倒置双光子显微镜的使用与维护

倒置双光子显微镜的使用与维护
尹伟;刘双双;王贝贝;孙启才
【摘要】Two photon excited fluorescence (TPEF) microscopy is a nonlinear optical microscopy technique,which combines laser scanning confocal microscopy and two-photon excitation technique.The main advantages of TPEF include high temporal and spatial resolutions,high signal-to-noise ratio and inherent three-dimensional sectioning.To provide good references for the users and managers of TPEF microscopy,the Olympus inverted two-photon microscopy (IX81-FV1000MPE)
configuration,software and hardware composition,technical parameters,sample preparation requirements,common operating procedures,as well as the routine maintenance and management are introduced in this article.This study can be very useful for the improvement of the equipment efficiency for both teaching and scientific research in universities.%双光子激发荧光显微是一种非线性光学显微技术,它结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术,具有高时空分辨率、高信噪比和固有的三维层析分辨能力等优点.介绍了双光子显微镜的软硬件组成和技术参数,样品制备方法,双光子图像采集的常用操作规程,日常维护和仪器管理等方面.旨在为双光子仪器的使用者与管理者提供参考,使之更好地服务于教学与科研.
【期刊名称】《激光生物学报》
【年(卷),期】2016(025)006
【总页数】6页(P572-576,封3)
【关键词】双光子;荧光显微镜;使用与维护
【作者】尹伟;刘双双;王贝贝;孙启才
【作者单位】浙江大学医学院公共技术平台,浙江杭州310058;浙江大学医学院公
共技术平台,浙江杭州310058;浙江大学医学院公共技术平台,浙江杭州310058;浙
江医院七病区骨科,浙江杭州310007
【正文语种】中文
【中图分类】Q-334
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是在荧光显微镜基础上，以激光作为光源，采用共
轭聚焦技术与光扫描技术，通过针孔排除非焦平面信息，获取细胞的“光切片”图像，实现多重荧光同时观察从而形成清晰的三维图像。

但受其光毒害、光降解、光漂白等原因限制，无法进行深度活体扫描[1]。

1990年Denk[2]等将双光子激发现象应用到LSCM中，并制造出第一台双光子激光共聚焦显微镜(two-photon laser scanning microscope,TPLSM)。

双光子显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。

在LSCM基础上，双光子技术以红外飞秒激光作为光源，使用高能量锁模脉冲激光器，发出具有高峰值能量和低平均能量的激光，脉冲宽度仅100 fs，可深入组织内部
非线性地激发荧光[3]。

双光子成像能减小激光对生物体的损伤，光漂白小，扫描
速度快，具有高空间分辨率，适合长时间观察。

因此，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活组织[4]。

浙江大学医学院公共技术平台于2011年9月配置一台倒置双光子显微镜(IX81-
FV1000MPE)，具备单光子、双光子、活细胞工作站、同步双扫四大重要技术。

仪器使用率高，满足了学院内外众多PI组在基础研究方面的需求。

本文以倒置双
光子显微镜为例仅对其双光子部分软硬件组成、技术参数、样品制备方法、仪器操作使用及维护做一系统介绍。

配备双光子脉冲飞秒激光器Mai Tai® Deep See，型号为光谱物理Mai Tai HP DS。

激光器的平均功率超过 2.4 W，可用的调谐范围为 350 nm (690-1 040 nm)。

Mai Tai Deep See采用超稳定再生锁模技术，实时监控技术可实现卓越的光束指向稳定性和最小的平均功率波动并消除波长偏移，从而提升系统可靠性。

双光子显微镜扫描单元，通过分光装置，含红外激光、可见激光扫描单元内整合光路，XY扫描振镜等，NDD检测器等，内置红外阻挡滤色片可用于检测多光子荧光。

双光子专用物镜，25X水浸物镜，数值孔径为1.05，工作距离为2 mm，荧光视
场数27.5，配有成像深度校正环(可校正0-0.23 mm)，适用于小鼠、果蝇、斑马
鱼等活体动物的荧光观察。

细胞中存在很多囊泡、脂质体等等折射率不同的亚细胞结构，这些结构在显微成像中充当一个个特殊透镜，IR激光经过这些透镜之后会
发生很大的球差，IR激光不能够完美汇聚到焦点，激发效率自然下降。

而这个专
用镜头通过校正环矫正不同深度球差，IR激光能量更集中，更多荧光素被激发！
还有工作距离为4 mm的双光子专用SCALEVIEW镜头(型号XLPLN25XSVMP2)，数值孔径为1.0，平台正在计划采购中。

系统软件为FV10-ASW-V3.1，包括扫描XYZTλ控制、图像分析、3D重建、多点扫描、大视野拼图等，基本模块同单光子部分[5]，通过软件控制激光光源、扫描
系统和光路切换。

Maitai飞秒激光器有单独的控制软件，通过COM9入口，可以控制双光子的激光开启关闭、双光子波长选择及观察锁膜状态是否稳定。

以活体小鼠为例，选取合适年龄的BALB/c小鼠( 18-20 g) ，先将脑表面毛发剃去，然后小心剪掉头皮，用一次性棉签(蘸有双氧水)擦拭脑表面，目的是除去表面筋膜，用棉签(人工脑脊液浸润)擦拭头骨。

腹腔注射3%水合氯醛麻醉。

麻醉小鼠后用脑
立体定位仪固定，用牙科电钻打磨6 mm × 6 mm 大小的圆孔颅骨[6]，颅骨边缘呈半透明状态后，用镊子轻按颅骨，用眼科弯镊小心夹取颅骨边缘将其轻轻掀掉，显微操作仪注射染料，1.5% 的琼脂糖将开窗区密封和固定最后将脑固定圈固定到长柄铁块上，准备成像。

双色双光子激光扫描显微技术可用来研究生物组织内两种不同蛋白质的表达、定位和示踪．由于大多数双光子显微镜一次只能提供一种波长的激发光，双色同时成像较难实现且易造成串色。

mAmetrine和mKate2作为新发现的荧光蛋白对可以用于双光子双色同时成像，这得益于它们各自的优势：mAmetrine的斯托克斯位移和mKate2的高亮度．在765 nm的波长激发时，二者的双光子吸收效率都很高。

杨松等[7]报告mAmetrine和mKate2能很好地用于双色双光子活细胞成像。

根
据使用经验，我们列举常用的双光子染料及它的激发光、发射光如表1所示。

双光子显微镜具有高信噪比、高穿透性、低漂白性等特性，越来越多的国内外研究者利用此技术发表高水平科研文章。

倒置双光子显微镜与正置双光子显微镜共用一台MAITAI飞秒激光器，是奥林巴斯公司与浙江大学医学院合作共建的国内第一
家双光子share系统平台。

二者光路经严密设计，从正置开始，至倒置结束，完
美整合在一起，仅供安装使用的大型气垫式防震平台长度就为2.4 m，宽度为2.3 m，防震台由两块台子拼接而成，重约1.26 t。

在激光共享系统中，安装了光路分配装置Beam splitter(0%，50%，100%)。

当Beam splitter将光路分到正置双
光子时，可在正置双光子显微镜实现100%双光子功能，而正置双光子更适合检测组织中深层结构或者活体内部结构，目前已经能实现对活体动物的脑内血流、钙信号、果蝇神经系统、小鼠脊髓等进行探测[8-10]，探测深度达500 μm以上，经过BABB透明化的样本能达到1.5 mm以上。

新型透明剂scale的发现，使双光子的成像深度达到4 mm以上[11]。

当Beam splitter将光路分到50%时，可以实现
在正置双光子显微镜和倒置双光子显微镜同时用双光子观察。

当Beam splitter将
光路分到倒置双光子时，可在倒置双光子显微镜实现100%双光子功能，长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，倒置双光子更适合观察活细胞的延时序列成像。

打开双光子控制器，开启电脑。

将双光子光路分配装置Beam splitter拉到最外面，将光路切换至倒置双光子显微镜。

冷启动即冷水机和电源都处在关闭状态的情况下开激光器。

检查冷水机的水量是否足够。

开启冷水机，并检查其设定温度是否为21 ℃。

大约15 min后系统温度达
到平衡。

打开飞秒激光器电源开关，打开钥匙开关。

运行MaiTai软件。

点击On
按钮，按住约5 s开启激光器。

等待电流上升，直到显示功率达到预设功率。

若需要，打开Shutter，开始使用激光器。

热启动即冷水机和电源都处在开机状态的情况下开激光器。

开飞秒激光器钥匙，开电脑，运行MaiTai软件。

点击On按钮，按住约5 s开启激光器。

等待电流上升，直到显示功率达到预设功率，打开Shutter，开始使用激光器。

在MaiTai软件界面输入拟使用的激发光波长，如860 nm，FV10-ASW 3.1操作软件的laser界面输入同样的激发光匹配。

要注意光路的改变，设置Excitation DM为RDM690，ZDC拉杆处于“out”位置，否则双光子不能出光。

将dye窗口中单光子的染料全部清除，光路切换到two photo 模式下选择合适的染料，点击apply应用，光路切换到双光子模式。

在图像采集控制面板上，标题 Image Acquisition Control中勾掉共聚焦所用的通道，勾上另加上的双光子扫描通道。

按focusX2或 focusX4快速预览，适当调整Laser透过率、光电倍增管电压、offset等参数至最佳拍摄状态，点击XY扫描，双光子采集图像无需调节数值孔径。

为得到信噪比较高的图像，按住ctrl+H快捷键，查看是否过曝，当出现“一点红、一点蓝”时，图像的清晰度和对比度较好。

图 1中比较了一种材料利用单光子和
双光子显微镜拍摄的图片。

图1a是利用激光共聚焦显微镜拍摄的图片，激发波长
为405 nm；图1b是同一视野在双光子显微镜下拍摄的图片，双光子激发波长为980 nm，图1c为明场图片，图1d为merge图。

由图所示，双光子在成像深度、成像细节、对比度和分辨率各方面较单光子有明显提高!
双光子成像极强的穿透能力使得研究者能够轻松地获得活体深层组织中特定细胞的三维形态信息，并在此基础上进行诸如数量、尺度、体积、形状、突起形态、荧光强度等定量分析。

尤其双光子成像这样具有很深的穿透力的成像方式，Z轴扫描就是优势之一。

双光子三维成像的方法：首先是确定样本的上下界面。

在图像采集设置面板，标题Acquisition Setting中Microscope板块中设置，可通过黄色的箭头或者外接调
焦设置来上下调节焦距，当调节到上界时点击Start下的Set键，反方向调到下界时点击End下的Set键，其次确定扫面的层数，两种方式①勾上StepSize，即每隔n扫一层。

②勾上Slice，即总共扫面n层。

再次调节三维的图像质量，在图像采集控制面板，点击标题 Image Acquisition Control的下方的Depth键，这时
候Z会亮起来，同时该面板右侧下方 Bright Z 键会亮起来。

点击Bright Z键，会跳出Correct Brightness For Depth 窗口，自上界往下调节焦距，每隔一段距离，调整laser透过率和光电倍增管电压值，然后点击Add键，将该点的参数写入，
随着深度的增加适时调整参数，进行三维扫描时，不同深度就按照之前存储设置的参数进行扫描，可以保证即使在很深的位置信号也不会太弱和样本量度的一致性。

点击XYZ进行扫描，可选择该面板中下方的在Filter Mode的Kalman 进行滤波，扫描结束。

图2为使用万能平场半复消色差水浸物镜10X水镜(数值孔径NA=0.3)，分别利用不同的激发波长(a激发波长=860 nm，b激发波长=910 nm)，激发光
透过率均为12%，对果蝇样本进行Z stack 成像，间隔步径设置为5 μm，共拍摄44张slice，得到的三维双光子成像叠加图。

充分说明合适的双光子激发波长才能让活体样本得到有效激发，摸索出样本的激发波长是非常重要和关键的一步！
同共聚焦显微镜的“Time-Series”功能，设置所需的时间间隔interval及所需图像数量number，点击“XYT”功能键，进行时间序列扫描。

一般进行活体双光子实验时，需要先设置好三维扫描，即XYZ，然后在图像采集控制面板，点击标题Image Acquisition Control的下方的Time键，T亮起来后，进行XYZT四维时
间序列成像。

对于日常使用，软件退出后，MaiTai软件界面shutter关掉，点击OFF按钮，关闭飞秒激光器钥匙，关闭扫描单元控制器和显微镜控制器，关闭电脑。

保持飞秒激光器电源和冷水机在运行状态24 h 365 d。

除非停电、换水或其他极
端情况(如夏天室内无空调和除湿机，高温高湿)，可先关闭激光器电源再关闭冷水机。

三个月需更换一次蒸馏水，换水时检查滤芯是否变黑，若变黑要一并更换。

从MaiTai GUI软件Info界面可以查看激光器湿度，湿度超过10%就会有报警，
湿度过大会影响部分波段的锁模。

一般除湿Filter一年更换一次，实际更换频率受环境湿度影响较大。

若使用油镜，需用擦镜纸蘸取无水乙醇进行擦拭，无水酒精可以盛放在能按压的玻璃瓶中，使用时轻轻一按，就可按压出来酒精；若使用双光子专用25倍水镜或其它水镜，需要将水镜浸泡在双蒸水中2 h以上，然后用擦镜纸擦拭，直至物镜干净。

经常擦拭仪器，注意防尘，整个仪器外面套防尘罩保持清洁。

对于物镜、目镜等易污染的光学部件应经常用酒精擦拭。

取下物镜放置在镜头盒中后分类放到防潮柜中。

室内安装遮光窗帘，双光子成像时必须将电脑显示屏切换到“dark”模式，保证
双光子成像不受外界光源和电脑屏幕光亮干扰。

实验室内要安装空调、除湿机、防潮柜，由于双光子冷凝器需要，最好保证环境温度始终保持在22 ℃左右，湿度40%-60%，防潮柜温度设置在22 ℃为宜。

如遇停电，需要先关闭飞秒激光器钥匙，再关激光器电源，最后关闭冷水机开关。

双光子显微镜有几点独特优势：(1)采用长波长激发，长波长的光比短波长光受散射影响较小，易穿透样本，穿透深度是共聚焦的2到3倍。

(2)双光子成像不需要针孔，焦平面外的荧光分子不被激发，成像亮度和信噪比高，适合活体微弱信号的观察。

(3)长波长的近红外光对细胞毒性小，适合活细胞延时动态成像。

(4)只有焦平面上才有光漂白和光毒性[9]。

基于这些优势，双光子显微镜已成为生命科学各领域重要的研究工具，该技术为观察活细胞或活体组织中的生命现象和在体成像、脑功能研究带来了革命性的飞跃。

一方面利用双光子能在细胞甚至是亚细胞水平对活体中的神经细胞结构形态、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的成像监测，另外还能进行光激活、光转染和光损伤等光学操纵技术。

但是，在提高样本生存能力、快速获取数据及提高灵敏度等方面还需要进一步突破。

随着生命科学、材料、光学各交叉学科的不断发展，势必会有更广阔的应用前景，此类设备非常昂贵，掌握其常规使用方法，懂得双光子维护事项显得尤为重要。

浙江大学医学院公共技术平台的倒置双光子显微镜实行开放共享，近五年来使用率高，共享效果好，为多个国家级、省部级基金项目提供有力支撑。