脂肪酸的测定

2.2.1.脂肪酸的变化分析
试剂：0.3％甲醛、6 mol/l HCl-CH3OH溶液、三氯甲烷
方法：GC—MS联用分析测定，步骤如下：
（1）菌体的培养与收集
Ⅰ组实验菌株用YPD液体培养基培养，在培养基中添加一定量的抗冻保护剂，接种后放入30℃、150 r／min的摇床中培养24 h。

细胞振荡培养至生长对数中期，移取适量细胞悬浮液至-30℃冰箱冷冻7d，取出30℃下解冻5-10min，用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。

空白样用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心5 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻24h，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。

Ⅱ组实验菌株用于面包冷冻面团的制备，添加抗冻保护剂，于-20℃冷冻30d 后取出解冻，取20g解冻后的面团，分散于180ml无菌水中，震荡30min，静置15min，离心并取上清液。

用0.3％甲醛灭活后，4000 r／min下离心15 min，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，离心收集细胞，-18℃冷冻，冷冻真空干燥制得干细胞后备用。

空白样则不添加抗冻保护剂，其余处理方法一样。

（2）脂肪酸的甲基化与提取
取50 mg冻干细胞加入6 mol/l HCl-CH3OH溶液2 ml，置100℃的条件下盐酸水解甲基化3 h，溶液呈现棕褐色(或黑褐色)，取出，置室温下冷却。

加入正己烷1.5ml振荡。

经4000 r／min离心10min，收集上清液再加入正己烷1.5ml 抽提一次，合并两次上清液，加入蒸馏水3ml，经4000 r／min离心10 min，收
吹干，加入10μl三氯甲烷制备脂肪酸酯化液。

集上清液于离心管中。

用流动N
2
（3）薄层层析
用玻璃毛细管取脂肪酸酯化液点在硅胶G-TLC薄层板上，以正己烷+无水乙醚(1+1)为展层系统，待层析液至硅胶板上缘后立即取出薄层板，风干。

在UV254灯下检查制备的脂肪酸纯度与相对浓度。

将脂肪酸甲酯带做好标记，轻轻刮下，
吹干后加入0.5ml无水甲醇振荡溶解，然后进行GC—用二乙醚抽提两次，经N
2
MS分析。

（4）GC—MS操作条件程序升温：初温130℃，保持1 min；终温280℃，维持min，升温速度7．6℃／min。

检测器温度250℃；载气(He)流速30 ml／min；分流比50：1；流速(He)49．9 ml／min；进样量1μl。

（2）中质谱条件用电子轰击源(Ⅱ)分析，电子能量为70eV，离子源温度230℃，接口温度280℃，质量扫描范围35—500。