pecific of the a m ino acid .Υ,Ω:torsi on angles around the N —C Αand C Α—C bonds ,res pectively .场诱导的血红素蛋白构象进行全面的分析[11].微过氧化物酶211是一种由细胞色素c 与酶作用得到的血红蛋白,它保留了良好的过氧化物酶的活性[12].其中的血红素通过十一肽链中2个半胱氨酸的二硫键与血红素上的乙烯基共价结合,与细胞色素类似,H is 218与血红素上的铁离子配位结合(图1).这使微过氧化物酶211上的血红素比完整的细胞色素c 上的血红素暴露程度更高.因此,微过氧化物酶211是一种研究血红蛋白电化学行为的良好模型分子[13].对其动力学参数的研究也是其电化学研究的课题之一[13,14].另一方面,蛋白质中血红素的非平面结构会影响其相关的化学及光学性质[15,16],因此,用光谱方法可检测蛋白质构象的转变.在长光程薄层光谱池(LO PTL C )中,当电解时间足够长时,扩散层的厚度近似等于薄层的厚度[17].因此,薄层光谱电化学可以用来研究氧化还原过程中蛋白质构象的转变[18].V o l .26高等学校化学学报　N o .2　2005年2月 CH E M I CAL JOU RNAL O F CH I N ESE UN I V ERS IT IES 321～325　本文采用现场光谱电化学方法,研究了微过氧化物酶211在玻碳电极表面的还原过程对其构象的影响.基于不同电位下的紫外光谱,用双对数法对其电化学反应参数进行了求算.1　实验部分1.1　试 剂由马心提取的微过氧化物酶211(M P 211)购自Sigm a 公司,将其溶于pH =7118,012mol L 磷酸缓冲溶液中待用.其中M P 211的浓度由395nm 处的摩尔吸收率ΕM P 211=1176×105mol-1・c m 2确定[19].缓冲溶液用分析纯试剂N a 2H PO 4・12H 2O ,N aH 2PO 4・2H 2O ,N aC l 和由M illi 2Q 系统获得的超纯水配制,在实验前测量溶液的pH 值.1.2　仪器及方法所有的光谱电化学实验均在由本实验室自制的长光程薄层池中完成,其示意图见图2.F i g.2　Sche ma ti c di a gram s of ho m e -made long opti ca l pa th th i n layer cell a .W ork electrode ;b .glass carbon electrode ;c.auxiliary electrode ;d .reference electrode ;e .thin layer s oluti on .CD 光谱由AV I V 62A D S 圆二色谱仪(AV I V ,U SA )采集,紫外2可见光谱由Cary 500紫外2可见2近红外光谱仪(V arian Co .,U SA )采集,电化学实验部分由CH I 630电化学工作站完成(CH I Co .U SA ).长光程薄层池光程为1c m ,薄层厚度012mm .将嵌入T efl on 板的一块玻碳(8mm ×8mm )作为工作电极,一条铂丝作为辅助电极,自制微型A g A gC l (饱和KC l )电极作为参比电极.实验中所出现的电位均为相对于该参比电极的电位.每次实验前,工作电极(GC )依次使用110,013和0105Λm 的Α2A l 2O 3抛光粉抛光,先分别用一次蒸馏水、二次蒸馏水和超纯水冲洗,再用超声波清洗后使用.实验中,入射光平行于工作电极入射,透过薄层被检测.因此,光谱中反映出来的均为溶液薄层中的变化情况.1.3　数据处理先采集总波长数同为m 的一组CD 光谱.再采用奇异值分解最小二乘法(SVDL S )[20,21]处理CD 光谱数据,以帮助分析M P 211在不同电位下的结构变化.根据SVDL S 的定义,这一组光谱为仅有1个变量而其它条件均相同的一系列光谱(在实验中,这个变量为电位).应用双对数分析方程[22]可以求出微过氧化物酶211在电化学还原过程中的相应参数.ln ln [(A in -A f ) (A i -A f )]=-ΑnF E i (R T )+ln [(∃t d )k 0(1-Η)]+ΑnF E 0 (R T )(1)式中,A i 是电位i 下反应物的吸光度,A f 和A in 是反应物最终及初始吸光度,Αn 是电子转移系数与电子转移数的乘积,∃t 是在每个电位下的电解时间,d 是薄层厚度,k 0是标准异相电子传递速率常数,Η是表面覆盖度,E i 与E 0是电位及表观电位.其它符号均为通常意义.具体推导过程可参考文献[22].根据式(1),E 0可以由A ′(E )～E 的微分曲线的峰位得到.Αn 可以由双对数曲线的斜率得到.k 0和Η则可由非线性回归程序进行计算机拟合计算得到.2　结果与讨论2.1　微过氧化物酶211的现场紫外2可见光谱电化学研究将212Λmol L M P 211溶液置于LO PTL C 中进行紫外2可见光谱电化学实验.紫外2可见光谱中223 高等学校化学学报V ol.26401nm 处的吸收峰对应于M P 211上氧化态血红素[Fe ( )血红素]的吸收(图3),随电位由0V 向-016V 负移,该吸收峰逐渐降低,同时红移到415nm ,对应于M P 211上还原态血红素[Fe ( )血红素]的吸收[23].M P 211的So ret 带主要是由卟啉Π2Π3跃迁的x ,y 极化引起发生迁移的电子处于中心配位铁离子的激发态.因此,红移可能是由于激发态和基态电子能级变化引起的[24].电化学还原引起卟啉环对称性发生变化,从而使血红素轴向配位状态发生变化,进而引起Soret 带吸收峰强度改变.将M P 211在401nm 处的吸收强度对电位作图可得到一S 形曲线.对其作微分曲线可得到一条有一个峰的曲线(图4曲线b ),与之对应的表观电位E 0′=-0136(±0101)V ,对其作双对数曲线可得到一条斜线(图4曲线a ).如双对数法所描述的那样,这对应于一个准可逆的电化学氧化还原过程[22].计算该斜线的斜率可以得到M P 211电化学氧化还原反应的电子传递系数,Αn =0125.通过E 0,Αn 及其它实验条件,利用非线性回归可以求得标准异相电子传递速率k 0=(8194±0121)×10-4c m s 以及电极表面覆盖度Η=01985±01012,计算过程中标准偏差为010603.F i g .3　UV -V is spectra of 212Λm ol L M P -11w ith di ffer -en t appl i ed poten ti a ls i n 012m ol L PBS soluti onw ith pH =7.18T i m e interval :6m in;A pp lied potentials V :a —o.0,-0105,-011,-0115,-012,-0125,-013,-0133,-0135,-0137,-0139,-0142,-0145,-015and -016. F i g .4　D ouble logar ith m i c plots of [1 A (E )]for M P -11a .Double l ogarithm ic curve (s olid line w ith s olid square dots );b .differential curve (s olid line w ith open square dots ).Experi m ental conditi ons are the sa m e as those in F ig .3.F i g .5　C D spectra of 212Λm ol L M P -11w ith di fferen tappl i ed poten ti a ls i n far -UV regi on i n 012m ol LPBS pH 7118i n a LOPT LC A pp lied potential V :a .0;b .-011;c .-012;d .-0125;e.-013;f .-0134;g .-0137;h .-0139;i .-0142;j .-0145;k .-015;l .-016.F i g .6　C D spectra of two confor ma ti on s of M P -11ob -t a i n ed by SV DL S ana lysis ,rando m co ils confor -ma ti on (da shed l i n e )and Α-hel i ca l (sol i d l i n e )Inset :distributi on curves of two confor m ati ons of M P 211w ith different app lied potentials ,random coils confor m a 2ti on (dash line )and Α2helical (s olid line ).2.2　微过氧化物酶211构象变化紫外区的CD 谱可以提供蛋白质二级结构的信息[25].M P 211随电位变化,从-016V 到0V 的现场CD 谱见图5.利用SVDL S 对这一组光谱进行处理,其中两种主要构象的谱图结果见图6.通过对它们在250～210nm 处的谱峰进行分析,可知二者分别对应于蛋白质无规卷曲(图6虚线)和Α螺旋323N o .2姜秀娥等:现场紫外光谱及圆二色谱研究电化学还原反应诱导微过氧化物酶211构象的转变 (图6实线)[26,27].图6中222nm 处负的吸收带可以归属为Α螺旋中不饱和氨基n 2Π3电子跃迁.两种构象在不同电位时的贡献不同(图6中插图),电位高于-0125V 时,无规卷曲是体系中唯一的构象.随着电位负移,无规卷曲所占的比例降低,同时Α螺旋所占比例升高.当电位低于-0145V 时,Α螺旋成为体系中的主要构象.这说明电化学还原过程诱导M P 211的构象由无规卷曲向Α螺旋转变.肽构象的变化分别由N —C Α和C Α—C 2个单键的旋转而形成的二面角Υ,Ω的扭曲决定(图1中插图).Υ二面角分别由主链骨架C (i -1)—N (i )—C ΗΑ和N (i )—C ΗΑ—C (i )决定的2个平面构成(斜体标指氨基酸序列).Ω二面角分别由主链骨架N (i )—C ΗΑ—C (i )和C ΗΑ—C (i )—N(i +1)决定的2个平面构成.M P 211的构象主要由Cys 14到H is 18这一段氨基酸所形成的二面角决定[28].通常,M P 211在水溶液中以头对尾的线性聚集体形式存在[28],即铁原子与V al 11的Α2N H 2或另一个M P 211L ys 13的Α2N H 2配位.在M P 211电化学还原过程中,电子传递引起卟啉环对称性发生变化,使血红素轴向配位状态改变,这必然导致了肽链主链骨架的运动,尤其引起H is 18和L ys 13运动,因为这2个氨基酸与铁原子配位,因此由Cys 14到H is 18这一段氨基酸所形成的二面角必然发生变化(图1中插图),所以M P 211电化学还原过程诱导其构象发生变化.2.3　微过氧化物酶211血红素微环境的变化Soret 带的CD 谱可以提供有关血红素周围微环境的信息[8].Soret 带的现场CD 谱图见图7.由图F i g .7　C D spectra of 212Λm ol L M P -11i n v isi ble regi on w ith di fferen t appl i ed poten ti a lsA pp lied potential V :a —l .0,-011,-012,-0125,-013,-0134,-0137,-0139,-0142,-0145,-015,-016.7可见,随着电位由0V 向-016V 逐渐降低,403nm 处正的谱带逐步增强,而417nm 处的负吸收带没有明显变化.这说明M P 211上的血红素结构发生了变化.在电化学还原过程诱导M P 211的构象由无规卷曲向Α螺旋转变的同时,诱导血红素结构更扭曲,从而导致403nm 处的CD 谱锋增强.在电化学还原过程中,血红素是反应的活性位点.但是在电子传递过程中血红素的位置并不是构象变化的唯一决定因素,它的作用必须与其周围的微环境相互依存[29].M P 211中不含有芳香性的氨基酸残基,因此Soret 带的光学活性不可能是由血红素和氨基酸残基之间的Π2Π3电子跃迁产生的[30].但是M P 211中含有硫醚键和与铁形成的配位键.这些化学键的作用使得血红素的平面结构扭曲,并诱导了M P 211在So ret 带产生光学活性.当M P 211处于电场之中时,电化学还原过程诱导M P 211构象由无规卷曲向Α螺旋转变.这种构象同样也能引起血红素结构的变化,从而导致Soret 带的光学性质改变.参　考　文　献[1]　Kas m iA .E .,W allace J .M .,Bow den E .F .et al ..J .Am .Che m .Soc .[J ],1998,120:225—226[2]　WAN G Q uan 2L in (王全林),YAN G Bao 2Jun (杨宝军),L U Gong 2Xuan (吕功煊).Che m .J .Chinese U niversities (高等学校化学学报)[J ],2003,24(9):1561—1566[3]　ZHAN G Yu 2Zhong (张玉中),ZHAO Hong (赵　红),YUAN Zhuo 2B in (袁倬斌).Che m .J .Chinese U niversities (高等学校化学学报)[J ],2002,23(3):391—393[4]　H ildebrandt P.,Stockburger M..B i oche m.[J ],1989,28:6710—6721[5]　ZH EN G Jun 2W ei (郑军伟),GU Ren 2A o (顾仁敖),LU 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the electroche m ical reducti on induced the confor m ati onal tran siti on of M P 211from randomco il to Α2helix and p rovided an i m po rtant info r m ati on for understanding bi ol ogical electron tran sfer m echa 2nis m coup led w ith confor m ati onal tran siti on s.Keywords M icroperox idase 211;Spectroelectroche m istry ;E lectron transfer ;Confor m ati on change(Ed .:S ,X )523N o .2姜秀娥等:现场紫外光谱及圆二色谱研究电化学还原反应诱导微过氧化物酶211构象的转变 。